Summary
Представлен метод оценки экспрессии микроРНК в почках и сыворотке мышей с возрастной почечной недостаточностью методом количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией.
Abstract
МикроРНК (миРНК) представляют собой небольшие, некодирующие РНК, состоящие из 21-25 оснований. Они не переводятся в белки, а скорее работают, чтобы препятствовать функционированию своих целевых мессенджерных РНК (мРНК), дестабилизируя их и нарушая их трансляцию. Хотя были исследованы профили экспрессии миРНК в различных органах и тканях мышей, не было стандартных методов очистки и количественной оценки миРНК почек и сыворотки мыши. Мы установили эффективный и надежный метод извлечения и оценки экспрессии миРНК в сыворотке и почках мышей с возрастной почечной недостаточностью.
Метод использует количественную обратную транскрипцию-полимеразную цепную реакцию (qRT-PCR), и протокол требует шести этапов: (1) подготовка мышей с ускоренным сопротивлением старению 1 (SAMR1) и мышей, склонных к старению (SAMP1); (2) извлечение образцов сыворотки из этих мышей; (3) извлечение образца почки из каждой мыши; (4) извлечение общей РНК (включая миРНК) из образцов почек и сыворотки крови каждой мыши; (5) синтез комплементарной ДНК (кДНК) с обратной транскрипцией из миРНК; (6) проведение qRT-PCR с использованием полученной кДНК.
Этот протокол был использован для подтверждения того, что по сравнению с контрольной группой экспрессия miRNA-7218-5p и miRNA-7219-5p была значительно изменена в почках и сыворотке мышиной модели возрастной почечной недостаточности. Этот протокол также прояснил взаимосвязь между почкой и сывороткой мышиной модели возрастной почечной недостаточности. Этот протокол может быть использован для определения экспрессии миРНК в почках и сыворотке мышей с возрастной почечной недостаточностью.
Introduction
Известно, что экспрессия различных мРНК, которые играют важную роль как в физиологии, так и в заболевании (например, воспаление, фиброз, метаболические нарушения и рак), регулируется миРНК, которые являются короткими, некодирующими РНК, которые вызывают деградацию и ингибируют транскрипцию мРНК1. Поэтому возможно, что некоторые микроРНК могут служить новыми кандидатами-биомаркерами и/или терапевтическими мишенями для различных заболеваний 2,3,4,5. Были проведены исследования профилей экспрессии миРНК в различных органах и тканях мышей (включая мозг6, сердце7, легкие8, печень9 и почки10). Однако не существует стандартных или установленных методов извлечения и оценки миРНК в почках или сыворотке мышей с возрастной почечной недостаточностью.
Поэтому мы установили протокол, который можно использовать для надежной очистки и обнаружения экспрессии миРНК в сыворотке и почках мышей с возрастной почечной недостаточностью. Протокол состоит из шести основных этапов: (1) подготовка как 50-недельных самцов мышей SAMR1, так и самцов мышей SAMP1; (2) извлечение образцов крови из нижней полой вены обоих штаммов мышей с последующим использованием шпицевой трубки с гепарином с последующим центрифугированием для получения образца сыворотки; (3) извлечение образца почки из мышей - гомогенизатор кремния используется для гомогенизации образца почки отдельно, и образец затем переносят в систему измельчения биополимеров на спиновой колонке11 микроцентрифуги; (4) извлечение общей РНК (содержащей миРНК) из образцов сыворотки с использованием спиновой колонки12 на основе мембраны кремнезема и полной РНК, содержащей миРНК, экстракции из образцов почек с использованием спиновой колонки11 на основе мембраны кремнезема; (5) синтез комплементарной ДНК (кДНК) из общей РНК с использованием обратной транскриптазы, поли(А) полимеразы и олиго-dT праймера13,14; и (6) наконец, определение экспрессии миРНК с помощью qRT-PCR и интеркалирующего красителя13,14.
Этот новый протокол был основан на исследованиях, которые преуспели в извлечении и оценке микроРНК в различных типах тканей 11,12,13. Было продемонстрировано, что система измельчения биополимеров протокола способна очищать высококачественную общую РНК из тканей11. Точность и чувствительность аспектов этого протокола, используемых для оценки экспрессии миРНК методом qRT-PCR с интеркалирующим красителем, были установлены 13,14, например, синтез кДНК с обратной транскриптазой, поли(А)полимеразой и олиго-dT праймерами из экстрагированной общей РНК. Новый протокол имеет ряд преимуществ: простоту, экономию времени и снижение технических ошибок. Таким образом, он может быть использован для исследований, которые требуют точной и чувствительной идентификации профилей миРНК почек и сыворотки. Исследования многих патологических состояний также могут использовать новый протокол.
