Summary
我们演示了如何建立肺根植入降主动脉的小鼠模型，以模拟Ross手术。该模型能够对全身位置的肺自体移植重塑进行中长期评估，这是制定治疗策略以促进其适应的基础。
Abstract
Ross主动脉瓣疾病手术由于其出色的长期结果而重新获得了新的兴趣。然而，当用作独立根部替代术时，描述了肺自体移植的可能扩张和随后的主动脉瓣反流。已经提出了几种动物模型。然而，这些通常仅限于 离体 模型或相对昂贵的大型动物模型的 体内 实验。在这项研究中，我们试图建立一种在全身位置植入肺动脉移植（PAG）的啮齿动物模型。总共包括39只成年刘易斯大鼠。安乐死后立即从供体动物身上摘取肺根（n=17）。同源受体（n = 17）和假手术（n = 5）大鼠镇静并通气。在接受组，PAG在肾下腹主动脉位置植入端到端吻合器。假手术大鼠仅接受主动脉的横切和再吻合。对动物进行连续超声检查两个月和死后组织学分析。原生位置的PAG直径中位数为3.20毫米（IQR=3.18-3.23）。随访时，PAG的中位直径在1周时为4.03 mm（IQR=3.74~4.13），1个月时为4.07 mm（IQR=3.80~4.28），2个月时为4.27 mm（IQR=3.90~4.35）（p<0.01）。1周时收缩速度峰值为220.07 mm/s（IQR=210.43-246.41），1个月时为430.88 mm/s（IQR=375.28-495.56），2个月时为373.68 mm/s（IQR=305.78-429.81），与实验结束时的假手术组（p=0.5）没有差异。组织学分析未显示任何内皮血栓形成的体征。这项研究表明，啮齿动物模型可以评估肺根对高压系统的长期适应性。系统放置的同源PAG植入代表了开发和评估新型手术技术和药物治疗的简单可行的平台，以进一步改善Ross手术的结果。
Introduction
先天性主动脉瓣狭窄是先天性心脏病的一个亚组，其特征在于左心室梗阻，其中病变位于瓣膜水平。畸形影响每1000名活产婴儿约0.04-0.38人1。
可用于校正的选项很多，每个选项都有自己的优点和缺点。对于适合进行双心室矫正的患者2，该方法可能针对瓣膜修复（经皮或手术瓣膜切开术）或其替代治疗3。当主动脉瓣被认为无法挽救时，后者是首选;然而，对于儿科患者，可用的选择是有限的。事实上，生物瓣膜由于早期钙化，不适合年轻人群中的主动脉置换术4。另一方面，机械瓣膜的退化速度要慢得多，但这些需要终身抗凝治疗5。此外，这些假体的主要局限性表现为缺乏生长潜力，这使患者容易进行额外的再干预。
儿科人群中一个有趣的治疗选择是将肺自体移植物转移到名为"Ross手术"的主动脉位置。在这种情况下，肺动脉瓣随后被同种移植物取代（图1）6。该手术可能是儿童的最佳手术选择，因为肺自体移植物保留了其生长潜力，并且没有终身抗凝治疗的风险。此外，Ross手术在年轻人中也具有很高的价值，可以避免机械或生物瓣膜，有可能成为最佳的手术解决方案。
肺自体移植术置换主动脉瓣后的效果非常好，生存率高于98%，长期结局良好7。文献研究显示，在 4 年和 12 年时，肺同种移植物的替代率分别为 93% 和 90%8。
该手术的主要局限性是自体移植物在长期内扩张的趋势，特别是当用作独立根部替代物时。这可能导致瓣膜功能不全，可能需要再次干预。事实上，迄今为止进行的最长的随访研究报告称，自体移植替代术在10年时为88%，在20年时为75%9。
在实验环境中重建Ross手术的可能性代表了研究肺自体移植适应全身压力的潜在机制的基本先决条件。过去曾提出过几种模式。然而，这些通常仅限于 离体 实验或具有相对昂贵的大型动物的 体内 动物模型。在这项研究中，我们试图建立一种啮齿动物模型，将肺动脉移植（PAG）植入在全身位置，作为独立根。
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Protocol
所有程序均已获得帕多瓦大学动物护理委员会（OPBA，协议编号N°55/2017）的批准，并得到意大利卫生部的授权（授权号700/2018-PR），符合欧盟指令2010/63 / UE和意大利实验室动物护理和使用法律26/2014。
1. 动物护理和实验模型
- 确保所有刘易斯大鼠都是从一家公司获得的（材料表）。将老鼠养在传统设施中，免费获得食物和水。
- 确保受体组的大鼠的重量范围为320-400 g，供体组为200-250 g。
2. 术前方案
注意：所有操作必须在干净的条件下执行。使用雄性和雌性成年刘易斯大鼠作为受体和供体，以进行同源移植。
- 手术前15分钟腹膜内注射曲马多（5mg / kg）。
- 术前立即给予单剂量肌内注射庆大霉素（5 mg / kg）。
