Ex Utero Culture d’embryons de souris de la prégestrulation à l’organogenèse avancée
Summary
Une plate-forme améliorée pour la culture d’embryons entiers permet un développement ex utero continu et robuste d’embryons de souris post-implantation jusqu’à six jours, des stades de prégestulation jusqu’à l’organogenèse avancée. Dans ce protocole, nous détaillons la procédure standard pour une culture d’embryon réussie en utilisant des plaques statiques et des systèmes de bouteilles rotatives.
Abstract
Les méthodes de culture d’embryons de mammifères postimplantatoires ont été généralement inefficaces et limitées à de brèves périodes après la dissection hors de l’utérus. Des plates-formes ont récemment été développées pour la culture ex utero très robuste et prolongée d’embryons de souris à partir des stades de cylindre d’œuf jusqu’à l’organogenèse avancée. Ces plates-formes permettent un développement approprié et fidèle des embryons prégaztrulés (E5.5) jusqu’au stade de formation des membres postérieurs (E11). Les embryons à gastrulation tardive (E7.5) sont cultivés dans des bouteilles tournantes dans ces contextes, tandis que la culture prolongée à partir des stades de prégestrulation (E5.5 ou E6.5) nécessite une combinaison de cultures en bouteille statiques et rotatives. En outre, la régulation sensible de la concentration d’O2 et de CO2, de la pression des gaz, des niveaux de glucose et de l’utilisation d’un milieu de culture ex utero spécifique est essentielle au bon développement de l’embryon. Ici, un protocole détaillé étape par étape pour la culture étendue d’embryons de souris ex utero est fourni. La capacité de cultiver des embryons de souris normaux ex utero de la gastrulation à l’organogenèse représente un outil précieux pour caractériser l’effet de différentes perturbations expérimentales au cours du développement embryonnaire.
Introduction
Le développement intra-utérin de l’embryon de mammifère a limité l’étude des premiers stades du développement postimplantatoire1,2. L’inaccessibilité de l’embryon en développement entrave la compréhension des processus de développement clés qui se produisent après l’implantation de l’embryon dans l’utérus, tels que l’établissement du plan corporel de l’animal, la spécification des couches germinales ou la formation de tissus et d’organes. De plus, la très petite taille de l’embryon postimplanté précoce le rend difficile à observer par imagerie intravitale in utero avant E103. L’incapacité d’observer et de manipuler des embryons vivants à ces stades a limité l’étude de l’embryogenèse post-implantaire précoce à des instantanés au cours du développement.
Les protocoles de culture in vitro d’embryons de mammifères préimplantatoires sont bien établis, fiables et régulièrement utilisés4. Néanmoins, les tentatives visant à établir des systèmes de culture ex utero capables de soutenir la croissance appropriée des embryons de mammifères après la mise en œuvre ont eu un succès limité5. Diverses techniques de culture sont proposées depuis plus d’un siècle, principalement en cultivant les embryons dans des plaques statiques conventionnelles6,7,8 ou des bouteilles rotatives (cultures à rouleaux)5,9,10. Ces plates-formes se sont avérées utiles pour élargir les connaissances sur le développement des mammifères après l’implantation11,12, bien qu’elles soient très inefficaces pour la survie normale des embryons et limitées à de courtes périodes. Les embryons ont commencé à présenter un retard de développement et des anomalies morphologiques dès 24 à 48 heures après le début de la culture.
Cette étude fournit une description détaillée de la mise en place du système de culture embryonnaire ex utero qui permet un développement continu de la prégestrulation aux stades avancés de l’organogenèse sur une période allant jusqu’à six jours de développement post-implantation13. Cet article décrit le protocole de culture à rouleaux amélioré qui soutient la croissance des embryons E7.5 (plaque neurale et étage de pliage de la tête) jusqu’au stade de formation des membres postérieurs (~ E11) et la culture étendue de E5.5 / E6.5 en combinant la culture sur des plaques statiques et des plates-formes de culture à rouleaux.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole de culture présenté ici peut soutenir le développement approprié et continu de l’embryon de souris ex utero jusqu’à six jours, de E5.5 à E11. Auparavant, les embryons à ces stades de développement ne pouvaient se développer normalement en culture que pendant de courtes périodes (jusqu’à 48 h)15. Le couplage du module de régulation des gaz à l’incubateur de culture à rouleaux pour un contrôle précis de la concentration en oxygène et de la pression hype…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par Pascal et Ilana Mantoux; Conseil européen de la recherche (ERC-CoG-2016 726497-Cellnaivety); Conseil de recherches médicales des agents de bord (FAMRI); Chaire du Fonds israélien de recherche sur le cancer (ICRF), BSF, Helen and Martin Kimmel Institute for Stem Cell Research, Helen and Martin Kimmel Award for Innovative Investigation; Israel Science Foundation (ISF), Minerva, le Sherman Institute for Medicinal Chemistry, Nella and Leon Benoziyo Center for Neurological Diseases, David and Fela Shapell Family Center for Genetic Disorders Research, Kekst Family Institute for Medical Genetics, Dr. Beth Rom-Rymer Stem Cell Research Fund, Edmond de Rothschild Foundations, Zantker Charitable Foundation, Estate of Zvia Zeroni.
Materials
| 0.22 µm pore size filter (250 mL) | JetBiofil | FCA-206-250 | |
| 0.22 µm pore size syringe PVDF filter | Millipore | SLGV033RS | |
| 8-well µ-plates glass bottom/ibiTreat | iBidi | 80827/80826 | |
| Bottle with adaptor cap for gas inlet | Arad Technologies | ||
| Bungs (Hole) | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 06 | Used to seal the bottles to the drum |
| Bungs (Solid) | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 07 | Used to seal the rotating drum |
| Culture bottles | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 03/BTC 04 | Either Glass Bottles (Small) BTC 03 or Glass Bottles (Large) BTC 04 |
| D(+)-glucose Monohydrate | J.T. Baker | ||
| Diamond knife | Fine Science Tools | 10100-30/45 | |
| Digital Pressure Gauge | Shanghai Benxu Electronics Technology co. Ltd | BX-DPG80 | |
| DMEM | GIBCO | 11880 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Biological industries | 02-020-1A | |
| Fetal Bovine Serum | Biological industries | 04-013-1A | |
| Gas regulation module | Arad Technologies | HannaLab1 | |
| Glutamax | GIBCO | 35050061 | glutamine |
| Graefe forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| HEPES | GIBCO | 15630056 | |
| Microsurgical forceps (Dumont #5, #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Pasteur pipettes (glass) | Hilgenberg | 3150102 | |
| Pasteur pipettes (plastic) | Alexred | SO P12201 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biological industries | 03-031-1B | |
| Petri Dishes (60 mm and 100 mm) | Falcon | 351007/351029 | |
| Precision incubator system | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC01 | BTC01 model with gas bubbler kit |
| Pro-coagulant sterile test tubes (5 mL) | Greiner Bio-One | #456005 | |
| Rat whole embryo culture serum | ENVIGO Bioproducts | B-4520 | |
| Stereoscopic microscope equipped with heating plate | Nikon | SMZ18 | |
| Sterile syringes (5, 10 ml) for sera filtration | Pic Solution | ||
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14094-11 |
Riferimenti
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