Summary
我们描述了一种实验装置,用于在连续灌注模式下向分离的灌注小鼠心脏施用超极化 13种C标记代谢物。专用的 13C-NMR采集方法能够实时定量代谢酶活性,多参数 31P-NMR分析可以测定组织ATP含量和pH值。
Abstract
新陈代谢是细胞生命重要过程的基础。表征代谢网络如何在活组织中发挥作用,为理解疾病的机制和设计治疗方法提供了关键信息。在这项工作中,我们描述了实时研究逆行灌注小鼠心脏中细胞内代谢活动的程序和方法。将心脏原位分离,结合心脏骤停以尽量减少心肌缺血,并在核磁共振(NMR)波谱仪内灌注。在光谱仪和连续灌注下,将超极化[1-13 C]丙酮酸施用于心脏,随后的超极化[1-13C]乳酸和[13C]碳酸氢盐产生速率用于实时确定乳酸脱氢酶和丙酮酸脱氢酶的速率。超极化[1-13C]丙酮酸的这种代谢活性使用产物选择性饱和激发采集方法以模型自由方式定量。31在超极化采集之间应用P光谱来监测心脏能量和pH值。该系统对于研究健康和患病小鼠心脏中的代谢活动具有独特的用途。
Introduction
心脏代谢的改变与多种心肌病有关,并且通常构成潜在病理生理机制的基础1。然而,研究活组织中的代谢存在许多障碍,因为大多数生化测定需要组织和细胞裂解和/或放射性示踪的均质化。因此,迫切需要新的工具来研究活组织中的心肌代谢。超极化 13个 C 标记底物的磁共振 (MR) 允许实时测量活组织2 中的代谢,而无需使用电离辐射,方法是将标记位点的 MR 信噪比提高几个数量级3。在这里,我们描述了一种实验装置,一种采集方法和分析方法,用于研究分离的小鼠心脏中的快速代谢,并同时呈现一般组织能量和酸度的指标。心脏pH值是一个有价值的指标,因为在心脏疾病和心肌缺血、适应不良肥大和心力衰竭等疾病的早期阶段,酸碱平衡被破坏了6。
超极化[1-13C]乳酸和[13 C]碳酸氢盐从超极化[1-13C]丙酮酸产生有助于确定乳酸脱氢酶(LDH)和丙酮酸脱氢酶(PDH)的产生速率。以前在分离的啮齿动物心脏中使用超极化底物进行的大多数研究要么使用复杂的动力学模型来推导出LDH和PDH的酶活性,要么报告超极化产物与底物的信号强度比,而不计算实际的酶活性率2,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14.在这里,我们使用了产物选择性饱和激发方法15,该方法允许以无模型的方式监测酶活性15,16。通过这种方式,确定了绝对酶促速率(即每单位时间内产生的产物摩尔数)。31采用磷谱观察无机磷酸盐(Pi)、磷酸肌酸(PCr)和三磷酸腺苷(ATP)的信号。使用多参数分析来表征心脏的pH分布,如组织Pi信号中的异质化学变化所证明的那样。
逆行灌注的小鼠心脏(Langendorff心脏)17,18,19是完整跳动心脏的离体模型。在该模型中,心脏活力和pH值至少保留80分钟20,并且在长期缺血性损伤后显示出恢复的潜力21,22。然而,显微手术过程中的无意变异可能导致心脏组织活力的变异。以前的研究报告了这颗心脏随着时间的推移而恶化19;例如,已经观察到每小时收缩功能降低5%-10%18。三磷酸腺苷(ATP)信号先前已被证明可以报告心肌能量状态和活力23。在这里,我们注意到灌注的心脏可能偶尔会显示出活力水平的无意变化,正如ATP含量所证明的那样,尽管我们有不间断的灌注和氧气供应。我们在这里证明,将LDH和PDH率标准化为心脏的ATP含量可以减少这些速率的心间变异性。
在下面的协议中,我们描述了用于在NMR波谱仪中进行心脏插管,分离和随后灌注的外科手术。值得注意的是,其他旨在分离和灌注小鼠心脏的手术方法已在24,25之前描述。
还描述了用于获取与跳动心脏中的酶速率(使用13 C波谱和超极化[1-13C]丙酮酸)以及心脏活力和酸度(使用31P NMR波谱)相关的数据的方法。最后,解释了测定代谢酶活性以及组织活力和酸度的分析方法。
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Protocol
希伯来大学和哈达萨医学中心的联合伦理委员会(IACUC)批准了动物福利研究方案(MD-19-15827-1)。
1. 克雷布斯-亨赛莱特缓冲液制备