Профили экспрессии миРНК у мышей SAMP1, которые являются моделью возрастной почечной недостаточности, могут быть определены, как показано ниже. У человека возрастно-зависимая почечная недостаточность связана с прогрессированием почечной недостаточности и характеризуется как увеличением площади почечного интерстициального фиброза, так и прогрессированием гломерулосклероза15,16. Возрастная почечная недостаточность также является важной и частой особенностью хронической болезни почек и терминальной стадии почечной недостаточности15,16.
Protocol
Экспериментальный протокол был одобрен Комитетом по этике животных Медицинского университета Джичи и выполнен в соответствии с Руководством Медицинского университета Джичи для лабораторных животных и его руководящими принципами, касающимися использования и ухода за экспериментальными животными. Этот протокол использует четырех 50-недельных самцов мышей SAMR1 и самцов мышей SAMP1 (40-45 г).
1. Отбор образцов сыворотки
- Подготовьте для каждой мыши следующее: иглы 30 г со шприцем 1,0 мл, центрифугированную трубку шпица 1,0 мл с гепарином, микроцентрифужные трубки 1,5 мл, анестетик изофлуран, пробковый лист, 70% этанол, два ватных тампона, смоченных фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS), чашку Петри с PBS, пинцет и хирургические ножницы.
- Обезболивают мышь 1,5% изофлураном и поддерживают на уровне 1,5%. Введите анальгетик (Мелоксикам 5 мг/кг) подкожно, затем введите 1,0 мл 70% этанола в брюшную полость и поместите его в лежачее положение на пробковом листе.
- Подтверждают глубину анестезии исчезновением рефлекса снятия педали. Пинцетом и хирургическими ножницами разрезают кожу живота. Отрежьте мышцы и брюшинную оболочку от мочевого пузыря до нижнего левого края ребер.
- Используйте пинцет, чтобы поднять перитонеальную мембрану, и сделайте боковой разрез в верхнем крае перитонеальной мембраны хирургическими ножницами. Продолжайте разрез вдоль нижнего края ребер.
- Определите нижнюю полую вену с помощью двух увлажненных PBS ватных тампонов. Вставьте одну из игл 30 Г со шприцем 1,0 мл в нижнюю полую вену, а затем потяните шприц. Медленно вытащите иглу из нижней полой вены, чтобы избежать гемолиза. Перенесите кровь в 1,0 мл шпицевой трубки с гепарином, а затем перемешайте ее, перевернув трубку несколько раз.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мышь подвергается эвтаназии при вывихе шейки матки. - Раскрутите трубку шпица при комнатной температуре (RT), 3000 × г в течение 10 мин.
- Медленно аспирируйте супернатант, убедитесь, что он не содержит осадка, а затем перенесите его в неиспользуемую микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл.
- Храните тюбик при температуре −80 °C перед использованием.
ПРИМЕЧАНИЕ: При немедленном переходе к этапу 3 трубку нет необходимости хранить при температуре −80 °C.
2. Забор проб почек
- Приготовьте для каждой мыши следующее: криотрубки объемом 2,0 мл, анестетик изофлуран, пробковый лист, 70% этанола, чашку Петри с PBS, пинцет и хирургические ножницы.
- Обезболивают мышь 1,5% изофлураном и поддерживают на уровне 1,5%. Введите анальгетик (Мелоксикам 5 мг / кг) подкожно, затем введите 1,0 мл 70% этанола в его брюшную полость и поместите его в лежачее положение на пробковом листе.
- Подтверждают глубину анестезии исчезновением рефлекса снятия педали. Используйте пинцет и хирургические ножницы, чтобы сделать разрез в коже живота. Отрежьте мышцы и брюшинную оболочку от мочевого пузыря до нижнего левого края ребер.
- Используйте пинцет, чтобы поднять перитонеальную мембрану и сделать боковой разрез в верхнем крае брюшинной мембраны хирургическими ножницами. Продолжайте разрез вдоль нижнего края ребер.
- Определите левую почку. Рефлюкс его с PBS для промывки крови из сосудов до тех пор, пока почка не приобретет желтовато-белый цвет. Сначала иссекните всю почку с помощью хирургических ножниц, чтобы разорвать левую почечную артерию и вену. Поместите почку в чашку Петри и тщательно вымойте ее с помощью PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мышь подвергается эвтаназии при вывихе шейки матки. - Используйте пинцет и хирургические ножницы, чтобы разрезать почку на образцы 10 мг (10 мг - подходящий размер образца для следующего этапа). Поместите каждый образец почки в свою собственную криотрубу объемом 2,0 мл. Закройте крышку трубки.
- Для длительного хранения переложите каждую криотрубу в жидкий азот и храните ее при −80 °C.
