JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

Hiperpolarize [1-13 C] Piruvat ve13 C/31P NMR Spektroskopisi ile İzole Perfüze Fare Kalbinde Kardiyak Metabolizmanın İncelenmesi

Published: April 21, 2023
doi:
10.3791/63188
, , , , ,
1Department of Radiology, Hadassah Medical Organization and Faculty of Medicine,Hebrew University of Jerusalem, 2The Wohl Institute for Translational Medicine

Summary

Sürekli perfüzyon modunda hiperpolarize 13C etiketli metabolitin izole perfüze edilmiş bir fare kalbine uygulanması için deneysel bir kurulum tanımladık. Özel bir 13C-NMR edinme yaklaşımı, metabolik enzim aktivitesinin gerçek zamanlı olarak nicelleştirilmesini sağladı ve multiparametrik 31P-NMR analizi, doku ATP içeriğinin ve pH’ının belirlenmesini sağladı.

Abstract

Metabolizma, hücresel yaşamdaki önemli süreçlerin temelidir. Metabolik ağların canlı dokularda nasıl işlediğini karakterize etmek, hastalıkların mekanizmasını anlamak ve tedavileri tasarlamak için çok önemli bilgiler sağlar. Bu çalışmada, geriye dönük olarak perfüze edilmiş bir fare kalbindeki hücre içi metabolik aktiviteyi gerçek zamanlı olarak incelemek için prosedürleri ve metodolojileri açıklıyoruz. Kalp, miyokard iskemisini en aza indirmek için kalp durması ile birlikte in situ olarak izole edildi ve bir nükleer manyetik rezonans (NMR) spektrometresi içinde perfüze edildi. Spektrometrede ve sürekli perfüzyon altındayken, kalbe hiperpolarize [1-13 C] piruvat verildi ve sonraki hiperpolarize [1-13 C] laktat ve [13C] bikarbonat üretim hızları, gerçek zamanlı olarak, laktat dehidrogenaz ve piruvat dehidrogenaz üretim oranlarını belirlemeye hizmet etti. Hiperpolarize [1-13C] piruvat’ın bu metabolik aktivitesi, ürün seçici doygunluk-uyarma edinimi yaklaşımı kullanılarak NMR spektroskopisi ile modelsiz bir şekilde ölçüldü. 31 adet P spektroskopisi, kardiyak enerjileri ve pH’ı izlemek için hiperpolarize edinimler arasında uygulandı. Bu sistem, sağlıklı ve hastalıklı fare kalbindeki metabolik aktiviteyi incelemek için benzersiz bir şekilde yararlıdır.

Introduction

Kardiyak metabolizmadaki değişiklikler çeşitli kardiyomiyopatilerle ilişkilidir ve sıklıkla altta yatan patofizyolojik mekanizmaların temelini oluşturur1. Bununla birlikte, canlı dokulardaki metabolizmayı incelemenin önünde çok sayıda engel vardır, çünkü çoğu biyokimyasal tahlil doku ve hücre lizisinin homojenizasyonunu ve / veya radyoaktif izlemeyi gerektirir. Bu nedenle, canlı dokulardaki miyokard metabolizmasını araştırmak için yeni araçlara acil bir ihtiyaç vardır. Hiperpolarize 13C etiketli substratların manyetik rezonansı (MR), iyonlaştırıcı radyasyon kullanılmadan, etiketli bölgelerin MR sinyal-gürültü (SNR) oranını3 büyüklüğünde birkaç sıra artırarak, canlı dokularda metabolizmanın gerçek zamanlı ölçümlerine izin verir2. Burada, izole edilmiş fare kalbindeki hızlı metabolizmayı incelemek için bir deney düzeneği, bir edinme yaklaşımı ve analitik bir yaklaşım ve paralel olarak genel doku enerjilerinin ve asitliğinin göstergelerini açıklıyoruz. Kardiyak pH değerli bir göstergedir, çünkü asit-baz dengesi kalp hastalıklarının ve miyokard iskemisi, uyumsuz hipertrofi ve kalp yetmezliği gibi durumların erken evrelerinde bozulur6.