- 实验前一天,准备克雷布斯-亨塞莱特缓冲液(KHB)26的修改版本。最初,将 118 mM NaCl、4.7 mM KCl、0.5 mM 丙酮酸、1.2 mM MgSO 4、25 mM NaHCO3 和 1.2 mM KH 2 PO4 溶解在双蒸 H2O 中。
- 将该混合物用95%/5%O 2 / CO 2气泡20分钟,然后加入1.2mM CaCl2。
- 用HCl或NaOH将缓冲液的pH值调节至7.4。
- 在实验当天,向步骤1.2制备的KHB中加入10mM葡萄糖和72U / L胰岛素。
注意:如Kolwicz等人的工作中所述,将胰岛素添加到灌注缓冲液中26,并与先前的研究报告一致,即胰岛素增加收缩功能27和超极化[13C]碳酸氢盐信号的强度28。
2. 灌注系统制备
- 将200mL KHB的储液器保存在40°C的水浴中,并在心脏灌注前以4L / min的流速用95%/ 5%O 2 / CO2气泡1小时。在整个实验过程中,保持缓冲液不断冒泡。
- 首先,将水浴设置为40°C。 插入 KHB 储液罐。使用蠕动泵(见 材料表)和医用级延长管以 7.5 mL/min 的恒定流速在缓冲储液槽和 10 mm NMR 管之间再循环 KHB。
- 将三根铂金固化硅胶管(内径 3 mm)连接到泵(一根流入管和两根用于 KH 缓冲液的流出管)。将流出和流入管线插入加热的KH缓冲液中。然后,将氧气管插入加热的KH缓冲液中。
- 使用薄聚醚醚酮(PEEK,见 材料表)线使缓冲液和超极化剂在波谱仪孔内流入和流出NMR管。
- 确保温度保持在37-37.5°C。 请按照以下步骤操作。
- 用设置为42°C的加热带包裹流入管(从缓冲液槽到NMR管)。
- 用由波谱仪调节的暖气流加热波谱仪内的NMR管。
- 使用兼容 NMR 的温度传感器(参见 材料表)测量 NMR 管内的温度。温度调节至37-37.5°C。
3. 核磁共振波谱仪的校准和制备
- 在实验当天,将含有1,4-二恶烷的 13C标准样品(材料表)插入波谱仪,并调谐并匹配 13C的NMR探头。然后,获得显示1,4-二恶烷热平衡信号的光谱,章动角为90°。
- 现在将 13C 标准样品换成 31P 标准样品(材料表),该样品在 D2O 中含有 105 mM 的 ATP。
注意:显示热平衡磷酸盐信号的光谱是在章动角为50°的情况下获得的。 - 将流入管、流出管和温度探头插入 10 mm NMR 管中,然后将管插入磁孔。将加热带调节至42°C。
- 获取循环KH缓冲液的31P NMR谱图,用于该实验30分钟,章动角为50°,TR为1.1 s(1,640次采集)。
4. 动物准备、外科手术和核磁共振管中心脏灌注
- 使用气体麻醉系统(材料表)在室内空气中以340mL / min的速度麻醉具有3.3%异氟醚的雄性HSD:ICR(CD-1)小鼠5分钟在诱导室中。
- 使用鼻麻醉用2.9%异氟醚维持全身麻醉。
注意:注意尽量减少动物的疼痛和不适。 - 用胶带固定动物的四肢,确保负踏板疼痛反射,然后腹腔注射300IU肝素钠。
- 用 70% 的酒精彻底润湿小鼠的胸壁和腹部,以确保清洁并避免在手术过程中污染或阻塞头发。
- 在肝素注射后1分钟,用小剪刀切割腹腔的皮肤和肌肉。
- 将弯曲的下颌止血小蚊夹放在剑突和胸部皮肤之间,以抬起胸部并露出横膈膜。穿刺并切开横膈膜的右叶。
- 将胸部切过中线,缩回两侧,然后移除。
- 在心脏左心室注射200 IU肝素钠以防止血液凝固。然后,注射 0.1 mL 冰冷的 0.5 mol/L KCl 以实现心脏骤停,如前所述25。心脏骤停对于能够插管心脏至关重要。
- 识别胸腺,并用剪刀将其取出以露出主动脉。去除残留的肋骨组织。
- 识别主动脉弓,并使用弯曲的镊子在升主动脉周围用 3-0 丝缝线(材料表)打一个松结。向左心室注射 3 mL KHB 以清除主动脉中的血凝块。
- 使用弯曲的镊子将心脏下部缩回,以便更好地观察升主动脉。
- 用22G静脉导管进行 原位 插管(材料表)。在空心区域涂上氰基丙烯酸酯粘合剂,然后进行双缝合。将额外的KH缓冲液注入心脏,并验证其是否流过插管。
- 取出弯曲的镊子。断开心脏与周围内脏的连接,并通过静脉导管用冰冷的KHB(4°C)逆行灌注。
