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Biologia

과분극 [1-13C] 피루브산 및 13C / 31P NMR 분광법을 사용하여 분리 된 관류 마우스 심장에서 심장 대사 조사

Published: April 21, 2023
doi:
10.3791/63188
, , , , ,
1Department of Radiology, Hadassah Medical Organization and Faculty of Medicine,Hebrew University of Jerusalem, 2The Wohl Institute for Translational Medicine

Summary

우리는 연속 관류 모드에서 과분극된 13C표지 대사산물을 분리된 관류된 마우스 심장에 투여하기 위한 실험 설정을 설명합니다. 전용 13C-NMR 획득 접근법을 통해 대사 효소 활성을 실시간으로 정량화할 수 있었고, 다중모수 31P-NMR 분석을 통해 조직 ATP 함량 및 pH를 측정할 수 있었습니다.

Abstract

신진 대사는 세포 생활에서 중요한 과정의 기초입니다. 생체 조직에서 대사 네트워크가 어떻게 기능하는지 특성화하면 질병의 메커니즘을 이해하고 치료법을 설계하는 데 중요한 정보를 얻을 수 있습니다. 이 연구에서 우리는 역행성 관류된 마우스 심장에서 세포 내 대사 활동을 실시간으로 연구하기 위한 절차와 방법론을 설명합니다. 심장은 심근 허혈을 최소화하기 위해 심정지와 함께 현장에서 분리되었고 핵자기 공명(NMR) 분광계 내부에서 관류되었습니다. 분광계에서 그리고 연속 관류 하에서, 과분극 [1-13 C] 피루브산이 심장에 투여되었고, 후속 과분극 [1-13 C] 젖산 및 [13C] 중탄산염 생성 속도는 실시간으로 젖산 탈수소 효소 및 피루 베이트 탈수소 효소 생산 속도를 결정하는 역할을했습니다. 과분극된 [1-13C]피루브산의 이러한 대사 활성은 생성물 선택적 포화-여기 획득 접근법을 사용하여 모델 자유 방식으로 NMR 분광법으로 정량화되었습니다. 31 P 분광법은 심장 에너지 및 pH를 모니터링하기 위해 과분극 획득 사이에 적용되었습니다. 이 시스템은 건강하고 병든 쥐의 심장에서 대사 활동을 연구하는 데 매우 유용합니다.

Introduction

심장 대사의 변화는 다양한 심근병증과 관련이 있으며 종종 근본적인 병태생리학적 메커니즘의 기초를 형성합니다1. 그러나 대부분의 생화학적 분석에는 조직의 균질화와 세포 용해 및/또는 방사능 추적이 필요하기 때문에 살아있는 조직의 대사를 연구하는 데는 많은 장애물이 있습니다. 따라서 생체 조직에서 심근 대사를 조사하기 위한 새로운 도구가 절실히 필요합니다. 과분극된 13C-표지 기질의 자기 공명(MR)은 표지된 부위의 MR 신호 대 잡음비(SNR) 비율을 몇 배나 증가시킴으로써 이온화 방사선을 사용하지 않고 생체 조직2의 대사를 실시간으로 측정할 수있습니다. 여기에서 우리는 분리된 마우스 심장의 빠른 대사를 연구하기 위한 실험 설정, 획득 접근 방식 및 분석적 접근 방식을 설명하고 동시에 일반적인 조직 에너지 및 산도의 지표를 제시합니다. 심장 pH는 심근 허혈, 부적응 비대, 심부전과 같은 심장 질환 및 상태의 초기 단계에서 산-염기 균형이 깨지기 때문에 중요한 지표이다6.