Hiperpolarize [1-13 C] laktat ve [13C] hiperpolarize [1-13C] piruvattan bikarbonat üretimi, laktat dehidrogenaz (LDH) ve piruvat dehidrogenaz (PDH) üretim oranlarının belirlenmesinde yardımcı olur. İzole kemirgen kalbindeki hiperpolarize substratlar kullanılarak yapılan önceki çalışmaların çoğu, LDH ve PDH’nin enzimatik aktivitesini elde etmek için karmaşık kinetik modeller kullandı ya da gerçek enzim aktivite oranlarını hesaplamadan hiperpolarize ürünün sinyal yoğunluğu oranlarını bir substrata bildirdi 2,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14. Burada, enzim aktivitesinin modelsiz bir şekilde izlenmesini sağlayan ürün seçici doygunluk-uyarım yaklaşımı 15’i kullandık15,16. Bu şekilde, mutlak enzimatik oranlar (yani, birim zaman başına üretilen ürün mol sayısı) belirlendi. 31 adet P spektroskopisi, inorganik fosfat (Pi), fosfokreatin (PCr) ve adenozin trifosfat (ATP) sinyallerini gözlemlemek için kullanıldı. Kalbin pH dağılımını karakterize etmek için, dokunun Pi sinyalindeki heterojen kimyasal kayma ile gösterildiği gibi, multi-parametrik bir analiz kullanılmıştır.

Geriye dönük olarak perfüze edilmiş fare kalbi (Langendorff kalbi)17,18,19, sağlam atan kalp için ex vivo bir modeldir. Bu modelde, kalp canlılığı ve pH en az 80 dakika 20 boyunca korunur ve uzun süreli iskemik yaralanma21,22 sonrasında iyileşme potansiyeli göstermiştir. Bununla birlikte, mikro-cerrahi sırasında yanlışlıkla değişkenlik, kalpler arasında doku canlılığında değişkenliğe yol açabilir. Önceki çalışmalar, bu kalbin zamanla bozulması hakkında rapor vermiştir19; örneğin, kontraktil fonksiyonda saatte %5-%10’luk bir azalma gözlenmiştir18. Adenozin trifosfat (ATP) sinyalinin daha önce miyokard enerjik durumu ve canlılığı hakkında rapor verdiği gösterilmiştir23. Burada, perfüze edilmiş kalbin, kesintisiz bir perfüzyon ve oksijen kaynağına sahip olmamıza rağmen, ATP içeriğinin gösterdiği gibi, canlılık seviyelerinde bazen kasıtsız değişkenlik gösterebileceğini belirttik. Burada LDH ve PDH oranlarının kalbin ATP içeriğine normalleştirilmesinin, bu oranlardaki kalpler arası değişkenliği azalttığını gösteriyoruz.

Aşağıdaki protokolde, NMR spektrometresinde kalp kanülasyonu, izolasyonu ve bunun sonucunda perfüzyon için kullanılan cerrahi prosedürü açıklamaktayız. Not olarak, fare kalbini izole etmeyi ve perfüzyonu amaçlayan diğer cerrahi yaklaşımlar 24,25’ten önce tanımlanmıştır.

Atan kalpteki enzimatik oranlar (13 C spektroskopisi ve hiperpolarize [1-13C] piruvat kullanılarak) ve kalbin canlılığı ve asitliği (31P NMR spektroskopisi kullanılarak) ile ilgili verileri elde etmek için kullanılan metodolojiler de tanımlanmıştır. Son olarak, metabolik enzim aktivitelerinin ve doku canlılığının ve asitliğinin belirlenmesi için analitik metodolojiler açıklanmaktadır.

Protocol

İbrani Üniversitesi ve Hadassah Tıp Merkezi’nin ortak etik komitesi (IACUC), hayvan refahı için çalışma protokolünü onayladı (MD-19-15827-1). 1. Krebs-Henseleit tampon hazırlama Deneyden bir gün önce, Krebs-Henseleit tamponunun (KHB)26’nın değiştirilmiş bir versiyonunu hazırlayın. Başlangıçta, 118 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 0.5 mM piruvat, 1.2 mM MgSO 4, 25 mM NaHCO3 ve 1.2 mM KH2PO4’ü çift d…

Representative Results

KHB ile perfüze edilmiş bir fare kalbinden ve yalnızca tampondan kaydedilen 31P spektrumları Şekil 1A’da gösterilmiştir. Kalpte α, β ve γ-ATP, PCr ve Pi sinyalleri gözlendi. Pi sinyali iki ana bileşenden oluşuyordu: daha yüksek alanda (sinyalin sol tarafında), Pi sinyali çoğunlukla 7.4’lük bir pH’taki KHB’den kaynaklanıyordu; alt alanda (sinyalin sağ tarafında), Pi sinyali daha asidik ortam nedeniyle daha geniş ve daha az homojendi. İkinci model kalp dokusun…

Discussion

İzole bir fare kalp modelinde hiperpolarize [1-13C] piruvat metabolizmasını, doku enerjilerini ve pH’ı araştırmak için tasarlanmış deneysel bir kurulum gösteriyoruz.