- 通过静脉导管 将 心脏连接到灌注系统的流入管线。用温缓冲液(37-37.5°C)以7.5mL/min的速度开始灌注后,心脏开始自发跳动。
- 用跳动的心脏、流出管和温度探头固定 NMR 管,并插入波谱仪的孔中,确保心脏位于 NMR 探头的中心。
5. 获取心脏能量和pH值的数据
- 以50°的翻转角和1.1秒的TR获取31P光谱约1小时。
6.DNP自旋极化和溶解
- 准备28.5毫克[1-13C]丙酮酸制剂。该配方由纯酸中的11.1 mM至14.0 mM OX063自由基组成。
- 准备 4 mL 溶出培养基。溶出介质由TRIS-磷酸缓冲液组成,其中含有11.2 mM NaH 2 PO 4、38.8 mM Na 2 HPO4、33 mM TRIS和2mM HCl。调整该培养基组成,使得在将28.5mg[1-13C]丙酮酸制剂加入4mL该缓冲液中(在溶出阶段)时,所得溶液的pH值将为7.4。
- 根据制造商的说明(材料表),在溶解-DNP(dDNP)自旋极化装置中进行自旋极化和快速溶解。以94.110 GHz的频率施加微波照射,使[1-13C]丙酮酸制剂在1.45K至1.55K下偏振约1.5小时。
- 将来自 dDNP 装置的 4 mL 超极化培养基与补充超极化溶出介质的含氧良好溶液快速混合,以获得与灌注介质紧密匹配的组合物。
注意:在用14mM超极化[1-13C]丙酮酸进行超极化注射期间,灌注心脏的培养基的最终体积为26mL。注射培养基的最终组成(混合后)含有4.7 mM KCl,1.2 mM MgSO 4,70 mM NaCl,25 mM NaHCO3,1.2 mM KH 2 PO4,10 mM葡萄糖,1.2 mM CaCl2和72 U / L胰岛素。 - 使用连续流动设置将含超极化[1-13C]丙酮酸的培养基施用于分离的心脏29。
注意:这样做是为了确保心脏灌注在实验过程中的任何时候都不会受到干扰,并且超极化培养基以已知的速率和已知的持续时间施用。
7. 超偏振 13C光谱
- 如前所述,使用产品选择性饱和激励脉冲15 通过施加 2.5 ms 基正弦 (Sinc) 脉冲获取超极化 13C 数据。以6秒的间隔连续选择性地激发[1-13C]乳酸和[13 C]碳酸氢盐,以获得每种代谢物的12秒间隔。
- 对于 [1-13C] 乳酸检测,将选择性 Sinc 脉冲集中在 [1-13 C]丙酮酸水合物频率 (179.4 ppm),这导致 [1-13 C] 丙酮酸与 [1-13C] 乳酸的 C1 信号的信号强度比 (lac) 为 0.113。
- 对于 [13C] 碳酸氢盐检测,将选择性 Sinc 脉冲集中在 157.7 ppm,即 [13C] 碳酸氢盐信号 (161.1 ppm) 的下场 214 Hz;这导致 [1-13C] 丙酮酸与 [13 C] 碳酸氢盐的 C1信号的信号强度比 (bic) 为 0.139。
8.组织湿重和体积的测定
- 在实验结束时,将心脏从灌注系统中分离出来,并用薄纸轻轻干燥。随后,称量心脏以获得组织湿重。
- 使用1.05g / cm3的密度因子确定心脏的体积,如先前为小鼠心脏30确定的那样。
9. ATP含量量化
- 整合单次采集ATP标准样品的γ-ATP信号和分离心脏的30分钟采集(TR为1.1秒和1,640次采集)。
- 通过将心脏的γ-ATP信号的积分与标准(材料表)的积分进行比较来量化心脏的ATP含量,其中标准品具有已知的浓度(105 mM),并校正采集和松弛效应的数量。
10.解析心脏的Pi信号
注意:为了评估组织pH值,首先需要将心脏的Pi信号与总Pi信号(Pit)的Pi信号进行反卷积。这是通过省略 KHB Pi (PiKH) 的信号和 Pit 的信号来完成的。
- 在显示单个Pi信号的KHB的31P频谱中(Pi KH,图1A),使用Excel(材料表)将PiKH信号拟合到洛伦兹函数。
- 当样品管不包含心脏时,NMR 探头可见的体积(Vp,1.375 mL)含有更多的 KHB。为了校正这种填充效应,使用方程1A计算衰减缓冲信号(Pib)。
等式 1A
其中Vh 是心脏的体积,如步骤8中确定的。 - 根据方程1B从Pit 中减去该信号,以获得仅从灌注的心脏产生的Pi信号(Pih, 图1B)。