과분극 [1-13C]젖산염 및 [13C]과분극 [1-13C]피루브산으로부터의 중탄산염 생산은 젖산 탈수소효소(LDH) 및 피루브산 탈수소효소(PDH)의 생성 속도를 결정하는 데 도움이 됩니다. 분리된 설치류 심장에서 과분극된 기질을 사용하여 수행된 대부분의 이전 연구는 LDH 및 PDH의 효소 활성을 도출하기 위해 복잡한 동역학 모델을 사용하거나, 실제 효소 활성률을 계산하지 않고 기질에 대한 과분극 생성물의 신호 강도 비율을 보고했습니다 2,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14. 여기서, 본 발명자들은 생성물 선택적 포화-여기 접근법(15)을 사용하였으며, 이는 모델-없는 방식으로 효소 활성의 모니터링을 가능하게 한다15,16. 이러한 방식으로, 절대 효소 비율 (즉, 단위 시간당 생산 된 생성물의 몰 수)이 결정되었다. 31 P 분광법은 무기 인산염(Pi), 인산(PCr) 및 아데노신 삼인산(ATP)의 신호를 관찰하는 데 사용되었습니다. 조직의 Pi 신호에서 이질적인 화학적 이동에 의해 입증된 바와 같이 심장의 pH 분포를 특성화하기 위해 다중 매개변수 분석이 사용되었습니다.

역행성 관류된 마우스 심장(Langendorff heart)17,18,19은 온전한 박동 심장에 대한 생체 외 모델입니다. 이 모델에서, 심장 생존율 및 pH는 적어도 80분 동안 보존된다20, 그리고 장기간 허혈성 손상 후 회복 가능성을 보여주었다21,22. 그럼에도 불구하고 미세 수술 중 부주의한 가변성은 심장 전체의 조직 생존력에 가변성을 초래할 수 있습니다. 이전 연구에서는 시간이 지남에 따라 이 심장의 악화에 대해 보고했습니다19; 예를 들어, 시간당 5%-10%의 수축 기능 감소가 관찰되었다18. 아데노신 삼인산(adenosine triphosphate, ATP) 신호는 이전에 심근의 에너지 상태와 생존력에 대해 보고하는 것으로 나타났다23. 여기에서 우리는 관류된 심장이 중단 없는 관류 및 산소 공급이 있었음에도 불구하고 ATP 함량에 의해 입증된 바와 같이 때때로 생존 수준에서 의도하지 않은 변동성을 보일 수 있음을 언급했습니다. 우리는 여기에서 LDH 및 PDH 비율을 심장의 ATP 함량으로 정규화하면 이러한 비율의 심장 간 변동성이 감소한다는 것을 보여줍니다.

다음 프로토콜에서는 NMR 분광계에서 심장 캐뉼라 삽입, 분리 및 그에 따른 관류에 사용되는 수술 절차를 설명합니다. 주목할 점은, 마우스 심장을 분리하고 관류하는 것을 목표로 하는 다른 외과적 접근법이 이전에 기술되었다는것이다 24,25.

박동 심장의 효소 속도(13C 분광법 및 과분극[1-13C]피루브산 사용) 및 심장의 생존력 및 산도(31PNMR 분광법 사용)와 관련된 데이터를 수집하는 데 사용되는 방법론도 설명되어 있습니다. 마지막으로, 대사 효소 활성과 조직 생존력 및 산도를 결정하기 위한 분석 방법론을 설명합니다.

Protocol

히브리 대학교와 하다사 메디컬 센터의 공동 윤리 위원회(IACUC)는 동물 복지를 위한 연구 프로토콜(MD-19-15827-1)을 승인했습니다. 1. Krebs-Henseleit 완충액 준비 실험 하루 전에 Krebs-Henseleit 완충액(KHB)26의 수정된 버전을 준비합니다. 처음에, 118 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 0.5 mM 피루브산, 1.2 mMMgSO4, 25 mM NaHCO3, 및 1.2 mM KH2PO4를 이중-증류된…

Representative Results

KHB로 관류된 마우스 심장으로부터 그리고 완충액 단독으로부터 기록된 31P스펙트럼이 도 1A에 제시되어 있다. α-, β-, γ-ATP, PCr 및 Pi의 신호가 심장에서 관찰되었습니다. Pi 신호는 두 가지 주요 구성 요소로 구성되었습니다 : 더 높은 필드 (신호의 왼쪽)에서 Pi 신호는 대부분 pH 7.4의 KHB로 인한 것입니다. 하단 필드(신호의 오른쪽)에서 Pi 신호는 더 산성 환경으로 인해 ?…

Discussion

우리는 분리된 마우스 심장 모델에서 과분극된 [1-13C]피루브산 대사, 조직 에너지 및 pH를 조사하도록 설계된 실험 설정을 보여줍니다.

