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Summary
本プロトコールは、幼虫処理のための自動化されたマイクロ流体プラットフォームと組み合わせたレーザー病変システムを用いて、ゼブラフィッシュ幼虫において組織特異的かつ再現性の高い傷害を誘発する方法を記載する。
Abstract
ゼブラフィッシュの幼虫は、受精後わずか数日後に高い再生能力を有する完全に機能する中枢神経系(CNS)を有する。これにより、この動物モデルは脊髄損傷および再生の研究に非常に有用である。このような病変を誘導するための標準的なプロトコルは、体幹の背部を手動で通過させることである。しかしながら、この技術は広範な訓練を必要とし、追加の組織に損傷を与える。レーザー誘発病変がこれらの制限を回避するためのプロトコルが開発され、訓練を受けていないオペレータであっても、多くの動物上および異なるセッション間での脊髄切除の高い再現性と完全性を可能にした。さらに、組織損傷は、主に脊髄自体に限定され、異なる組織、例えば皮膚、筋肉、およびCNSを損傷することによる交絡効果を減少させる。さらに、脊髄の半血病変が可能である。レーザー損傷後の組織の完全性の保存を改善することで、電気生理学などの追加の分析に必要なさらなる解剖が容易になります。したがって、この方法は、手動では達成できない傷害程度の正確な制御を提供する。これにより、将来、この強力なモデルで新しい実験パラダイムが可能になります。
Introduction
哺乳類とは対照的に、ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は怪我をした後、中枢神経系(CNS)を修復することができます1。脊髄再生のモデルとしてのゼブラフィッシュ幼虫の使用は比較的最近のことである。修復の根底にある細胞および分子のメカニズムを調査することは有益であることが証明されています2。これは、操作の容易さ、短い実験サイクル(毎週新しい幼虫)、組織の光透過性、および幼虫のサイズが小さく、 in vivo 蛍光顕微鏡に理想的であるためである。
脊髄再生の場合、幼虫を使用する2つの追加の利点は、回復の速度、成人の数週間と比較して数日、および手動技術を使用して傷害を誘発することの容易さである。これは、最近の調査を含む多くの研究3,4,5で首尾よく使用されています6,7。全体として、これは有意義なデータ生成の増加、実験プロトコルの高い適応性、および実験コストの削減につながります。受精後5日未満の幼虫の使用はまた、動物研究における3Rの原則に従う動物の使用を減少させる8。
ゼブラフィッシュの幼虫の脊髄損傷後、炎症反応、細胞増殖、神経新生、生存または新たに生成された細胞の移動、機能軸索の再構築、神経プロセス回路および脊椎組織のグローバルリモデリングなど、多くの生物学的プロセスが起こる6,7,9,10.うまくオーケストレーションされるために、これらのプロセスは、様々な細胞型、細胞外マトリックス成分、および生化学的シグナル11、12の間の細かく調節された相互作用を伴う。脊髄のような複雑な組織のこの重要な再編成の詳細を解明するには、正確で制御された実験的アプローチの使用と開発が必要です。
ゼブラフィッシュの脊髄再生を研究するために使用される主要な実験パラダイムは、切除、刺し傷、または凍結傷害によって組織損傷を誘発するために外科的手段を使用することです3,13。これらのアプローチには、マイクロサージャリースキルの特定のトレーニングを必要とするという欠点があり、これは新しいオペレータにとって時間がかかり、短期プロジェクトでの使用を妨げる可能性があります。さらに、それらは通常、周囲の組織に損傷を誘発し、再生に影響を与える可能性がある。
別のアプローチは、化学的に、または遺伝子操作によって細胞損傷を 誘発することです15。後者は、高度に標的を絞ったダメージを与えます。しかしながら、このような技術は、実験を行う前に新しいトランスジェニック魚を生成するために長い準備作業を必要とし、ユニークな細胞型が標的とされるたびに更新される。
したがって、再生における様々な研究に適した標的化が多目的な病変を可能にする方法の必要性がある。解決策は、レーザーを使用して、関心のある組織に局所的な損傷を誘発することである16、17、18、19、20。実際、レーザー誘発組織損傷の使用は、多くの利点を有する脊髄病変を生成するための堅牢なアプローチを提示する。このようなレーザー操作モジュールを搭載した顕微鏡は、細胞アブレーションが発生するカスタマイズされた形状領域を指定することができ、時間的制御のさらなる利点があります。したがって、病変の大きさおよび位置は、あらゆる質問に対処するために適合させることができる。