3. Полное извлечение РНК из образца сыворотки
- Сначала подготовьте следующие продукты: вихревой смеситель, реагент лизиса на основе фенола/ гуанидина, 80% этанол, 100% этанол, 100% хлороформ, спиновые колонки биополимера (в коллекторных трубках2,0 мл 11), мембранно-закрепленные спиновые колонны (в трубках сбора11 2,0 мл), промывочный буфер No 1 (т.е. буфер промывки, содержащий гуанидин и 100% этанол в соотношении 1:2), буфер промывки No 2 (т.е. промывочный буфер, содержащий гуанидин и 100% этанол в соотношении 1:4), воду без РНКазы, микроцентрифужные трубки 1,5 мл и микроцентрифужные трубки 2,0 мл.
- Сначала возьмите образец сыворотки объемом 200 мкл в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл, а затем добавьте 1000 мкл реагента лизиса на основе фенола / гуанидина. Вихрь смеси в течение 5 с.
- Инкубируйте образец на RT в течение 5 мин.
- Добавьте 200 мкл хлороформа к образцу сыворотки в пробирке и плотно закройте крышку пробирки. Инвертируйте пробирку 15x, чтобы смешать хлороформ и образец сыворотки.
- Каждый образец инкубируется на RT в течение 3 мин. Затем открутите образец при 4 °C в течение 15 мин при 12 000 х г.
- Перенесите 300 мкл супернатанта в новую микроцентрифужную трубку емкостью 1,5 мл, не нарушая гранулу. Добавьте 450 мкл 100% этанола и вращайте трубку в течение 5 с.
ПРИМЕЧАНИЕ: На всех следующих этапах поместите мембранно-закрепленную спиновую колонну для разделения РНК и ДНК в пробирку для сбора 2,0 мл, чтобы центрифугировать ее. - Затем извлеките 700 мкл образца, загрузите его на спиновую колонну с мембранным креплением и закройте колпачок. Раскрутите колонку при RT в течение 15 с при 8000 × g и оставьте супернатант в колонке. Выбросьте гранулы, оставшиеся в коллекционной трубке.
- Добавьте 700 мкл промывочного буфера No1, который является частью набора сыворотки/плазмы (см. Таблицу материалов) в мембранную спиновую колонну для тщательной очистки образца. Закройте крышку столбца и раскрутите столбец на RT в течение 15 с при 8000 × g, и оставьте супернатант в столбце. Выбросьте гранулы, оставшиеся в коллекционной трубке.
- Для удаления следов солей возьмите 500 мкл промывочного буфера No2 и загрузите его на мембранно-закрепленную спиновую колонну. После закрытия колпачка колонки раскрутите колонку на RT в течение 15 с при 8000 × g и оставьте супернатант в колонке. Выбросьте гранулу в коллекционную трубку.
- Для удаления следов солей возьмите 500 мкл 80% этанола и загрузите его на мембранную спиновую колонну. После закрытия колпачка колонки раскрутите колонку на RT в течение 15 с при 8000 × g и оставьте супернатант в колонке. Выбросьте гранулу в коллекционную трубку.
- Снова раскрутите спиновую колонну с мембранным креплением при RT в течение 5 мин при 15 000 × г.
- После переноса спиновой колонны с мембранным креплением в новую коллекторную трубку объемом 1,5 мл добавьте в колонну 14 мкл войны без РНКазы, чтобы растворить общую РНК. После закрытия крышки колонны подождите 5 мин, оставив трубку на RT. Снова вращайте колонну в течение 1 мин при 15 000 × г при RT.
- Храните пробирки с образцами при температуре −80 °C перед использованием.
4. Извлечение общей РНК из образца почки
- Сначала подготовьте следующие продукты: гомогенизатор кремния, лед, вихревой смеситель, 100% этанол, 100% хлороформ, спиновые колонки биополимера (в коллекторных трубках2,0 мл 11), спиновые колонны с мембранным креплением (в трубках сбора2,0 мл 11), реагент лизиса на основе фенола / гуанидина, промывочный буфер No 1 (тот же буфер, что и на этапе 3.1.), буфер промывки No 2 (тот же буфер, что и на этапе 3.1.), буфер для промывки No 2 (тот же буфер, что и на этапе 3.1.), Вода без РНКазы, микроцентрифужные трубки объемом 1,5 мл и микроцентрифужные трубки объемом 2,0 мл.
- Поместите образец почки 10 мг в гомогенизатор кремния и добавьте 700 мкл реагента лизиса на основе фенола / гуанидина.
- Настройте гомогенизатор. Осторожно надавите и скрутите пестик гомогенизатора к образцу почки, чтобы гомогенизировать образец. Продолжайте прессовать и скручивать пестик до тех пор, пока образец почки не будет полностью гомогенизирован в реагенте лизиса на основе фенола / гуанидина.
- Для дальнейшей гомогенизации берут гомогенизированный лизат (в пробирке для сбора 2,0 мл) и переносят его в спиновую колонну биополимера.