Protokoldeki kritik adımlar şunlardır: 1) tamponun pH’ının 7.4 olmasını sağlamak; 2) tamponun tüm bileşenlerinin dahil edilmesini sağlamak; 3) heparin enjeksiyonları ile kalp damarlarında kan pıhtılaşmasının önlenmesi; 4) metabolik aktiviteyi azaltarak kalbe iskemik hasardan kaçınmak (KCl …

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu proje, 1379/18 sayılı hibe anlaşması kapsamında İsrail Bilim Vakfı’ndan fon aldı; İsrail Bilim ve Teknoloji Bakanlığı’nın Doğrudan Doktora Öğrencileri için Uygulamalı ve Mühendislik Bilimleri Jabotinsky Bursu No. 3-15892 D.S. için; ve Avrupa Birliği’nin 858149 No’lu hibe anlaşması (AlternativesToGd) kapsamındaki Horizon 2020 araştırma ve inovasyon programı.

Materials

Equipment
HyperSense DNP Polariser Oxford Instruments 52-ZNP91000 HyperSense, 3.35 T, preclinical dissolution-DNP hyperpolarizer
NMR spectrometer  RS2D NMR Cube, 5.8 T, equiped with a 10 mm broad-band probe
Peristaltic pump  Cole-Parmer 07554-95
Temperature probe Osensa FTX-100-LUX+ NMR compatible temprature probe
Somnosuite low-flow anesthesia system Kent Scientific
Lines, tubings, suture
Platinum cured silicone tubes Cole-Parmer HV-96119-16 L/S 16 I.D. 3.1 mm 
Thin polyether ether ketone (PEEK) lines Upchurch Scientific id. 0.040”
Intravenous catheter  BD Medical 381323 22 G
Silk suture Ethicon W577H Wire diameter of 3-0
Chemicals and pharmaceuticals
[1-13C]pyruvic acid Cambridge Isotope Laboratories CLM-8077-1
Calcium chloride Sigma-Aldrich 21074 CAS: 10043-52-4
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7528 CAS: 50-99-77
Heparin sodium Rotexmedica HEP5A0130C0160
Hydrochloric acid 37% Sigma-Aldrich 258148 CAS: 7647-01-0
Insulin aspart (NovoLog) Novo Nordisk
Isoflurane Terrel
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich 793612 CAS: 7487-88-9
Potassium chloride Sigma-Aldrich P4504 CAS: 7447-40-7
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P9791 CAS: 7778-77-0
Sodium bicarbonate Gadot Group CAS: 144-55-8
Sodium chloride Sigma-Aldrich S9625 CAS: 7647-14-5
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 655104 CAS: 1310-73-2
Sodium phosphate dibasic Sigma Aldrich S7907 CAS: 7558-79-4
Sodium phosphate monbasic dihydrate Merck 6345 CAS: 13472-35-0
TRIS (biotechnology grade) Amresco 0826 CAS: 77-86-1
Trityl radical OX063 GE Healthcare AS NC100136 OX063
NMR standards
13C standard sample Cambridge Isotope Laboratories DLM-72A 40% p-dioxane in benzene-D6
31P standard sample Made in house 105 mM ATP and 120 mM phenylphosphonic acid in D2O
Software
Excel 2016 Microsoft
MNova Mestrelab Research
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Aquaro, G. D., Menichetti, L. Hyperpolarized 13C-magnetic resonance spectroscopy: Are we ready for metabolic imaging. Circulation. Cardiovascular Imaging. 7 (6), 854-856 (2014).
  2. Schroeder, M. A., et al. Real-time assessment of Krebs cycle metabolism using hyperpolarized 13C magnetic resonance spectroscopy. FASEB Journal. 23 (8), 2529-2538 (2009).
  3. Ardenkjaer-Larsen, J. H., et al. Increase in signal-to-noise ratio of > 10,000 times in liquid-state NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (18), 10158-10163 (2003).
  4. Merritt, M. E., et al. Hyperpolarized C-13 allows a direct measure of flux through a single enzyme-catalyzed step by NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (50), 19773-19777 (2007).
  5. Ball, D. R., et al. Hyperpolarized butyrate: A metabolic probe of short chain fatty acid metabolism in the heart. Magn Reson Med. (5), 1663-1669 (2014).
  6. Khemtong, C., Carpenter, N. R., Lumata, L. L., et al. Hyperpolarized 13C NMR detects rapid drug-induced changes in cardiac metabolism. Magnetic Resonance in Medicine. 74 (2), 312-319 (2015).
  7. Mariotti, E., et al. Modeling non-linear kinetics of hyperpolarized [1-13C] pyruvate in the crystalloid-perfused rat heart. NMR in Biomedicine. 29 (4), 377-386 (2016).
