Morfogenez, Desenleme ve Hücre Farklılaşmasında Erken Adımları Anlamak için Tavuk Rekombinant Uzuvları Testi
Summary
Rekombinant uzuvlar, hücre farklılaşma sürecini ve embriyonik sinyallerin etkisi altında kalıpların üretilmesini incelemeye izin veren güçlü bir deneysel modeldir. Bu protokol, farklı organizmalardan elde edilen diğer hücre tiplerine uyarlanabilen, tavuk ekstremite-mezodermal hücrelere sahip rekombinant uzuvlar üretmek için ayrıntılı bir yöntem sunar.
Abstract
Hücre farklılaşması, gelişmekte olan doku ve organların kurulması sırasında farklı uzmanlaşmış hücre tiplerinin oluşumuna yol açan ince ayarlı hücre bağlılığı sürecidir. Bu süreç yetişkinlikte aktif olarak sürdürülür. Hücre farklılaşması, organların gelişimi ve homeostazı sırasında devam eden bir süreçtir. Hücre farklılaşmasının erken adımlarını anlamak, morfogenez gibi diğer karmaşık süreçleri bilmek için gereklidir. Bu nedenle, rekombinant tavuk uzuvları, embriyonik modelleme sinyalleri altında hücre farklılaşması ve desen üretiminin incelenmesine izin veren deneysel bir modeldir. Bu deneysel model in vivo bir ortamı taklit eder; yeniden toplanmış hücreleri, erken bir ekstremite tomurcuğundan elde edilen ektodermal bir örtüye birleştirir. Daha sonra, ektodermler, gelişimine izin vermek için bir civciv embriyo reseptörüne transfer edilir ve implante edilir. Bu tahlil esas olarak mezodermal ekstremite tomurcuk hücrelerini değerlendirmek için kullanılmıştır; Bununla birlikte, diğer organizmalardan diğer kök veya progenitör hücrelere uygulanabilir.
Introduction
Omurgalı uzuv, hücre farklılaşmasını, hücre çoğalmasını, hücre ölümünü, desen oluşumunu ve morfogeneziincelemek için zorlu bir modeldir 1,2. Gelişim sırasında, uzuvlar lateral plaka mezoderm1’den türetilen hücrelerden şişkinlikler olarak ortaya çıkar. Ekstremite tomurcukları, bir ektoderm tarafından kaplanmış mezodermal hücrelerin merkezi bir çekirdeğinden oluşur. Bu erken yapıdan, bütün ve iyi biçimlendirilmiş bir uzuv ortaya çıkar. Ekstremite tomurcuğu ortaya çıktıktan sonra, üç eksen tanınır: (1) proksimo-distal eksen ([PD] omuzdan parmaklara), (2) dorso-ventral eksen ([DV] elin arkasından avuç içine kadar) ve (3) anterior-posterior ([AP] başparmak parmağına). Proksimal distal eksen, ekstremite tomurcuğunun distal ucunda bulunan apikal ektodermal sırta (AER), uzmanlaşmış ektoderme bağlıdır. AER, büyüme, hayatta kalma bakımı, proliferasyon ve sinyal alan hücrelerin farklılaşmamış durumuiçin gereklidir 2,3. Öte yandan, polarize edici aktivite bölgesi (ZPA) anteroposterior paternleme4’ü kontrol ederken, dorsal ve ektoderm dorsoventral desenleme 7,8’i kontrol eder. Üç boyutlu modellemenin entegrasyonu, bu üç eksen arasındaki karmaşık çapraz konuşmayı ima eder5. Uzuv gelişimi sırasında moleküler yolun anlaşılmasına rağmen, bütün bir uzuv oluşturmak için modellemeyi ve uygun büyümeyi kontrol eden mekanizmalar hakkındaki açık sorular cevapsız kalmaktadır.
Edgar Zwilling, gelişmekte olan uzuvlarda ekstremite mezenkimal hücreleri ve ektoderm arasındaki etkileşimleri incelemek için 1964 yılında rekombinant uzuv (RL) sistemini geliştirdi6. RL sistemi, ayrışmış-yeniden agregaye edilmiş ekstremite tomurcuk mezodermini embriyonik ekstremite ektodermine monte ederek donör civciv embriyosunun dorsal kısmına greft eder. Ektoderm tarafından sağlanan sinyaller, farklılaşma genlerinin ve modelleme genlerinin uzay-zamansal bir şekilde ekspresyonunu indükler, böylece uzuv gelişimi sırasında meydana gelen hücre programlarını özetleyebilen uzuv benzeri bir yapının oluşumunu indükler 7,8,9.