- 对于麻醉诱导，在1升/分钟的氧气中向放置动物的聚（甲基丙烯酸甲酯）室提供4%的七氟醚。对于麻醉维持，在整个过程中使用2.0-2.5%七氟醚在1升/分钟的氧气中。
- 用剃须刀将动物沿着中线剃须，从胸骨到生殖器上方1厘米宽2厘米。然后，用碘溶液对皮肤进行消毒。
- 为了防止动物被弄湿并防止手术过程中的热量分散，请用透明的塑料薄膜覆盖动物。
- 通过评估对有毒刺激无反应，在执行手术前评估麻醉水平。
3. 捐赠者操作
- 动物和心脏准备：
- 将麻醉的动物放在软木托盘上，尾侧面向外科医生。进行约 5 - 6 厘米的切口，并横向缩回两个肌肉皮瓣。
- 在4°C下通过腹腔静脉给予含有500 IU肝素的1mL盐水溶液。
- 1分钟后，从左到右切开隔膜，并进行前胸切开术以暴露心脏。
- 通过在4°C下滴注盐水溶液来冷却跳动的心脏。
- 进行心包切除术和胸腺切除术，以获得主动脉弓的完整视图。去除主动脉周围的剩余脂肪组织。
- 切在弓上，就在无名动脉的起源上方;也切断了后者。
- 切开胸下腔静脉（IVC）并插入22 G插管，在4°C下用20-25mL盐水溶液注入心脏，施加轻压。当心脏停止跳动并且主动脉的流量变得清晰时，停止灌注。
- PAG外植体：
注意：为了在受体中实现最佳植入，必须对PAG进行准确的收获和精细处理。不要用仪器直接触摸它，而应使用棉签。- 进行超声检查以评估 PA 直径在其原始位置。
- 在血管后壁下插入一把微型钳子，并使用尽可能靠近其分叉的微型剪刀切割后者，以最大化PAG的长度。
- 用环形尖端的微镊子轻轻握住PA，并用微型弹簧剪刀将其与右心室分开。收获PAG，包括一些右心室肌肉。
- PAG准备：
- 将PAG放在手术台上用冷盐水润湿的纱布上，并在手术显微镜下检查容器。
- 切除任何丰富的周围组织，只留下1毫米的心室肌肉。将容器的长度设置为 5 mm。
4. 肺动脉移植术（PAG）植入术
- 接受动物的准备：
- 将麻醉的动物放在软木托盘上，尾侧面向外科医生。
- 进行中位纵向切口，并使用两个迷你牵开器保持腹部开放。
- 用两个棉签提取肠道，并用浸泡有39°C盐水的纱布覆盖它们，允许在暴露于肾下腹主动脉（AA）的情况下可视化腹膜后区域。
注意：在手术过程中，重要的是偶尔使用含有39°C盐水的注射器润湿肠道，以防止体温过低，这是啮齿动物常见的危急情况。 - 使用两个棉签剥离两条肾动脉之间的后壁腹膜和髂骨分叉，并去除肾下AA周围的脂肪组织。在AA上方只留下一小部分脂肪，以方便在船上处理。
- 将 AA 与 IVC 分开。要执行此过程，首先，在主动脉后壁后面通过弯曲的镊子，并用它来打开AA和IVC之间的通道。然后，使用2-0丝线在AA周围形成一个环，以便抬起血管并将AA与IVC分开。用6/0丝线缝合线将任何由肾下AA引起的腰动脉固定并分开。
- 逆时针旋转动物 90°，将头部放在操作员的左侧。AA现在水平放置在微观场中。
- 使用两个Yasargil夹子夹住肾下AA，并将它们放置在彼此相距1.5厘米的地方。在两个夹子之间的中点处横切 AA。
- 用盐水溶液中的肝素（1 UI / mL）灌溉血管的两端以去除任何凝块。清除容器上的任何外来碎片。
- PAG植入：
- 将PAG放在两端之间，心室端朝向动物的颅骨部分。
- 使用10-0聚丙烯缝合线进行两次具有里程碑意义的单针，将PG连接到AA。通过将缝合线放在血管周长的两侧，在PAG的两端执行该过程。
- 在 PAG 和 AA 之间执行端到端吻合，从远端开始。使用远端指缝合线的两端之一进行后吻合术，使用接受者到移植物的出入/出顺序进行约六针的连续缝合。
- 一旦缝合线到达近端地标，使用缝合线和近端地标缝合线的两端之一，通过方形结完成双半铰接。将橡皮防蚊钳涂在缝合线上以提供牵引力。
- 在前壁上进行相同的吻合术。在PAG的近端进行整个过程。进行近端吻合术时要特别注意，以避免在缝合线中包含任何传单。
- 首先松开远端夹子，让PAG充满逆行血液（低压流），以检查吻合口。用一条缝合线修复任何漏血。一旦评估了远端吻合口，在近端执行相同的程序。
- 对收件人执行操作的最后阶段：
- 评估PAG的通畅性，并在PAG两侧的缝合线上涂抹两条明胶海绵（如有必要）。用两个棉签轻轻按压几秒钟，以帮助止血。
- 将肠重新定位到腹腔中，并用4/0聚丙烯运行缝合线关闭壁。
5. 假手术程序
- 对动物进行与先前为受体大鼠所示相同的准备。
- 切除肾下 AA，位于肾和髂动脉起源之间。
- 如前所述，使用端到端吻合术重新分配AA的两端。取下两个夹子并执行准确的止血程序。
- 重新定位肠道并分层关闭腹壁，就像受体动物一样。
6. 术后护理和随访