- Центрифугировать гомогенизированный лизат на RT в течение 3 мин при 14 000 × г , а затем перенести всю осажденную гранулу в неиспользуемую микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл для инвертирования осажденной гранулы
- Смешать гранулу со 140 мкл хлороформа в пробирке; затем плотно закройте крышку трубки. Переверните трубку 15x, чтобы смешать лизат и хлороформ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хлороформ можно безопасно использовать без капюшона. - Инкубировать образец на RT в течение 2-3 мин. Центрифугирование образца при 4 °C в течение 15 мин при 12 000 × г.
- Перенесите супернатант (который обычно составляет ~300 мкл) в новую микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл, не нарушая осадок. Добавьте в 1,5 раза больше его объема (который обычно составляет ~ 450 мкл) 100% этанола. Вихрь смеси в течение 5 с.
ПРИМЕЧАНИЕ: На всех следующих этапах поместите мембранно-закрепленную спиновую колонну для разделения РНК и ДНК в пробирку для сбора 2,0 мл, чтобы центрифугировать ее. - Загрузите 700 мкл образца на одну из спиновых колонн с мембранным креплением. Закройте колпачок и центрифугируйте колонну при 15 000 × g в течение 15 с. Выбросьте осажденный лизат, оставшийся в сборной трубке.
- Добавьте 700 мкл промывочного буфера No1 в отжимную колонну, чтобы тщательно промыть ее. Закройте колпачок и центрифугируйте колонну при 15 000 × g в течение 15 с. Выбросьте осажденный лизат, оставшийся в сборной трубке.
- Для удаления следовых количеств соли загрузите 500 мкл промывочного буфера No2 на мембранно-закрепленную спиновую колонну. После закрытия колпачка колонны центрифугируют колонну при 15 000 × g в течение 15 с. Выбросьте осажденный лизат в сборную трубку.
- Повторите шаг 4.11.
- Центрифугировать мембранно-закрепленную спиновую колонну снова в течение 1 мин при 15 000 × г. Выбросьте осажденный лизат в сборную трубку.
- Возьмите отжимную колонну с мембранным креплением и перенесите ее в новую трубку для сбора 1,5 мл. Добавьте 30 мкл воды без РНКазы в столб, чтобы растворить общую РНК. После закрытия колпачка колонны подождите 5 мин с трубкой на RT, а затем центрифугируйте колонну в течение 1 мин при 15 000 × г.
- Перенесите общий объем образца, содержащего общую РНК, в новую микроцентрифужную трубку. Поместите трубку на лед и измерьте общую концентрацию РНК с помощью спектрофотометрии. Убедитесь, что общая концентрация РНК составляет ~300-1 500 нг/мкл.
- Храните пробирки, содержащие образцы, при температуре −80 °C перед использованием.
5. Синтез кДНК с обратной транскрипцией общей РНК в сыворотке крови
ПРИМЕЧАНИЕ: Минимальная информация для публикации количественных экспериментов ПЦР в реальном времени (MIQE) рекомендует использовать лучшие экспериментальные практики для получения надежных, однозначных результатов17. В этом протоколе кДНК синтезируется из общей РНК, очищенной в двухэтапной процедуре с использованием обратной транскриптазы, поли(А) полимеразы и олиго-dT праймеров.
- Сначала подготовьте следующий: вихревой смеситель, термоциклер, восьмилуночные ленточные трубки, колпачок каждой восьмиполосной трубки, дистиллированную воду, лед, набор обратной транскриптазы (см. Таблицу материалов)13,14 в расплавленном состоянии и 1,5 мл микроцентрифужных трубок.
- Запустите термоциклер.
- Приготовить раствор мастер-микса; для получения в общей сложности 8,0 мкл мастер-смеси на восьмилуночную полосную трубку добавляют 2,0 мкл смеси обратной транскриптазы (входит в комплект) и 2,0 мкл 10-кратной смеси нуклеиновых кислот к 4,0 мкл буфера обратной транскрипции в микроцентрифужной трубке объемом 1,5 мл.
- Поместите 8,0 мкл раствора основной смеси в каждую трубу восьмискважинной ленточной трубы.
- Поместите 12 мкл аликвоты общей РНК в каждую трубку восьмилуночной полосчатой трубки и закройте крышку трубки. Центрифугирование трубки в течение 15 с при РТ и 2000 × г.
- Поместите трубку в термоциклер и инкубируйте в течение 60 мин при 37 °C. Инкубируют образец в течение дополнительных 5 мин при 95 °C мин для синтеза кДНК.
- После инкубации перенесите кДНК в новую микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл. Разбавьте кДНК десятикратно (1:10) дистиллированной водой. Вихрь и центрифуга трубки в течение 5 с при РТ и 2000 × г.