ほとんどのレーザー病変系に欠けている特徴は、一連の幼虫に対して再現性の高い方法で傷害を誘発する可能性である。ここでは、自動化された幼虫処理のために設計されたマイクロ流体プラットフォームに基づいて、ゼブラフィッシュ幼虫に半自動化された正確で制御された病変を誘導するために、UVレーザーを使用してオリジナルのプロトコルが説明されています21。さらに、ここで提示されたシステムでは、幼虫はガラス毛細血管に挿入され、これはその吻側尾軸の周りに動物の自由回転を可能にする。ユーザーは、幼虫のどちらの側をレーザーに提示するかを選択しながら、蛍光イメージングがレーザービームを正確に標的にし、病変後の損傷を評価することを可能にすることができる。
ここで説明するプロトコルは、半自動ゼブラフィッシュ幼虫イメージングシステムと、UVレーザーを搭載したスピニングディスク(以下、VASTシステムと呼ぶ)と組み合わせて使用されます。しかしながら、プロトコルの要点および技術の主張の大部分は、2光子レーザー走査顕微鏡、UVレーザーを備えたスピニングディスク顕微鏡(FRAPモジュール)、または光操作のためのレーザーモジュールを備えたビデオ顕微鏡を含む、細胞アブレーションが可能なレーザーを搭載したあらゆるシステムに対して有効である。VASTシステムと従来のサンプル処理の主な違いの1つは、後者の場合、96ウェルプレートに積み込む代わりに、ガラスカバースリップ/ガラス底ペトリ皿に低融点アガロースに幼虫を取り付ける必要があることです。
この方法によって提供される利点は、再生プロセス中の細胞および分子メカニズムに関する革新的な研究の機会を開く。さらに、高いデータ品質により、学際的な文脈での定量的調査が可能になります。
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Protocol
すべての動物実験は、英国内務省の承認を得て、その規制に従って、プロジェクトライセンスPP8160052の下で実施されました。このプロジェクトは、エジンバラ大学機関動物管理および使用委員会によって承認されました。実験的解析のために、両性の生後5日までのゼブラフィッシュ幼虫は、以下の利用可能なトランスジェニック系統のうち、以下のトランスジェニック系統について使用した:Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP)、Tg(Xla.Tubb:DsRed)、Tg(betaactin:utrophin-mCherry)、Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s)、およびTg(mnx1:gfp)(トランスジェニックゼブラフィッシュ系統の生成に関する 補足ファイル1 を参照)。自動ゼブラフィッシュ幼虫処理プラットフォームを用いたプロトコルの概略を 図1に示す。この作業で使用されたすべてのカスタムソフトウェア、スクリプト、および詳細な実験プロトコルは、https://github.com/jasonjearly/micropointpy/ で入手できます。
1. サンプル調製
- 受精後5時間で、正しい発生段階の胚を分類する21。死んだ卵や、発達が遅れている胚や発達しすぎの胚を捨てる。
- 受精後3日目(dpf)に、90mmのシャーレに50mLの魚類施設水に2mLの0.4%アミノ安息香酸-エチルメチルエステルを加えて幼虫を麻酔する。フェニルチオ尿素(PTU)で飼育された動物( 材料表を参照)を使用して、皮膚色素沈着が問題である場合、このプロトコルに記載されている3dpf幼虫の脊髄損傷には当てはまりません。
注:この比較的高い麻酔濃度は、レーザー衝撃後の幼虫の動きを防止するために使用される。 - 蛍光レポーター発現について胚をスクリーニングする(補足ファイル1)。
注:脊髄(または他の目的の構造)の蛍光レポーターは、傷害の効率を評価するためにしばしば必要とされる。tg(Xla.Tubb:DsRed)の使用は、脊髄を識別するのに役立ちます。 - 選択した幼虫を96ウェルプレートに移し、VASTシステム( 材料表を参照)で使用するために、ウェルあたり300μLの魚施設水を使用します。90mmペトリ皿の麻酔薬を含む培地を直接使用する。1つの井戸につき1匹の幼虫しか持たないようにしてください。病変した幼虫を収集するために、余分な空の96ウェルプレートを1枚準備する。
注:別のレーザー病変システムを使用する場合は、適切な観察チャンバー内の1%低融点(LMP)アガロースゲルに幼虫をマウントします。
2. 顕微鏡の準備
- アブレーション用のレーザーを含むすべてのシステムコンポーネント(VAST、顕微鏡、レーザー、PC)の電源を入れます。