- 将温盐水溶液（5毫升）施用于动物背部的皮下组织进行水合作用。将大鼠置于加热灯下并目视监测，直到醒来，这通常需要麻醉停止后长达5分钟。将动物置于室温为22-24°C的笼子中，立即不受限制地获取食物和水。
- 肌内注射曲马多（5 mg/kg）用于术后镇痛，每日两次，术后前48小时。此后，每天定期监测接受者的健康状况和体重。
- 随访：随访期间，在一周、一个月和两个月进行血清超声检查，以评估PAG功能。在这些研究期间，测量血管直径、收缩期峰值速度 （PSV） 和舒张末期速度。在 PAG 内部以及近端和远端 AA 水平测量这些参数。
- 在随访两个月后，通过施用CO2 几分钟对动物实施安乐死，然后外植PAG，进行组织病理学分析。
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Representative Results
本研究共纳入39只成年刘易斯大鼠：17只动物作为PAG供体，17只动物作为受体，5只作为假手术（对照组）（表1）。雄性大鼠为22只（56%），雌性为17只（44%）;后者仅用于捐助集团。
手术期间未发生致命事件，存活率为100%。在随访期间，移植组的两只动物分别在12天和51天时有致命的结果;研究结束时的存活率为91%（表1）。
受体组大鼠的中位重量为387 g（四分位间范围，IQR，358-394 g），供体组为328 g（IQR = 304-337 g）。手术后一周，中位体重为363g（IQR=350-376g），与术前体重相比降低了6%。动物在随访的第一个月内恢复了体重（中位数387克，IQR 369-392克），两个月时最终体重为397克（IQR= 391-402克）（图2）。
移植组的中位随访时间为62.5 d（IQR=60~68 d），假手术组的随访时间为62 d（IQR=61~67 d）（p=0.68）。
术前PA在其原始位置的中位直径为3.20 mm（IQR = 3.18-3.23 mm）。PAG的中位直径在一周时为4.03毫米（IQR=3.74-4.13毫米），一个月时为4.07毫米（IQR=3.80-4.28毫米），两个月时为4.27毫米（IQR=3.90-4.35毫米）（图3A）。与原生位置的直径相比，分别增加了25.9%，27.2%和33.5%。当比较原生位置的值和一周时的值（p = 0.003）时，直径的增加显着不同，而在以下研究中没有发现显着增加。假手术组的主动脉直径在一周时为1.41毫米（IQR=1.35-1.62毫米），在两个月时为1.41毫米（IQR=1.29-1.70毫米）。PAG水平的PSV中位数在一周内为220.07毫米/秒（IQR=210.43-246.41毫米/秒），一个月时为430.88毫米/秒（IQR=375.28-495.56毫米/秒），两个月时为373.68毫米/秒（IQR=305.78-429.81毫米/秒）。与假手术组相比，PSV在一周内发现显着差异（中位数419.12 mm / s，IQR = 408.42-561.32 mm / s; p<0.001），而在研究结束时未发现差异（392.92 mm / s，IQR = 305.89-514.27 mm / s; p = 0.5）（图3B）。
在研究结束时，组织学分析显示没有内皮血栓形成的迹象，并且在大多数情况下壁钙化不显着（图4）。
图 1：罗斯操作的代表性图像。 照片显示了罗斯行动的各个阶段。（一）主动脉瓣和根部外植体;（二）主动脉位置肺动脉自体移位;（C）用同种移植物替代肺动脉自体移植。A：主动脉瓣和根部;H：同种移植物;P：肺动脉瓣和肺根。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：移植组体重的时间过程。 该图显示了移植组中大鼠体重时间的过程。值表示为中位数和四分位数范围。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3：进入肺动脉移植物的直径和峰值收缩速度的变化。 该图显示了在空间狭长超声评估期间肺动脉移植物内直径（A）和峰值收缩速度（B）的变化。值表示为中位数和四分位数范围。 请点击此处查看此图的放大版本。
图4：PAG的微观评估。 该图显示了外植体（A）后的PAG。（B） 放射学评估;（C）苏木精和曙红染色，原来放大倍率12.5倍。 请点击此处查看此图的放大版本。
| 变量 | 移植 | 捐助 者 | 假手术 | 总 |
| 事件数 | 17 | 17 | 5 | 39 |
| 手术中的致命事件 | 0 | // | 0 | 0 |
| 随访期间发生致命事件（%） | 2 | // | 0 | 2 (91) |