  8. Moreno, K. X., Sabelhaus, S. M., Merritt, M. E., Sherry, A. D., Malloy, C. R. Competition of pyruvate with physiological substrates for oxidation by the heart: implications for studies with hyperpolarized [1-13C]pyruvate. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298 (5), H1556-H1564 (2010).
  9. Purmal, C., et al. Propionate stimulates pyruvate oxidation in the presence of acetate. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 307 (8), H1134-H1141 (2014).
  10. Weiss, K., et al. Developing hyperpolarized 13C spectroscopy and imaging for metabolic studies in the isolated perfused rat heart. Applied Magnetic Resonance. 43 (1), 275-288 (2012).
  11. Merritt, M. E., Harrison, C., Storey, C., Sherry, A. D., Malloy, C. R. Inhibition of carbohydrate oxidation during the first minute of reperfusion after brief ischemia: NMR detection of hyperpolarized 13CO2and H13CO3. Magnetic Resonance in Medicine. 60 (5), 1029-1036 (2008).
  12. Schroeder, M. A., et al. Measuring intracellular pH in the heart using hyperpolarized carbon dioxide and bicarbonate: a 13C and 31P magnetic resonance spectroscopy study. Cardiovascular Research. 86 (1), 82-91 (2010).
  13. Ball, D. R., et al. Metabolic imaging of acute and chronic infarction in the perfused rat heart using hyperpolarised [1-13C]pyruvate. NMR in Biomedicine. 26 (11), 1441-1450 (2013).
  14. Atherton, H. J., et al. Role of PDH inhibition in the development of hypertrophy in the hyperthyroid rat heart: a combined magnetic resonance imaging and hyperpolarized magnetic resonance spectroscopy study. Circulation. 123 (22), 2552-2561 (2011).
  15. Harris, T., et al. Hyperpolarized product selective saturating-excitations for determination of changes in metabolic reaction rates in real-time. NMR in Biomedicine. 33 (2), e4189 (2020).
  16. Shaul, D., et al. Correlation between lactate dehydrogenase/pyruvate dehydrogenase activities ratio and tissue pH in the perfused mouse heart: A potential noninvasive indicator of cardiac pH provided by hyperpolarized magnetic resonance. NMR in Biomedicine. 34 (2), e4444 (2021).
  17. Jian, Z., et al. In vivo cannulation methods for cardiomyocytes isolation from heart disease models. PLoS One. 11 (8), e0160605 (2016).
  18. Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).
  19. Lateef, R., Al-Masri, A., Alyahya, A. Langendorff’s isolated perfused rat heart technique: A review. International Journal of Basic and Clinical Pharmacology. 4, 1314-1322 (2015).
  20. Cross, H. R., Radda, G. K., Clarke, K. The role of Na+/K+ ATPase activity during low-flow ischemia in preventing myocardial injury – A 31P, 23Na and 87Rb NMR spectroscopic study. Magnetic Resonance in Medicine. 34 (5), 673-685 (1995).
  21. Cross, H. R., Clarke, K., Opie, L. H., Radda, G. K. Is lactate-induced myocardial ischaemic injury mediated by decreased pH or increased intracellular lactate. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 27 (7), 1369-1381 (1995).
  22. Clarke, K., O’Connor, A. J., Willis, R. J. Temporal relation between energy metabolism and myocardial function during ischemia and reperfusion. American Journal of Physiology. 253 (2), H412-H421 (1987).
  23. Yabe, T., Mitsunami, K., Inubushi, T., Kinoshita, M. Quantitative measurements of cardiac phosphorus metabolites in coronary artery disease by 31P magnetic resonance spectroscopy. Circulation. 92 (1), 15-23 (1995).
  24. Bakrania, B., Granger, J. P., Harmancey, R. Methods for the determination of rates of glucose and fatty acid oxidation in the isolated working rat heart. Journal of Visualized Experiments. (115), e54497 (2016).
  25. Cordeiro, B., Clements, R. Murine isolated heart model of myocardial stunning associated with cardioplegic arrest. Journal of Visualized Experiments. (102), e52433 (2015).
  26. Kolwicz, S. C., Tian, R. Assessment of cardiac function and energetics in isolated mouse hearts using 31P NMR spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (42), e2069 (2010).
  27. Nakadate, Y., et al. Glycemia and the cardioprotective effects of insulin pre-conditioning in the isolated rat heart. Cardiovascular Diabetology. 16 (1), 43 (2017).