- ハードウェアが完全に初期化されたら、顕微鏡ソフトウェア、ImageJ/Fiji、Python統合開発環境(IDE)、およびこのプラットフォームを使用している場合は自動ゼブラフィッシュイメージング(VASTシステム)ソフトウェアを起動します( 資料表を参照)。
- 以下の手順に従って VAST ソフトウェアをセットアップします。
- VAST ソフトウェアが起動したら、最初のウィンドウで [ プレート ] を選択し、[ 完了 ] ボタンをクリックします (図 2A)。別の小さな窓がポップアップし、毛細血管が空で清潔かどうかを尋ねます。キャピラリーの画像を見て、内部に気泡がないか確認します。そうでない場合は、[ はい]をクリックします。バブルがある場合は、[ いいえ ]をクリックし、手順2.3.2-2.3.3に従います(図2B)。
- [ラージパーティクル(LP)サンプラー]ウィンドウで、[ プライム ]をクリックして気泡を除去します(図2C)。
- メインのソフトウェアウィンドウ(キャピラリー画像を含む)に移動し、画像を右クリックします。ポップアップメニュー の[空の毛細血管画像を記録 ]を選択します(図2B)。
- LP サンプラー ウィンドウで、[ファイル] メニューに移動し、[スクリプトを開く] オプションを選択します。実行する実験に対応するスクリプトを含むファイルを選択します。
- VAST ソフトウェアのメイン ウィンドウで、[ ファイル ] に移動し、[ 実験を開く] を選択します。計画した実験に対応する実験ファイルを選択します。
メモ: [自動アンロード] ボックスと [廃棄バルク出力] ボックスがチェックされていないことを確認します。
- イメージング用の顕微鏡ソフトウェアを設定します。
- 顕微鏡イメージングソフトウェア( 材料表を参照)を起動して、ハードウェアを初期化します。システムによっては、この処理に数分かかる場合があります。
- 取得設定に移動し、幼虫に発現する蛍光色素分子をイメージングするための顕微鏡をセットアップします。10x NA 0.5水浸漬対物レンズを使用して、焦点体積が光軸に沿って十分に細長く、脊髄または標的組織の全深さを病変させるようにする。
- レーザー病変用にImageJ/Fijiを設定します。
- [ファイル] メニューに移動し、[新規/スクリプト] を選択してスクリプト ウィンドウを開きます。
- 新規ウィンドウで、[ファイル] メニューに移動し、[開く] を選択してレーザー病変スクリプト (Manual_MP_Operation.ijm) を読み込みます。
- Python IDE をセットアップします。
- Python IDE を起動します。
- [ファイル]メニューに移動し、[ファイルを開く]を選択して、レーザー(Watch_for_ROIs_py3.py)を管理するスクリプトをロードします。
- [実行] メニューに移動し、[デバッグなしで実行] を選択してスクリプトを実行します。レーザアッテネータの初期化中に、TERMINALパネルに一連のメッセージがノイズとともに表示されることを確認します(図2D)。
3. VASTシステムでのレーザー病変の検査
- VASTソフトウェアのメインウィンドウの矢印ボタンをクリックしてステージを移動して、顕微鏡対物レンズに対してキャピラリーを中央に配置します(図2B)。
- 接眼レンズを透視し、顕微鏡の透過光を使用して毛細血管の上部に焦点を合わせます。
警告: 毛細血管は非常に壊れやすく、目標に触れると破損する恐れがあります。顕微鏡のつまみをゆっくりと動かして、ピントを合わせたり外したりします。 - 96ウェルプレートをVASTシステムのLPサンプラーのプレートホルダーに置きます。幼虫を含むプレートを左側のホルダーに置き、収集用のプレートを右側に配置します。プレートの向きが正しいことを確認します。A1 ウェルはホルダーの左前隅にある必要があります。
- VAST ソフトウェアの LP サンプラー ウィンドウで、[ プレート テンプレート] ボタンをクリックし、幼虫を含むすべてのウェルを選択します。[ OK] ボタンをクリックして検証し、ウィンドウを閉じます(図2C)。
- LPサンプラーウィンドウで、 ランプレート ボタンをクリックして幼虫のロードを開始します。
注:しばらくすると、幼虫は毛細血管の位置(実験定義ファイルで事前定義)に見えるようになり、脊髄を傷つけることができます。VASTトレイライトは、数回回転すると消灯し、横側が顕微鏡の対物レンズに面した幼虫を設定します。 - 顕微鏡ソフトウェアに移動し、 ライブ ボタンをクリックして幼虫を画像化します。
- 脊髄中央管が見えるまで顕微鏡のフォーカスノブを回します。