| 手术时体重* | 387 (358-394) | 327,5 (303-337) | 389 (321-404) |
表1：研究的特征和结果。*值表示为中位数和四分位数间范围。
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Discussion
由于自体移植的有利特征和潜在生长，使用自体肺根置换主动脉瓣（Ross手术）是先天性主动脉瓣狭窄修复的一个有吸引力的选择10。该手术的主要局限性是主动脉新瓣膜的潜在扩张，这容易导致长期反流的发展。表征暴露于全身压力后肺动脉修饰的可能性可能是理解肺自体移植失败原因的基础。因此，我们开发了一种在啮齿动物模型中全身位置植入同源PAG的实验模型。
报道的手术技术是安全，有效和可重复的。所用动物的小尺寸简化了手术和术后管理。这使我们能够以有限的材料和动物费用获得有用的模型。选择刘易斯大鼠是因为，作为近交系，这些大鼠是等基因的，超过99%的等位基因是固定的。因此，它们是研究动物之间肺动脉瓣移植的合适模型。我们决定为该研究设定一个两个月的终点，因为文献数据表明人类和大鼠天之间的比率为1：1111111。因此，我们可以假设我们的后续时间大约为五年，这使我们能够评估PAG在中长期内的适应情况。
我们的初步结果显示，在植入后的第一周内，PAG直径迅速增加，PVS在其水平上测量到的PVS减少。随后，观察到直径增加的部分平台。我们可以推测，短期内PSV的减少可能与PAG直径的增加有关，导致进入PAG本身的血流减速。
旨在缩短随访终点后将PAG修饰置于全身位置的进一步研究将有助于澄清这种适应随时间推移的演变。使用不同的策略来调节PAG适应不良的该模型的未来发展可能会防止其扩张，从而改善Ross干预后的结果。这些策略可以是药物治疗，例如压力控制（即使用血管紧张素转换酶抑制剂或血管紧张素 II 受体阻滞剂）抗氧化疗法，或机械遏制 PAG 扩张与外部强化（如一些作者最近提出的12）。
应特别注意执行该过程中的一些关键步骤。首先，在收获肺动脉时，包括适量的右心室肌肉是至关重要的。事实上，当保留过多的肌肉组织时，吻合器泄漏的风险增加，而肌肉量不足可能易损伤瓣膜的小叶。在 PA 和 AA 之间进行近端端到端吻合术时，应特别注意不要包括瓣膜的小叶，以避免影响其运动范围。最后，充分的止血是避免过度失血的基础，过度失血可能会损害术后病程。
在随访期间，体重减轻高达6%被认为是可以接受的。然而，动物应该在随访的第一个月内恢复初始体重，并在之后继续增加体重。如果未能达到初始体重与上升趋势的证据有关，也可以被视为动物福祉的指数。另一方面，任何体重减轻超过6%，以及任何未能达到一个月下降趋势的初始体重，都应该引起对动物潜在不良状况的担忧。
对于接近该模型的研究人员来说，主要的技术建议是使用连续缝合来执行端到端吻合术。虽然显微外科教科书建议对这种吻合使用单独的缝合，但我们更喜欢连续缝合，因为它可以更好地收紧肺根。除此之外，我们观察到，通过这种方式，更容易减少与受体主动脉的潜在不匹配，尽管使用较小的动物进行肺根采集，但主动脉仍然存在。
用于研究肺根部压力超负荷的其他动物模型已经在当前文献中进行了描述。这些通常涉及 PA 带13。尽管上游压力有效增加，但这些模型并不能完全重现Ross程序。事实上，第一个限制是压力过载的高可变性，这取决于绷带与PA直径相比的紧密程度。由于这些原因，肺负荷可能并不总是反映实际的全身压力。将肺根保留在其天然位置是PA束带模型的第二个局限性。在Ross手术中，PA失去所有血管和神经连接，这可能会影响其对全身压力的进一步适应。
科学界也已经描述了PA在系统位置异位转位的一些动物模型。然而，所有这些模型都涉及使用大型动物，如羔羊或绵羊14，15。毫无疑问，这些动物可以通过提供执行实际Ross手术的可能性来简化外科手术的某些方面。然而，对体外循环的需求以及对更多人参与手术和术后管理的需求大大增加了成本，从而限制了该模型的大规模使用。此外，小动物模型（如大鼠）将允许执行许多原因，从而减少变异性并实现不同的时间终点以及比较多个组的可能性。
尽管它提供了评估PA根对系统压力的修改的可能性，如Ross操作，但该模型具有一些局限性。主要限制是不可能在冠状动脉脱离和再植入的情况下进行实际的Ross手术。然而，就我们的目的而言，这只是一个小限制，因为研究的重点是肺壁。腹下主动脉中的压力与升主动脉中的压力不同，从而限制了与Ross手术在瓣膜小叶运动方面的比较;然而，我们的主要焦点再次是PA根作为PAG失败 的原始移动 。此外，与大型动物相比，啮齿动物的使用可能具有与不同的全身压力尺度相关的一些局限性。但是，这种差异与原生根所承受的压力成正比。