等式 1B
11. 多参数pH分析
- 参考PCr的化学位移,使用公式231将Pih信号化学位移分布转换为pH。
等式 2
其中Δδ是化学位移差,pKa是6.72,δ游离碱是5.69,游离酸是3.27 δ如前所述31。 - 根据Lutz等人32,校正Pih化学位移尺度和pH标度之间的非线性的结果pH分布曲线。该计算得出的典型pH分布如图1C所示。
- 按照Lutz等人的工作,使用七个统计参数使用多参数方法分析组织pH分布。32. 这里列出了其中四个参数,因为它们似乎是对组织pH值最具描述性的:1)总体最大pH值;2)加权平均pH值;3)加权中位pH值;4)pH图的偏度(图1C)。
12. LDH和PDH活动的计算
注意:超极化代谢物[1-13C]乳酸和[13C]碳酸氢盐的产生速率分别用于计算LDH和PDH活性。在产物选择性饱和激发方法15中,每次选择性激发仅检测新合成的超极化代谢物。
- 使用超极化[1-13C]丙酮酸信号作为参考来确定相应的代谢物生产水平。
- 在用超极化介质灌注期间,NMR管中的[1-13C]丙酮酸浓度增加(冲洗),然后平台(最大浓度为14mM),然后降低(冲洗)。
- 为了确定丙酮酸浓度达到恒定水平(平台)的时间点,请使用有效弛豫常数 Teff 校正 [1-13C] 丙酮酸信号,以了解由 T1 弛豫和 RF 脉动引起的信号衰减。
- 对于每次进样,根据其校正[1-13C]丙酮酸衰变曲线以显示该流动动力学的能力来定义Teff(方程3)。
公式 3
其中,在[13 C]碳酸氢盐采集过程中获得的[1-13C]丙酮酸信号。在此描述的实验中发现平均Teff为35.8 s±2.3 s(n = 5个心脏)。 - 选择浓度在最大校正[1-13 C]丙酮酸信号的10%以内的数据点进行进一步分析。
- 使用步骤12.1中选择的时间点的[1-13 C]乳酸和[13C]碳酸氢盐生产的相应数据来计算使用方程4A和方程4B的代谢物产生速率,前提是代谢物信号的SNR大于2(分析阈值)。这种时间点选择的典型示例如图2B(突出显示的时间窗口)所示。
- 使用等式 4A 和等式 4B 计算每个选定数据点的生产率:
等式 4A
等式 4B
其中 和 分别是每个时间点 [1-13C] 乳酸或 [13 C] 碳酸氢盐的生产率。 并且是分别代表[1-13 C]丙酮酸和产物[1-13 C]乳酸或[13C]碳酸氢盐的相对激发的因子。这些因子先前分别确定为 0.113 和 0.13929。Vp是NMR探头检测到的体积(1.375 mL),TR表示两个连续产物选择性饱和激发之间的时间间隔(每个产物12 s), 分别是[1-13 C]乳酸和[13 C]碳酸氢盐的信号,并且是在[1-13 C]乳酸和[13 C]期间获得的[1-13C]丙酮酸的信号和[13C]碳酸氢盐激发,分别。[Pyr]是[1-13 C]丙酮酸浓度,在平台期为14mM。- 确定每个点的速率,然后确定每个超极化注入的平均值。
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Representative Results
从注入KHB的小鼠心脏和仅从缓冲液记录的 31P谱图如图 1A所示。在心脏中观察到α,β和γ-ATP,PCr和Pi的信号。Pi信号由两个主要成分组成:在较高的场(信号的左侧),Pi信号主要是由于pH值为7.4时的KHB;在较低的场(信号的右侧),由于酸性环境较强,Pi信号更宽且更不均匀。后一种模式起源于心脏组织。通过减去KHB的Pi信号(图1B)提取心脏组织Pi信号,然后从ppm标度转换为pH标度(图1C)。通过计算加权平均值、加权中位数、全局最大值和偏度,使用组织 Pi 信号的多参数分析来研究 pH 值(图 1C)。