- Храните разбавленную кДНК временно на льду. Храните разбавленные образцы при температуре −80 °C перед использованием.
6. Синтез кДНК с обратной транскрипцией общей РНК в почках
ПРИМЕЧАНИЕ: Руководящие принципы MIQE поощряют более совершенную экспериментальную практику для обеспечения надежных и недвусмысленных результатов17. Этот протокол использует обратную транскриптазу, поли(А) полимеразу и олиго dT праймеры для синтеза кДНК из 1,0 мкг очищенной общей РНК в двухэтапной процедуре.
- Сначала подготовьте следующее: вихревой смеситель, тепловой циклер, микроцентрифужные трубки объемом 1,5 мл, восьмискважинные ленточные трубки, крышку каждой восьмиполосной трубки, дистиллированную воду, лед и комплект обратной транскриптазы (см. Таблицу материалов)13,14 в расплавленном состоянии.
- Запустите термоциклер.
- Приготовить раствор мастер-микса; для получения в общей сложности 8,0 мкл раствора мастер-микса на пробирку добавляют 2,0 мкл смеси обратной транскриптазы, входящей в комплект, и 2,0 мкл 10-кратной смеси нуклеиновых кислот к 4,0 мкл буфера обратной транскрипции.
- Добавьте 8,0 мкл раствора основной смеси в каждую трубу восьмилуночной ленточной трубы.
- Отрегулируйте общую плотность РНК следующим образом. Для отделения 1,0 мкг общей РНК от образца почки с 12 мкл рваазной воды берут подходящее количество общей РНК и переносят ее в дистиллированную воду, используя концентрацию, измеренную, как описано выше (на этапе 4.15.).
ПРИМЕЧАНИЕ: При наличии загрязнения ДНК загрязненная ДНК совместно амплодируется с помощью qRT-PCR. - Выполните тот же процесс, что и описанный выше в шагах 5.5.-5.8.
7. qRT-PCR миРНК
ПРИМЕЧАНИЕ: Для qRT-ПЦР миРНК используется интеркаляторный метод. Для РНК используются праймеры: U6 малый ядерный 2 (RNU6-2), miRNA-223-3p, miRNA-423-5p, miRNA-7218-5p и miRNA-7219-5p.
- Подготовьте следующее: вихревой смеситель, систему ПЦР в режиме реального времени, реакционную пластину с 96 лунками для qRT-PCR, клейкую пленку для реакционной пластины с 96 лунками, аппликатор клейкой пленки, ротор центрифуги с 96 лунками, праймеры, специфичные для миРНК, набор ПЦР на основе зеленого красителя, содержащий 2-кратную главную смесь ПЦР и 10-кратную универсальную грунтовку (см. Таблицу материалов)13,14, и микроцентрифужная трубка объемом 1,5 мл.
- После смешивания их в микроцентрифужной трубке объемом 1,5 мл вихрь: 6,25 мкл дистиллированной воды, 1,25 мкл каждого из 5 мкМ праймера миРНК, растворенного в воде без нуклеазы, 12,5 мкл 2x ПЦР-мастер-смеси и 2,5 мкл 10x универсального праймера.
- Подготовьте и расплавьте синтезированную кДНК, как описано на этапе 5 (сыворотка) или этапе 6 (почка). Вихрь и центрифугирование кДНК в течение 5 с.
- Возьмите 22,5 мкл аликвот реагента (как описано в шаге 7.2. выше) и поместите их отдельно в каждую лунку 96-луночной пластины.
- Добавьте 2,5 мкл аликвоты кДНК к каждой лунке пластины.
- Чтобы закрепить клейкую пленку на пластине, используйте аппликатор клейкой пленки. Центрифугирование пластины в течение 30 с при 1000 х г в 96-луночном центрифужном роторе. Стабилизируйте реакцию на дне каждой скважины.
8. Использование системы и программного обеспечения ПЦР в режиме реального времени для запуска программы цикличности ПЦР
- Запустите систему ПЦР в режиме реального времени. Поместите созданную пластину, как описано в шаге 7.6. в системе ПЦР реального времени. Измените настройки; укажите название эксперимента, а затем выберите 96-луночную скважину (0,2 мл) в качестве типа эксперимента системы, сравнительную КТ (ΔΔCT) в качестве метода количественного определения, стандартную в качестве режима работы системы и зеленые реагенты SYBR в качестве реагентов для обнаружения целевой последовательности.
- Укажите имена для образца и целевых миРНК, а также назовите образец и целевую миРНК в каждой лунке. Назначьте дубликаты образцов для получения данных, пригодных для подтверждения результатов, и выберите эталонный образец и эндогенный контроль. Чтобы краситель использовался в качестве пассивного эталона, выберите «Нет». Для устранения перекрестного загрязнения реагентов настройте отрицательную обратную транскриптазу и нешаблонный контроль экспрессии миРНК.