프로토콜 내의 중요한 단계는 다음과 같습니다: 1) 완충액의 pH가 7.4인지 확인하고; 2) 버퍼의 모든 성분이 포함되도록 하는 것; 3) 헤파린 주사에 의한 심장 혈관의 혈액 응고를 피하십시오. 4) 대사 활성을 감소시킴으로써 심장에 대한 ?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 프로젝트는 보조금 계약 번호 1379/18에 따라 이스라엘 과학 재단으로부터 자금을 받았습니다. 직접 박사 과정 학생을위한 응용 및 공학 과학을위한 이스라엘 과학 기술부의 Jabotinsky 장학금 번호 3-15892 DS; 보조금 계약 No. 858149(AlternativesToGd)에 따른 유럽 연합의 Horizon 2020 연구 및 혁신 프로그램.

Materials

Equipment
HyperSense DNP Polariser Oxford Instruments 52-ZNP91000 HyperSense, 3.35 T, preclinical dissolution-DNP hyperpolarizer
NMR spectrometer  RS2D NMR Cube, 5.8 T, equiped with a 10 mm broad-band probe
Peristaltic pump  Cole-Parmer 07554-95
Temperature probe Osensa FTX-100-LUX+ NMR compatible temprature probe
Somnosuite low-flow anesthesia system Kent Scientific
Lines, tubings, suture
Platinum cured silicone tubes Cole-Parmer HV-96119-16 L/S 16 I.D. 3.1 mm 
Thin polyether ether ketone (PEEK) lines Upchurch Scientific id. 0.040”
Intravenous catheter  BD Medical 381323 22 G
Silk suture Ethicon W577H Wire diameter of 3-0
Chemicals and pharmaceuticals
[1-13C]pyruvic acid Cambridge Isotope Laboratories CLM-8077-1
Calcium chloride Sigma-Aldrich 21074 CAS: 10043-52-4
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7528 CAS: 50-99-77
Heparin sodium Rotexmedica HEP5A0130C0160
Hydrochloric acid 37% Sigma-Aldrich 258148 CAS: 7647-01-0
Insulin aspart (NovoLog) Novo Nordisk
Isoflurane Terrel
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich 793612 CAS: 7487-88-9
Potassium chloride Sigma-Aldrich P4504 CAS: 7447-40-7
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P9791 CAS: 7778-77-0
Sodium bicarbonate Gadot Group CAS: 144-55-8
Sodium chloride Sigma-Aldrich S9625 CAS: 7647-14-5
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 655104 CAS: 1310-73-2
Sodium phosphate dibasic Sigma Aldrich S7907 CAS: 7558-79-4
Sodium phosphate monbasic dihydrate Merck 6345 CAS: 13472-35-0
TRIS (biotechnology grade) Amresco 0826 CAS: 77-86-1
Trityl radical OX063 GE Healthcare AS NC100136 OX063
NMR standards
13C standard sample Cambridge Isotope Laboratories DLM-72A 40% p-dioxane in benzene-D6
31P standard sample Made in house 105 mM ATP and 120 mM phenylphosphonic acid in D2O
Software
Excel 2016 Microsoft
MNova Mestrelab Research
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Riferimenti

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Keywords: Hyperpolarized MRICardiac MetabolismIsolated Perfused Mouse HeartPyruvate Metabolism13C/31P NMR SpectroscopyKrebs-Henseleit BufferAerobic And Anaerobic MetabolismCardiac EnergeticsPHLactateInorganic PhosphatePerfusion SystemTemperature Control
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Shaul, D., Sapir, G., Lev-Cohain, N., Sosna, J., Gomori, J. M., Katz-Brull, R. Investigating Cardiac Metabolism in the Isolated Perfused Mouse Heart with Hyperpolarized [1-13C]Pyruvate and 13C/31P NMR Spectroscopy. J. Vis. Exp. (194), e63188, doi:10.3791/63188 (2023).
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