RL modeli, ekstremite bileşenlerinin özelliklerini ve mezodermal ve ektodermal hücreler arasındaki etkileşimi anlamak için değerlidir6. Bir RL, ekstremite tomurcuk mezodermal hücrelerinin ektodermalbir örtü 6 içinde deneysel olarak birleştirilmesi veya yeniden birleştirilmesiyle oluşturulan uzuv benzeri bir yapı olarak tanımlanabilir. RL’nin morfogenezi, ektodermal modelleme sinyallerine cevap verecek mezodermal hücrelerin (veya diğer tiplerin) özelliklerine bağlıdır. Bu deneysel sistemin avantajlarından biri çok yönlülüğüdür. Bu özellik, farklı gelişim aşamalarından hücreler, uzuv boyunca farklı konumlardan veya bütün (ayrışmamış) veya yeniden toplanmış hücreler 7,8,9,10 gibi mezodermal hücrelerin kaynağını değiştirerek çoklu kombinasyonların oluşturulmasına izin verir. Başka bir örnek, embriyonik ektodermi tavuk dışındaki türlerden, örneğin kaplumbağa11, bıldırcın veya fare12’den elde etme yeteneğidir.
Bu anlamda, RL tekniği uzuv gelişimini ve uzuv mezenkimal ve ektodermal hücreleri arasındaki etkileşimleri evrimsel bir bakış açısıyla incelemeye yardımcı olur. Bu teknik aynı zamanda farklı progenitör hücre kaynaklarının, embriyonik ektoderm12,13,14 tarafından sağlanan sinyallerden yararlanarak uzuv benzeri bir yapıya farklılaşma yeteneğini analiz etmek için büyük bir potansiyele sahiptir. İn vitro kültürlerin aksine, RL, gelişmekte olan bir uzuvdan gelen embriyonik sinyalleri yorumlayarak bir hücre popülasyonunun farklılaşmasını ve morfogenetik potansiyelini değerlendirmeye izin verir 9,15.
Bu protokolde, yeniden toplanmış mezodermal ekstremite tomurcuk hücreleri ile başarılı RL gerçekleştirmek için adım adım bir kılavuz sağlanmıştır, böylece bu protokolü farklı yeniden topaklanmış hücre kaynakları veya hatta farklı ektoderm kaynakları ile uyarlama imkanı açılmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Genel olarak, RL protokolü beş adıma ayrılabilir: (1) embriyo inkübasyonu, (2) ektodermleri doldurmak için uzuv mezodermal hücrelerinin elde edilmesi, (3) ektodermlerin elde edilmesi, (4) mezodermal hücrelerin ektodermal kapakların içine monte edilmesi ve (5) doldurulmuş ektodermlerin konakçı embriyolara nakli. RL tekniğinin en büyük sınırlaması, uygun şekilde performans göstermek için sabır gerektiren birçok kritik noktaya sahip olan uzun, ayrıntılı protokoldür. Protokolü başarıyla tamamla…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Şekil 2’deki görüntüler için Estefania Garay-Pacheco’ya ve sanat eseri için Maria Valeria Chimal-Montes de Oca’ya teşekkür ederiz. Bu çalışma, JC-M’ye verilen Dirección General de Asuntos del Personal Académico (DGAPA)-Universidad Nacional Autónoma de México [hibe numaraları IN211117 ve IN213314] ve Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) [hibe numarası 1887 CONACyT-Fronteras de la Ciencia] tarafından desteklenmiştir. JC M-L, Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología’dan (CONACyT-Fronteras de la Ciencia-1887) doktora sonrası burs aldı.
Materials
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A5268 | |
| Angled slit knife | Alcon | 2.75mm DB | |
| Blunt forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| Collagenase type IV | Gibco | 1704-019 | |
| DMEM-HG | Sigma | D5796 | |
| Egg incubator | Incumatic de Mexico | Incumatic 1000 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000069 | |
| Fine surgical forceps | Fine Science Tools | 9115-10 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma | H6648 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Micropipet | NA | NA | |
| Palladium wire | GoodFellow | 7440 05-3 | |
| Petri dish | Nest | 705001 | |
| Pippette | crmglobe | PF1016 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Tape | NA | NA | |
| Trypsin porcine | Merck | 9002 07-7 | |
| Tungsten needle | GoodFellow | E74-15096/01 |
Riferimenti
- Malashichev, Y., Christ, B., Pröls, F. Avian pelvis originates from lateral plate mesoderm and its development requires signals from both ectoderm and paraxial mesoderm. Cell and Tissue Research. 331 (3), 595-604 (2008).