总之，目前的研究表明，在啮齿动物模型中系统放置的同源PAG植入代表了开发和评估新型手术技术和药物治疗以进一步改善Ross手术结果的简单可行的平台。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
该研究由2019年跨部门研究综合预算（BIRD）资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride | Monico SpA | AIC 030805105 | Two bottles of 100 mL. The cold one (4°C) for flushing the harvesting organ; the warm one (39°C) for moistening, and rehydration of the recipient |
| 7.5% Povidone-Iodine | B Braun | AIC 032151211 | |
| Barraquer | Aesculap | FD 232R | Straight micro needle holder for the vascular anastomoses |
| Castroviejo needle holder | Not available | J 4065 | To close the animal |
| Clip applying forceps | Rudolf Medical | RU 3994-05 | For clip application |
| Cotton swabs | Johnson & Johnson Medical SpA | N/A | Supermarket product. Sterilized |
| Curved micro jeweller forceps | Rudolf Medical | RU 4240-06 | Used to pass sutures underneath the vases. |
| Depilatory cream | RB healthcare | N/A | Supermarket product |
| Electrocautery machine | LED SpA | Surton 200 | |
| Fine scissors | Rudolf Medical | RU 2422-11 | For opening the abdomen (recipient) |
| Fine-tip curved Vannas micro scissors | Aesculap | OC 497R | Only for preparing the pulmonary root, cut the lumbar vases and the 10/0 Prolene |
| Fluovac Isoflurane/Halotane Scavanger unit | Harvard Apparatus Ltd | K 017041 | Complete of anesthesia machine, anesthesia tubing, induction chamber and scavenger unit with absorbable filter |
| Gentamycin | MSD Italia Srl | AIC 020891014 | Antibiotic. Single dose, 5 mg/kg intramuscular, administered during surgery |
| Heparin | Pharmatex Italia Srl | AIC 034692044 | 500 IU into the recipient abdominal vena cava |
| I.V. Catheter | Smiths Medical Ltd | 4036 | 20G |
| Insulin Syringe, 1 mL | Fisher Scientific | 14-841-33 | To inject heparin in the harvesting animal and to flush the sectioned aorta in the recipient |
| Jeweler bipolar forceps | GIMA SpA | 30665 | 0.25 mm tip. For electrocautery of very small vases |
