Eks Utero Kultur av museembryoer fra pregastrkulering til avansert organogenese
Summary
En forbedret plattform for hel-embryo kultur tillater kontinuerlig og robust ex utero utvikling av postimplantasjon mus embryoer i opptil seks dager, fra pregastrulation stadier til avansert organogenese. I denne protokollen beskriver vi standardprosedyren for vellykket embryokultur ved hjelp av statiske plater og roterende flaskesystemer.
Abstract
Postimplantasjon pattedyr embryokultursmetoder har generelt vært ineffektive og begrenset til korte perioder etter disseksjon ut av livmoren. Plattformer har nylig blitt utviklet for svært robust og langvarig ex utero kultur av museembryoer fra eggsylindrede stadier til avansert organogenese. Disse plattformene muliggjør hensiktsmessig og trofast utvikling av pregastrulaterende embryoer (E5.5) til bakre lemdannelsesstadium (E11). Sen gastrulatering embryoer (E7.5) dyrkes i roterende flasker i disse innstillingene, mens utvidet kultur fra pregastrulation stadier (E5.5 eller E6.5) krever en kombinasjon av statiske og roterende flaske kulturer. I tillegg er sensitiv regulering av O2 – og CO2-konsentrasjon , gasstrykk, glukosenivåer og bruk av et spesifikt ex utero-kulturmedium avgjørende for riktig embryoutvikling. Her er en detaljert trinnvis protokoll for utvidet ex utero mus embryokultur gitt. Evnen til å dyrke normale museembryoer ex utero fra gastrulation til organogenese representerer et verdifullt verktøy for å karakterisere effekten av ulike eksperimentelle perturbasjoner under embryonal utvikling.
Introduction
Intrauterin utvikling av pattedyret embryo har begrenset studiet av de tidlige stadiene av postimplantasjon utvikling1,2. Utilgjengeligheten av det utviklende embryoet hemmer forståelsen av viktige utviklingsprosesser som oppstår etter embryoimplantatene i livmoren, for eksempel etableringen av dyrekroppsplanen, spesifikasjon av bakterielagene eller dannelsen av vev og organer. Videre gjør den svært lille størrelsen på det tidlige postimplanterte embryoet det vanskelig å observere ved intravital avbildning i utero før E103. Manglende evne til å observere og manipulere levende embryoer på disse stadiene har begrenset studiet av tidlig embryogenese etterimplantasjon til øyeblikksbilder under utvikling.
Protokoller for in vitro kultur av preimplantasjon pattedyr embryoer er veletablerte, pålitelige og regelmessig utnyttet4. Likevel hadde forsøk på å etablere ex utero kultursystemer som var i stand til å støtte riktig pattedyr postimplantasjon embryovekst begrenset suksess5. En rekke kulturteknikker har blitt foreslått i over et århundre, hovedsakelig ved å dyrke embryoene i konvensjonelle statiske plater6,7,8 eller roterende flasker (rullekulturer)5,9,10. Disse plattformene viste seg å være nyttige for å utvide kunnskapen om pattedyrutvikling etter implantasjon11,12, til tross for at de var svært ineffektive for normal embryooverlevelse og begrenset til korte perioder. Embryoene begynte å vise utviklingshemming og morfologiske anomalier så tidlig som 24-48 timer etter kulturinitiering.
Denne studien gir en detaljert beskrivelse for å sette opp ex utero embryokultursystemet som tillater kontinuerlig utvikling fra pregastrulation til avanserte organogenese stadier over opptil seks dager etterimplantasjon utvikling13. Dette dokumentet beskriver den forbedrede rullekulturprotokollen som støtter veksten av E7,5 embryoer (nevral plate og hodefoldtrinn) til bakre lemdannelsesstadium (~E11) og den utvidede kulturen fra E5.5/E6.5 ved å kombinere kultur på statiske plater og rullekulturplattformer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kulturprotokollen som presenteres her kan opprettholde riktig og kontinuerlig museembryoutvikling ex utero i opptil seks dager, fra E5,5 til E11. Tidligere kunne embryoer på disse utviklingsstadiene utvikle seg normalt i kulturen bare i korte perioder (opptil 48 timer)15. Koblingen av gassreguleringsmodulen til rullekulturinkubatoren for presis kontroll av oksygenkonsentrasjon og hyperbar gasstrykk er avgjørende for riktig museembryokultur som er beskrevet her. Økning av gasstrykket ti…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble finansiert av Pascal og Ilana Mantoux; Det europeiske forskningsrådet (ERC-CoG-2016 726497-Cellnaivety); Flyvertinne medisinsk forskningsråd (FAMRI); Israel Cancer Research Fund (ICRF) professorat, BSF, Helen og Martin Kimmel Institute for Stem Cell Research, Helen og Martin Kimmel Award for Innovative Investigation; Israel Science Foundation (ISF), Minerva, Sherman Institute for Medical Chemistry, Nella og Leon Benoziyo Center for Neurological Diseases, David og Fela Shapell Family Center for Genetic Disorders Research, Kekst Family Institute for Medical Genetics, Dr. Beth Rom-Rymer Stem Cell Research Fund, Edmond de Rothschild Foundations, Zantker Charitable Foundation, Eiendom Zvia Zeroni.