- Mahmood, R., et al. A role for FGF-8 in the initiation and maintenance of vertebrate limb bud outgrowth. Current Biology. 5 (7), 797-806 (1995).
- Yu, K., Ornitz, D. M. FGF signaling regulates mesenchymal differentiation and skeletal patterning along the limb bud proximodistal axis. Development. 135 (3), 483-491 (2008).
- Riddle, R. D., Johnson, R. L., Laufer, E., Tabin, C. Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA. Cell. 75 (5), 1401-1416 (1993).
- McQueen, C., Towers, M. Establishing the pattern of the vertebrate limb. Development. 147 (17), (2020).
- Zwilling, E. Development of fragmented and of dissociated limb bud mesoderm. Developmental biology. 9 (1), 20-37 (1964).
- Frederick, J. M., Fallon, J. F. The proportion and distribution of polarizing zone cells causing morphogenetic inhibition when coaggregated with anterior half wing mesoderm in recombinant limbs. Development. 67 (1), 13-25 (1982).
- Ros, M. A., Lyons, G. E., Mackem, S., Fallon, J. F. Recombinant limbs as a model to study homeobox gene regulation during limb development. Biologia dello sviluppo. 166 (1), 59-72 (1994).
- Piedra, M. E., Rivero, F. B., Fernandez-Teran, M., Ros, M. A. Pattern formation and regulation of gene expressions in chick recombinant limbs. Mechanisms of Development. 90 (2), 167-179 (2000).
- Crosby, G. M., Fallon, J. F. Inhibitory effect on limb morphogenesis by cells of the polarizing zone coaggregated with pre-or postaxial wing bud mesoderm. Biologia dello sviluppo. 46 (1), 28-39 (1975).
- Fallon, J. F., Simandl, B. K. Interactions between chick limb bud mesoderm and reptile ectoderm result in limb outgrowth in the limbless mutant. Anatomical Record. 208, 53-54 (1984).
- Kuhlman, J., Niswander, L. Limb deformity proteins: role in mesodermal induction of the apical ectodermal ridge. Development. 124 (1), 133-139 (1997).
- Goetinck, P. F., Abbott, U. K. Studies on limb morphogenesis. I. Experiments with the polydactylous mutant, talpid. Journal of Experimental Zoology. 155, 161-170 (1964).
- Carrington, J. L., Fallon, J. F. Initial limb budding is independent of apical ectodermal ridge activity; evidence from a limbless mutant. Development. 104 (3), 361-367 (1988).
- Fernandez-Teran, M., Piedra, M. E., Ros, M. A., Fallon, J. F. The recombinant limb as a model for the study of limb patterning, and its application to muscle development. Cell and Tissue Research. 296 (1), 121-129 (1999).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Ganan, Y., Macias, D., Duterque-Coquillaud, M., Ros, M. A., Hurle, J. M. Role of TGF beta s and BMPs as signals controlling the position of the digits and the areas of interdigital cell death in the developing chick limb autopod. Development. 122 (8), 2349-2357 (1996).
- Ros, M. A., Simandl, B. K., Clark, A. W., Fallon, J. F. Methods for manipulating the chick limb bud to study gene expression, tissue interactions, and patterning. Developmental Biology Protocols. 137, 245-266 (2000).
- MacCabe, J. A., Saunders, J. W., Pickett, M. The control of the anteroposterior and dorsoventral axes in embryonic chick limbs constructed of dissociated and reaggregated limb-bud mesoderm. Biologia dello sviluppo. 31 (2), 323-335 (1973).
- Zwilling, E. Effects of contact between mutant (wingless) limb buds and those of genetically normal chick embryos: confirmation of a hypothesis. Biologia dello sviluppo. 39 (1), 37-48 (1974).
- Prahlad, K. V., Skala, G., Jones, D. G., Briles, W. E. Limbless: A new genetic mutant in the chick. Journal of Experimental Zoology. 209 (3), 427-434 (1979).
- Marin Llera, J. C., Lorda-Diez, C. I., Hurle, J., Chimal-Monroy, J. SCA-1/Ly6A mesodermal skeletal progenitor subpopulations reveal differential commitment of early limb bud cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 656999 (2021).