- Затем убедитесь, что объем реакции установлен на 20 мкл , а условия цикла ПЦР установлены следующим образом: 95 °C в течение 15 мин, затем 40 циклов денатурации при 94 °C в течение 15 с, отжиг при 55 °C в течение 30 с и, наконец, удлинение при 70 °C в течение 30 с.
- Нажмите на анализ в программном обеспечении системы, чтобы проанализировать данные qRT-PCR после завершения процесса. Убедитесь, что пороговая линия, автоматически выбранная программой, подходит для каждой скважины.
- Проверьте значение порогового цикла (КТ) эндогенного контроля и целевых микроРНК, проанализированных в каждом образце. Определите значения КТ по пересечению кривой усиления и пороговой линии.
ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем исследовании RNU6-2 и miRNA-423-5p использовались в качестве эндогенных элементов контроля для уровней экспрессии целевой миРНК, а метод ΔΔCT использовался для определения относительных уровней экспрессии каждой целевой миРНК18.
Representative Results
Для мышиной модели с возрастными нарушениями почек мы использовали 50-недельных самцов мышей SAMP1 весом 40-45 г. Примерно 0,8 мл крови было собрано на одну мышь и перенесено в 1,0 мл шпицевой трубки с гепарином, инвертированной и центрифугированной. Каждую почку промывали PBS, рассекали и хранили в жидком азоте для дальнейшего анализа. Пятидесятинедельные мыши SAMR1 служили в качестве контроля. Основываясь на данных миРНК qRT-PCR, полученных с использованием этой возрастно-зависимой модели почечной недостаточности, мы наблюдали, что уровень miRNA-7219-5p в почках был значительно повышен, а уровень miRNA-7218-5p в почках значительно снизился у мышей SAMP1 по сравнению с контрольной группой (рисунок 1). Сывороточные уровни как miRNA-7219-5p, так и miRNA-7218-5p были значительно увеличены у мышей SAMP1 по сравнению с контрольной группой (рисунок 2). Уровни экспрессии miRNA-223-3p не изменялись ни в одном штамме, а также между почками и сывороткой (Рисунок 1 и Рисунок 2).
Рисунок 1: Дифференциально экспрессированные микроРНК в почках мышей SAMP1. qRT-PCR анализ экспрессии miRNA-223-3p, miRNA-7218-5p и miRNA-7219-5p у мышей SAMR1 (контроль, n = 4) и SAMP1 мышей (n = 4). Данные являются средними ± стандартной погрешности (полосы ошибок); t-тесты использовались для анализа межгрупповых различий; p < 0,05 считалось значимым (*p < 0,05), n.s.: незначимым. Сокращения: miRNA = микроРНК; SAMP1 = мышь, склонная к ускоренному старению; SAMR1 = сопротивление мыши с ускорением старения 1; qRT-PCR = количественная обратная транскрипция-полимеразная цепная реакция. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Дифференциально экспрессированные миРНК в сыворотке мышей SAMP1. qRT-PCR анализ экспрессии miRNA-223-3p, miRNA-7218-5p и miRNA-7219-5p у мышей SAMR1 (контроль, n = 4) и мышей SAMP1 (n = 4). Данные являются средними ± SE (полосы ошибок); t-тесты использовались для исследования существенных различий между группами. *p < 0,05 по t-тесту. Сокращения: miRNA = микроРНК; SAMP1 = мышь, склонная к ускоренному старению; SAMR1 = сопротивление мыши с ускорением старения 1; qRT-PCR = количественная обратная транскрипция-полимеразная цепная реакция Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Discussion
Уровни экспрессии целевых миРНК были успешно определены по вышеописанному протоколу с использованием qRT-PCR. Оценка извлеченных миРНК является важным шагом в получении значимых данных qRT-PCR. Для подтверждения адекватного качества миРНК перед выполнением qRT-PCR следует использовать спектрофотометрию для определения отношения абсорбции при 260 нм к соотношению абсорбции при 280 нм. Может произойти загрязнение ДНК, и/или димеры праймера в каждой скважине реакционной пластины могут присутствовать, если qRT-PCR не обеспечивает ни одной ПЦР-амплификации ожидаемой длины и температуры плавления или если она обеспечивает мономодальную кривую плавления.
Уровни экспрессии MiRNA могут быть оценены несколькими методами, отличными от qRT-PCR, включая северное блотттинг, микрочип и анализы защиты рибонуклеазы. Тем не менее, метод qRT-PCR является чувствительной, точной, простой и воспроизводимой процедурой, которая требует меньшего объема образца, чем те, которые требуются для северного блоттинга и анализов защиты рибонуклеазы19. Поскольку микрочипы могут измерять экспрессию десятков тысяч микроРНК одновременно, их можно использовать для идентификации маркеров миРНК-кандидатов. Данные микрочипов также показывают высокую общую корреляцию с данными, полученными с помощью qRT-PCR20. Однако не было достигнуто консенсуса относительно оптимальной методологии сравнения данных микрочипов, полученных в различных исследованиях21.