Materials
| 0.22 µm pore size filter (250 mL) | JetBiofil | FCA-206-250 | |
| 0.22 µm pore size syringe PVDF filter | Millipore | SLGV033RS | |
| 8-well µ-plates glass bottom/ibiTreat | iBidi | 80827/80826 | |
| Bottle with adaptor cap for gas inlet | Arad Technologies | ||
| Bungs (Hole) | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 06 | Used to seal the bottles to the drum |
| Bungs (Solid) | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 07 | Used to seal the rotating drum |
| Culture bottles | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 03/BTC 04 | Either Glass Bottles (Small) BTC 03 or Glass Bottles (Large) BTC 04 |
| D(+)-glucose Monohydrate | J.T. Baker | ||
| Diamond knife | Fine Science Tools | 10100-30/45 | |
| Digital Pressure Gauge | Shanghai Benxu Electronics Technology co. Ltd | BX-DPG80 | |
| DMEM | GIBCO | 11880 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Biological industries | 02-020-1A | |
| Fetal Bovine Serum | Biological industries | 04-013-1A | |
| Gas regulation module | Arad Technologies | HannaLab1 | |
| Glutamax | GIBCO | 35050061 | glutamine |
| Graefe forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| HEPES | GIBCO | 15630056 | |
| Microsurgical forceps (Dumont #5, #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Pasteur pipettes (glass) | Hilgenberg | 3150102 | |
| Pasteur pipettes (plastic) | Alexred | SO P12201 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biological industries | 03-031-1B | |
| Petri Dishes (60 mm and 100 mm) | Falcon | 351007/351029 | |
| Precision incubator system | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC01 | BTC01 model with gas bubbler kit |
| Pro-coagulant sterile test tubes (5 mL) | Greiner Bio-One | #456005 | |
| Rat whole embryo culture serum | ENVIGO Bioproducts | B-4520 | |
| Stereoscopic microscope equipped with heating plate | Nikon | SMZ18 | |
| Sterile syringes (5, 10 ml) for sera filtration | Pic Solution | ||
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14094-11 |
Riferimenti
- New, D. A. Whole-embryo culture and the study of mammalian embryos during organogenesis. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 53 (1), 81-122 (1978).
- Tam, P. P., Behringer, R. R. Mouse gastrulation: the formation of a mammalian body plan. Mechanisms of Development. 68 (1-2), 3-25 (1997).
- Huang, Q., et al. Intravital imaging of mouse embryos. Science. 368 (6487), 181-186 (2020).
- White, M. D., et al. Long-lived binding of Sox2 to DNA predicts cell fate in the four-cell mouse embryo. Cell. 165 (1), 75-87 (2016).
- Tam, P. P. Postimplantation mouse development: whole embryo culture and micro-manipulation. International Journal of Developmental Biology. 42 (7), 895-902 (1998).
- Nicholas, J. S., Rudnick, D. The development of rat embryos in tissue culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 20 (12), 656-658 (1934).
- New, D. A., Stein, K. F. Cultivation of mouse embryos in vitro. Nature. 199, 297-299 (1963).
- Rivera-Pérez, J. A., Jones, V., Tam, P. P. L. Culture of whole mouse embryos at early postimplantation to organogenesis stages: developmental staging and methods. Methods in Enzymology. 476, 185-203 (2010).
- New, D. A. T., Coppola, P. T., Terry, S. Culture of explanted rat embryos in rotating tubes. Journal of Reproduction and Fertility. 35 (1), 135-138 (1973).
- Cockroft, D. L. A comparative and historical review of culture methods for vertebrates. International Journal of Developmental Biology. 41 (12), 127-137 (1997).
- Parameswaran, M., Tam, P. P. L. Regionalisation of cell fate and morphogenetic movement of the mesoderm during mouse gastrulation. Developmental Genetics. 17 (1), 16-28 (1995).
- Beddington, R. S. Induction of a second neural axis by the mouse node. Development. 120 (3), 613-620 (1994).
- Aguilera-Castrejon, A., et al. Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis. Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).
- Takahashi, M., Makino, S., Kikkawa, T., Osumi, N. Preparation of rat serum suitable for mammalian whole embryo culture. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51969 (2014).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. Isolation, culture and manipulation of postimplantation embryos. Manipulating the Mouse Embryo: a Laboratory Manual. , 149-193 (2014).
- Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation. Development, Growth and Differentiation. 50 (6), 485-497 (2008).
- Mathieu, J., Ruohola-Baker, H. Metabolic remodeling during the loss and acquisition of pluripotency. Development. 144 (4), 541-551 (2017).
- Sturm, K., Tam, P. P. L. Isolation and culture of whole postimplantation embryos and germ layer derivatives. Methods in Enzymology. 225, 164-190 (1993).