  28. Lauritzen, M. H., et al. Enhancing the C-13 bicarbonate signal in cardiac hyperpolarized 1-C-13 pyruvate MRS studies by infusion of glucose, insulin and potassium. NMR in Biomedicine. 26 (11), 1496-1500 (2013).
  29. Adler-Levy, Y., et al. In-cell determination of lactate dehydrogenase activity in a luminal breast cancer model – ex vivo investigation of excised xenograft tumor slices using dDNP hyperpolarized [1-13C]pyruvate. Sensors. 19 (9), 2089 (2019).
  30. Young, A. A., Barnes, H., Davison, D., Neubauer, S., Schneider, J. E. Fast left ventricular mass and volume assessment in mice with three-dimensional guide-point modeling. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 30 (3), 514-520 (2009).
  31. Bailey, I. A., Williams, S. R., Radda, G. K., Gadian, D. G. Activity of phosphorylase in total global ischaemia in the rat heart. A phosphorus-31 nuclear-magnetic-resonance study. Biochemical Journal. 196 (1), 171-178 (1981).
  32. Lutz, N. W., Le Fur, Y., Chiche, J., Pouyssegur, J., Cozzone, P. J. Quantitative in vivo characterization of intracellular and extracellular pH profiles in heterogeneous tumors: A novel method enabling multiparametric pH analysis. Ricerca sul cancro. 7 (15), 4616-4628 (2013).
  33. Harris, T., Gamliel, A., Sosna, J., Gomori, J. M., Katz-Brull, R. Impurities of [1-13C]pyruvic acid and a method to minimize their signals for hyperpolarized pyruvate metabolism studies. Applied Magnetic Resonance. 49 (10), 1085-1098 (2018).
  34. Cunningham, C. H., et al. Hyperpolarized 13C metabolic MRI of the human heart initial experience. Circulation Research. 119 (11), 1177-1182 (2016).
  35. Kurhanewicz, J., et al. Hyperpolarized 13C MRI: Path to clinical translation in oncology. Neoplasia. 21 (1), 1-16 (2019).
  36. Miloushev, V. Z., et al. Metabolic imaging of the human brain with hyperpolarized 13C pyruvate demonstrates 13C lactate production in brain tumor patients. Ricerca sul cancro. 78 (14), 3755-3760 (2018).
  37. Park, I., et al. Development of methods and feasibility of using hyperpolarized carbon-13 imaging data for evaluating brain metabolism in patient studies. Magnetic Resonance in Medicine. 80 (3), 864-873 (2018).
  38. Grist, J. T., et al. Quantifying normal human brain metabolism using hyperpolarized [1-13C]pyruvate and magnetic resonance imaging. Neuroimage. 189, 171-179 (2019).
  39. Nelson, S. J., et al. Metabolic imaging of patients with prostate cancer using hyperpolarized [1-C]pyruvate. Science Translational Medicine. 5 (198), (2013).
  40. Stødkilde-Jørgensen, H., et al. Pilot study experiences with hyperpolarized [1-13C]pyruvate MRI in pancreatic cancer patients. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 51 (3), 961-963 (2019).
  41. Autry, A. W., et al. Measuring tumor metabolism in pediatric diffuse intrinsic pontine glioma using hyperpolarized carbon-13 MR metabolic imaging. Contrast Media and Molecular Imaging. 2018, 3215658 (2018).
  42. Chung, B. T., et al. First hyperpolarized [2-13C]pyruvate MR studies of human brain metabolism. Journal of Magnetic Resonance. 309, 106617 (2019).
  43. Rider, O. J., et al. Noninvasive in vivo assessment of cardiac metabolism in the healthy and diabetic human heart using hyperpolarized 13C MRI. Circulation Research. 126 (6), 725-736 (2020).

Tags

Keywords: Hyperpolarized MRICardiac MetabolismIsolated Perfused Mouse HeartPyruvate Metabolism13C/31P NMR SpectroscopyKrebs-Henseleit BufferAerobic And Anaerobic MetabolismCardiac EnergeticsPHLactateInorganic PhosphatePerfusion SystemTemperature Control
check_url/it/63188?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Shaul, D., Sapir, G., Lev-Cohain, N., Sosna, J., Gomori, J. M., Katz-Brull, R. Investigating Cardiac Metabolism in the Isolated Perfused Mouse Heart with Hyperpolarized [1-13C]Pyruvate and 13C/31P NMR Spectroscopy. J. Vis. Exp. (194), e63188, doi:10.3791/63188 (2023).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image