| Lewis rats (LEW/HanHsd) | Envigo RMS SRL, San Pietro al Natisone, Udine, Italy | 86104M | Male or female, weighing 200-250 g (pulmonary root harvesting animals) and 320-400 g (recipients) |
| Micro-Mosquito | Rudolf Medical | RU 3121-10 | In number of four, with tips covered with silicon tubing. To keep in traction the Prolene suture during anastomosis |
| Operating microscope | Leica Microsystems | M 400-E | Used with 6x, 10x and 16x in-procedure interchangeable magnifications |
| Perma-Hand silk 2-0 | Johnson & Johnson Medical SpA | C026D | To lift the aorta |
| Petrolatum ophthalmic ointment | Dechra | NDC 17033-211-38 | |
| Prolene 10-0 | Johnson & Johnson Medical SpA | W2790 | Very fine non-absorbable suture, with a BV75-3 round bodied needle, for the vascular anastomoses |
| Retractors | Not any | N/A | Two home-made retractors |
| Ring tip micro forceps | Rudolf Medical | RU 4079-14 | For delicate manipulation |
| Sevoflurane | AbbVie Srl | AIC 031841036 | Mixed with oxygen, for inhalatory anesthesia |
| Spring type micro scissors | Rudolf Medical | RU 2380-14 | Straight; 14 cm long |
| Standard aneurysm clips | Rudolf Medical | RU 3980-12 | Two clips (7.5 mm; 180 g; 1.77 N) to close the aorta |
| Sterile gauze of non-woven fabric material | Luigi Salvadori SpA | 26161V | 7.5x7.5 cm, four layers |
| Straight Doyen scissors | Rudolf Medical | RU/1428-16 | For use to the donor |
| Straight micro jeweller forceps | Rudolf Medical | RU 4240-04 | 10.5 cm long. Used throughout the anastomosis |
| Syringes | Artsana SpA | N/A | 20 mL (for the harvesting animal) and 5 mL (for the recipient). For saline flushing and dipping |
| TiCron 4-0 | Covidien | CV-331 | For closing muscles and skin |
| Tissue forceps V. Mueller | McKesson | CH 6950-009 | Used for skin and muscles |
| Tramadol | SALF SpA | AIC 044718029 | Analgesic. Single dose, 5 mg/kg intramuscular |
| Virgin silk 8-0 | Johnson & Johnson Medical SpA | W818 | For arterial branch ligation |
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