图 1:典型的 31 P 谱图、KHB 的 Pi 信号与心脏之间的区别、从化学位移到 pH 轴的转换以及 pH 分布的统计参数。 (A)上图显示了从波谱仪中灌注KHB的小鼠心脏获得的典型31P NMR波谱, 而下图显示了仅从KHB获得的频谱。虚线标记的光谱区域在面板B中放大显示。缩写:Pi = 无机磷酸盐;PCr = 磷酸肌酸;ATP = 三磷酸腺苷;ADP = 二磷酸腺苷。(B) 原始光谱以黑色(Pit)显示;虚线仅显示来自缓冲区的 Pi 信号 (Pib)。后者是通过拟合洛伦兹线形,其中心位于Pit信号的相应KHB分量,并在心脏插入后调整探头中的KHB量(根据方程1A)获得的。归因于心脏的Pi信号(Pih)以橙色显示,这是通过从Pit信号中减去Pib信号(根据公式1B)获得的。(C)将(B)所示的Pih信号化学位移分布转换为pH分布和多参数pH分析。化学位移和pH标度之间的非线性如前所述进行了校正32。多参数pH分析的结果用垂直线标记。对于此特定分布,提供了统计参数的值。请点击此处查看此图的大图。
使用超极化产物选择性饱和激发采集方法15,可以对LDH和PDH酶活性进行绝对定量。 图2 总结了该测定所需的采集和处理步骤。 表 1显示了五个不同心脏的ATP含量以及LDH和PDH率。将LDH和PDH活性归一化为每个心脏的ATP含量降低了整个组中LDH和PDH测量的变异性,如 表 1中的酶活性列所示,其以nmol/s/μmol ATP为单位表示。
图 2:[1-13C] 丙酮酸代谢的超极化 13C MRS 处理和分析。 (A) 在将 14 mM 超极化 [1-13 C] 丙酮酸注入灌注小鼠心脏期间,通过产品选择性饱和激发方法获得的代表性 13C NMR 波谱。信号分配:1 = [1-13 C]乳酸 (183.2ppm);2 = [1-13 C]丙酮酸 (171ppm);3 = [13C]碳酸氢盐 (161.1 ppm);* = [1-13C]丙酮酸制剂产生的杂质33.(B)A中显示的超极化信号强度的时间过程。根据T 1衰变和RF脉动调整[1-13C]丙酮酸(灰色)的综合强度,T有效时间常数为32 s(黑色),从而产生基板的预期流动动力学(冲洗,平台,冲洗)。对时间窗口内的数据点进行了进一步分析,其中调整后的[1-13C]丙酮酸信号显示NMR管中丙酮酸浓度恒定且最大[1-13C]丙酮酸浓度(以浅蓝色突出显示)。根据等式4A和等式4B计算选定时间点的LDH和PDH(和)的生产率,然后取平均值。该注射(和)的平均值以nmol/s为单位提供。出于显示目的,相对于[1-13 C]丙酮酸信号,调整后的[1-13C]丙酮酸,[1-13C]乳酸和[13 C]碳酸氢盐分别乘以0.143、10和80。请点击此处查看此图的大图。
心号 | 泛氧脂蛋白(微摩尔) | 低脱氢脱氢率(摩尔/秒) | PDH速率(摩尔/秒) | 乳酸脱氢酶率(纳米尔/秒/微摩尔ATP) | PDH 率 (nmol/s/μmol ATP) |
1 | 0.49 | 7.61 | 0.59 | 15.4 | 1.19 |
2 | 0.25 | 3.66 | 0.32 | 14.42 | 1.26 |
3 | 0.51 | 6.01 | 0.66 | 11.81 | 1.3 |
4 | 0.53 | 9.27 | 1.09 | 17.34 | 2.04 |
5 | 0.64 | 9.38 | 0.6 | 14.77 | 0.94 |
平均值 (标准偏差) | 0.49 (0.13) | 7.19 (2.15) | 0.65 (0.25) | 14.75 (1.78) | 1.35 (0.37) |
标准偏差 % 平均值 | 26.00% | 30.00% | 38.30% | 12.10% | 27.50% |
表1:五个心脏的ATP含量以及LDH和PDH率。 缩写:SD = 标准差;SD % 平均值 = 与平均值的标准偏差的百分比。
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Discussion
我们展示了一种实验装置,旨在研究分离的小鼠心脏模型中的超极化[1-13C]丙酮酸代谢,组织能量和pH值。
方案中的关键步骤如下:1)确保缓冲液的pH值为7.4;2)确保包括缓冲液的所有成分;3)通过注射肝素避免心脏血管中的血液凝固;4)通过降低代谢活动(KCl注射和冰冷缓冲液)避免对心脏的缺血性损害;5)避免在手术的任何时候将气泡引入心脏;6)通过组织的颜色验证主动脉的成功插管,组织的颜色从深红色变为浅粉红色;7)确保一旦心脏移动到温暖的缓冲液,灌注是连续的;8)在心脏旁边的光谱仪中密切监测NMR管内的温度,并将其保持在37°C;9)检查整个测量过程中的磁场均匀性;10)对RF脉冲使用准确和更新的校准。