Оценка сывороточных микроРНК имеет следующие особенности. Во-первых, легко собрать сыворотку, и поскольку сывороточные миРНК устойчивы к замораживанию и оттаиванию, температуре и кислоте, миРНК могут быть хорошими биомаркерами. Во-вторых, среди видов высока гомология миРНК, а результаты экспериментов на животных легко экстраполируются на человека. В-третьих, сывороточные миРНК показали потенциал для использования в качестве терапевтических препаратов3. Несколько исследований также продемонстрировали, что уровень экспрессии миРНК в органах коррелирует с миРНК в сыворотке 22,23,24. В настоящем исследовании miRNA-223-3p, уровни в почках которого не показали существенной разницы между мышами SAMR1 и SAMP1, также не показали значимой разницы между штаммами в сыворотке крови. Напротив, miRNA-7218-5p и miRNA-7219-5p, уровни в почках которых показали значительную разницу между мышами SAMR1 и SAMP1, показали значительные различия между штаммами в сыворотке крови.
Этот протокол имеет следующие ограничения. Во-первых, его полезность не была проверена в других органах, таких как печень и легкие, а во-вторых, он не был протестирован на других лабораторных животных, таких как крысы, собаки и свиньи. Несколько исследовательских групп использовали этот протокол для очистки и обнаружения миРНК с помощью qRT-PCR и сообщили, что этот протокол позволил очистить высококачественную РНК из тканей и сыворотки 13,14,22,23,24. Было продемонстрировано, что этот метод обладает высокой точностью и чувствительностью для обнаружения экспрессии миРНК 13,14,22,23,24. Результаты настоящего исследования показывают, что этот протокол может успешно обнаруживать экспрессию миРНК в сыворотке и почках мышей. Поэтому протокол может быть использован для определения профилей экспрессии миРНК сыворотки и почек у мышей с различными патологиями. Благодаря простоте протокола, большое количество образцов может быть обработано одновременно. Анализы экспрессии многих микроРНК при различных патологических состояниях почек могут, таким образом, использовать протокол, описанный в настоящем описании.
Есть определенные аспекты протокола, которые следует иметь в виду. Чтобы избежать деградации очищенных миРНК, которая будет происходить при комнатной температуре, миРНК должны храниться на льду. Образцы почек должны быть гомогенизированы до тех пор, пока они полностью не растворятся в реагенте лизиса. Почка мыши содержит значительное количество соединительной ткани, которая нерастворима в реагенте лизиса, и, таким образом, для дальнейшей гомогенизации требуется столбчатый измельчитель. Кроме того, соответствующая эндогенная контрольная миРНК (со стабильной экспрессией среди образцов) должна быть проверена на протяжении всего эксперимента qRT-PCR. Это связано с тем, что интерференция различных веществ во время выполнения этого протокола может изменять уровни экспрессии эндогенных контрольных микроРНК, возможно, ставя под угрозу результаты. В заключение в этой статье описывается протокол qRT-PCR для обнаружения, очистки и оценки экспрессии миРНК в сыворотке и почках мышей с возрастной почечной недостаточностью.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.
Acknowledgments
Никакой.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.0 mL spitz with heparin | Greiner-bio-one | 450534 | |
Buffer RPE (wash buffer #2 containing guanidine and ethanol in ratio of 1:4) | Qiagen | 79216 | Wash buffer 2 |
Buffer RWT (wash buffer #1 containing guanidine and ethanol in ratio of 1:2) | Qiagen | 1067933 | Wash buffer 1 |
MicroAmp Optical 96-well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Adhesive film for 96-well reaction plate |
miRNA-223-3p primer | Qiagen | MS00003871 | 5'-CGUGUAUUUGACAAGCUGAGUU G-3' |
miRNA-423-5p primer | Qiagen | MS00012005 | 5'-UGAGGGGCAGAGAGCGAGACU UU-3' |
miRNA-7218-5p primer | Qiagen | MS00068067 | 5'-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG -3' |
miRNA-7219-5p primer | Qiagen | MS00068081 | 5'-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGA GA-3' |
miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube |
miRNeasy Serum/Plasma kit | Qiagen | 217184 | Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube |
miScript II RT kit (reverse transcription buffer) | Qiagen | 218161 | Reverse transcriptase kit |
miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | Green dye-based PCR kit |
QIA shredder | Qiagen | 79654 | Biopolymer spin columns in a 2.0 mL collection tube |
QIAzol Lysis Reagent (phenol/guanidine-based lysis reagent) | Qiagen | 79306 | Phenol/guanidine-based lysis reagent |
QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument |
QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument software |
RNase-free water | Qiagen | 129112 | |
RNU6-2 primer | Qiagen | MS00033740 | Not disclosed due to confidentiality |
SAMP1 male mice | Nippon SLC Corporation | Not assigned | |
SAMR1 male mice | Nippon SLC Corporation | Not assigned | |
Takara biomasher standard | Takara Bio | 9790B | Silicon homogenizer |
References
- Huang, Y. The novel regulatory role of lncRNA-miRNA-mRNA axis in cardiovascular diseases. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (12), 5768-5775 (2018).