技术的修改和故障排除
我们注意到本研究中所做的一些修改:1)在手术后用冰冷的KHB开始灌注以保护心脏;2)自始至终对缓冲液pH进行验证,以确保该参数受到控制,并且不是结果变化的来源。这是在使用pH计、pH指示条和 31P光谱上的Pi信号在制备和实验的各个步骤中完成的。
变异性的来源以及如何纠正它们
选择小鼠心脏以适合10毫米NMR管。然而,这种小心脏提供的信号很低,分离和灌注心脏的精细外科手术具有挑战性。总体而言,这导致不同的组织活力和代谢活动。为了解释这种变异性,我们将LDH和PDH的代谢率标准化为ATP含量(即mole / s / ATP)。先前在异种移植乳腺肿瘤切片29中报道了类似使用ATP含量作为参考。这种类型的归一化是有益的,因为它允许与其他研究人员的结果和其他条件进行比较。此外,通过使用从ATP量到组织质量的转换因子,可以得出每组织重量的酶活性(对于发生代谢的组织)。
除了不同分离的心脏制剂(即来自不同动物)之间的差异外,组织Pi(Pih)化学位移在本研究中显示出非均匀分布。Lutz等人32在异种移植肿瘤中证明了类似的非均匀分布,并使用多参数方法分析了该分布。在这项工作中,该方法在灌注的小鼠心脏中实施。我们注意到,Pih 信号可能主要报告细胞内pH值,如前所述16。
不确定性
定量和的一个基本假设是,超极化[1-13C]丙酮酸溶液充满NMR探头检测到的整个体积(Vp,方程4A和方程4B)。超极化[1-13C]丙酮酸溶液流经心脏冠状动脉以填充细胞外和细胞内隔室。因此,假设心脏体积充满超极化溶液的程度与Vp的其余部分相同。
使用超极化产物选择性饱和激发方法15,29,可以独立于代谢物T1的任何变化和酶促反应的可逆性来量化酶活性。该测定具有稳定性,不受T1和激发曲线变化的影响,与曲线下面积分析相比,跨实验室的重现性可能更高,曲线下面积分析取决于每个实验室的特定采集条件和设置。
研究处于有氧和厌氧代谢交汇处的[1-13C]丙酮酸代谢,对于研究缺氧、缺血、再灌注损伤、饥饿和心脏代谢改变(如糖尿病心肌病)具有重要价值。超极化13种C标记的丙酮酸类似物已在临床上进行了34,35,36,37,38,39,40,41,42,43的临床测试,因此,此类研究的结果可能是转化的。最重要的是,我们的方法能够量化整个器官中的细胞内酶活性。
分离的啮齿动物心脏准备以及本研究中涉及的程序和方法将有助于进一步了解各种压力源对心脏功能,能量和新陈代谢的影响,因为该模型中的测量参数仅归因于心脏。与大鼠心脏相反,小鼠心脏适合研究转基因模型。
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Disclosures
没有披露。
Acknowledgments
该项目根据第1379/18号赠款协议获得以色列科学基金会的资助;以色列科学技术部应用和工程科学雅博廷斯基奖学金,直接博士生编号3-15892;以及欧盟根据第 858149 号赠款协议(AlternativesToGd)实施的地平线 2020 研究和创新计划。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
HyperSense DNP Polariser | Oxford Instruments | 52-ZNP91000 | HyperSense, 3.35 T, preclinical dissolution-DNP hyperpolarizer |
NMR spectrometer | RS2D | NMR Cube, 5.8 T, equipped with a 10 mm broad-band probe | |
Peristaltic pump | Cole-Parmer | 07554-95 | |
Temperature probe | Osensa | FTX-100-LUX+ | NMR compatible temprature probe |
Somnosuite low-flow anesthesia system | Kent Scientific | ||
Lines, tubings, suture | |||
Platinum cured silicone tubes | Cole-Parmer | HV-96119-16 | L/S 16 I.D. 3.1 mm |
Thin polyether ether ketone (PEEK) lines | Upchurch Scientific | id. 0.040” | |
Intravenous catheter | BD Medical | 381323 | 22 G |
Silk suture | Ethicon | W577H | Wire diameter of 3-0 |
Chemicals and pharmaceuticals | |||
[1-13C]pyruvic acid | Cambridge Isotope Laboratories | CLM-8077-1 | |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 21074 | CAS: 10043-52-4 |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | CAS: 50-99-77 |
Heparin sodium | Rotexmedica | HEP5A0130C0160 | |
Hydrochloric acid 37% | Sigma-Aldrich | 258148 | CAS: 7647-01-0 |
Insulin aspart (NovoLog) | Novo Nordisk | ||
Isoflurane | Terrel | ||
Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | 793612 | CAS: 7487-88-9 |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | CAS: 7447-40-7 |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | CAS: 7778-77-0 |
Sodium bicarbonate | Gadot Group | CAS: 144-55-8 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9625 | CAS: 7647-14-5 |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 655104 | CAS: 1310-73-2 |
Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S7907 | CAS: 7558-79-4 |
Sodium phosphate monobasic dihydrate | Merck | 6345 | CAS: 13472-35-0 |
TRIS (biotechnology grade) | Amresco | 0826 | CAS: 77-86-1 |
Trityl radical OX063 | GE Healthcare AS | NC100136 | OX063 |
NMR standards | |||
13C standard sample | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-72A | 40% p-dioxane in benzene-D6 |
31P standard sample | Made in house | 105 mM ATP and 120 mM phenylphosphonic acid in D2O | |
Software | |||
Excel 2016 | Microsoft | ||
MNova | Mestrelab Research |
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