- Yang, C., Dou, R., Yin, T., Ding, J. MiRNA-106b-5p in human cancers: diverse functions and promising biomarker. Biomedicine and Pharmacotherapy. 127, 110211 (2020).
- Lu, T. X., Rothenberg, M. E.
MicroRNA. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (4), 1202-1207 (2018). - McGuire, A., Brown, J. A., Kerin, M. J. Metastatic breast cancer: the potential of miRNA for diagnosis and treatment monitoring. Cancer and Metastasis Reviews. 34 (1), 145-155 (2015).
- Bjorkman, S., Taylor, H. S. MicroRNAs in endometriosis: biological function and emerging biomarker candidates. Biology of Reproduction. 100 (5), 1135-1146 (2019).
- Zhou, C. X., et al. miRNA and circRNA expression patterns in mouse brain during toxoplasmosis development. BMC Genomics. 21 (1), 46 (2020).
- Jing, R., Zhong, Q. Q., Long, T. Y., Pan, W., Qian, Z. X. Downregulated miRNA-26a-5p induces the apoptosis of endothelial cells in coronary heart disease by inhibiting PI3K/AKT pathway. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 23 (11), 4940-4947 (2019).
- Xie, W., et al. miR-34b-5p inhibition attenuates lung inflammation and apoptosis in an LPS-induced acute lung injury mouse model by targeting progranulin. Journal of Cellular Physiology. 233 (9), 6615-6631 (2018).
- Bala, S., et al. Circulating microRNAs in exosomes indicate hepatocyte injury and inflammation in alcoholic, drug-induced, and inflammatory liver diseases. Hepatology. 56 (5), 1946-1957 (2012).
- Ishii, H., et al. MicroRNA expression profiling in diabetic kidney disease. Translational Research. 237, 31-52 (2021).
- Latorre Luque, J. Relevance of the epigenetic regulation exercised by hepatic microRNAs in the fatty liver arena: from the bedside to the bench. , Available from: http://hdl.handle.net/10803/671499 (2019).
- Mastropasqua, R., et al. Serum microRNA levels in diabetes mellitus. Diagnostics (Basel). 11 (2), 284 (2021).
- Gordanpour, A., Nam, R. K., Sugar, L., Bacopulos, S., Seth, A. MicroRNA detection in prostate tumors by quantitative real-time PCR (qPCR). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (63), e3874 (2012).
- Ahn, J. H., Kwak, J., Lee, J. H., Lee, S. S. Efficient and accurate analysis of microRNA using a specific extension sequence. Molecular Biology Reports. 45 (4), 611-619 (2018).
- Denic, A., Glassock, R. J., Rule, A. D. Structural and functional changes With the aging kidney. Advances in Chronic Kidney Disease. 23 (1), 19-28 (2016).
- Weinstein, J. R., Anderson, S. The aging kidney: physiological changes. Advances in Chronic Kidney Disease. 17 (4), 302-307 (2010).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Rajeevan, M. S., Vernon, S. D., Taysavang, N., Unger, E. R. Validation of array-based gene expression profiles by real-time (kinetic) RT-PCR. The Journal of Molecular Diagnostics. 3 (1), 26-31 (2001).
- Chen, Y., Gelfond, J. A., McManus, L. M., Shireman, P. K. Reproducibility of quantitative RT-PCR array in miRNA expression profiling and comparison with microarray analysis. BMC Genomics. 10, 407 (2009).
- Dallas, P. B., et al. Gene expression levels assessed by oligonucleotide microarray analysis and quantitative real-time RT-PCR -- how well do they correlate. BMC Genomics. 6, 59 (2005).
- Petriella, D., et al. miRNA profiling in serum and tissue samples to assess noninvasive biomarkers for NSCLC clinical outcome. Tumour Biology. 37 (4), 5503-5513 (2016).
- Skrzypa, M., et al. miRNA-146a-5p is upregulated in serum and cartilage samples of patients with osteoarthritis. Polski Przeglad Chirurgiczny. 91 (3), 1-5 (2019).
- Farzanehpour, M., et al. Serum and tissue miRNAs: potential biomarkers for the diagnosis of cervical cancer. Journal of Virology Journal. 16 (1), 116 (2019).