注:最初に透過光を使用して焦点を合わせ、次に蛍光で精製する方が簡単です。 - 蛍光のスナップショットを撮り、画像を専用のフォルダに保存します。
- ImageJ で画像を開き、必要に応じてコントラストを調整します ( ImageJ の [画像/調整/明るさ/コントラスト...] メニューを使用)。
- 関心領域(ROI)線ツールをクリックし、脊髄を中心とする短い線(20μm)を描きます(図3A)。
- 顕微鏡を100%反射ミラーの位置に切り替えます。
- ImageJスクリプトをロードし、[ 実行 ]ボタンをクリックします。次のパラメーターを使用します: 繰り返し - 2;サンプル - 1;幅 - 40ミクロン。減衰 - 89(フルレーザー出力)(図3C)。
- レーザーショットシーケンスが終了したら、イメージングソフトウェアで蛍光イメージングに切り替え、必要に応じてフォーカスを調整します。
注:レーザー露光中の尾部のずれにより、焦点のずれがしばしば観察されます。 - 新しいスナップショットを作成して保存します。
- この新しい画像をImageJで開き、脊髄自体よりも大きく(約80μm)、脊索の上部にある脊髄の腹側の下から始まり、背側に向かって脊髄と皮膚の間の空間で終わる新しい線を描きます(図3B)。
- 顕微鏡を100%反射ミラーの位置に切り替えます。
- ImageJスクリプトウィンドウに移動し、[ 実行 ]ボタンをクリックします。次のパラメーターを使用します: 繰り返し - 2;サンプル - 1;幅 - 40ミクロン。減衰 - 89(フルレーザー出力)。
- (より長い)レーザーショットシーケンスが終了したら、蛍光をイメージングして焦点を合わせることによって、切断品質を検証します。病変部位に細胞または軸索が無傷で残っていないことを確認します(病変部位は暗く、かすかで均質な蛍光領域として表示されます(図3D、下部パネル)。
- 病変した幼虫を空の96ウェルプレート(元のウェルと同じウェル座標)に集めるには、メインのVASTソフトウェアウィンドウに移動して [収集] ボタンをクリックします。
- ウィンドウの左下にある [トレイ ライト] チェック ボックスをクリックして、VAST システム ライト を再びオンにします。
- 負傷する新しい幼虫ごとにステップ3.3-3.17を繰り返します。
4. 病変後の取り扱いと追加実験
- できるだけ早く96ウェルプレートから幼虫を取り出し、幼虫が病変後を回復するための新鮮な魚施設の水を入れたきれいなペトリ皿に移す。ペトリ皿を28°Cのインキュベーターに入れる。
注:損傷は、しばしば病変後最初の1時間で伝播し続ける。したがって、病変の実際の程度は、約1時間の遅延後に蛍光イメージングによって評価されるべきである。
5. トラブルシューティング
- VASTシステムのチューブやキャピラリーに気泡がある場合は、LPサンプラーウィンドウの プライム ボタンをクリックして取り除きます。
- 失敗した病変(予想される残留および均質なバックグラウンドとは別に、病変部位の残りの蛍光から評価される)を考慮すると、これは以下に述べるいくつかの理由に起因する可能性がある。
- 低レーザー出力: このような場合は、より高い値で試してください。
注: VAST システムには色素レーザーが装備されています。これは、レーザー光生成に使用される色素溶液の濃度が時間とともに変化し、レーザー出力の低下につながる可能性があることを意味します。通常、新しいソリューションに置き換えると、問題が解決されます22。 - 不十分なキャリブレーション:このような場合は、ステップ5.2.2.1-5.2.2.4に従ってレーザーシステムのキャリブレーションとパワーを確認します。正しく較正されない場合、レーザーは所望の位置に向けられず、したがって、隣接する組織において病変が失敗または望ましくない損傷をもたらす。
- キャピラリーチャンバーの上にミラースライドを置きます。コーティングされた側に焦点を合わせます(目標に面している必要があります)。スライドの前の既定値を使用して、フォーカスをより簡単にします。
- キャリブレーションスクリプトを使用してレーザーアブレーションのパターンを適用します。
- パターンの品質を評価します。斑点や線は鮮明に見え、ぼやけてはいけません。
- 出力が増大したランプを使用して、レーザー出力が前のセッションと比較して変化したかどうかを評価します。
- 病変中の幼虫の動き:幼虫は麻酔に対して異なる反応を示す。したがって、レーザー病変は、プロセス中に尾の動きを誘発し、したがって、正常な切断を妨げる可能性がある。これが起こったら、周囲の組織への損傷を避けながら、レーザー病変ステップをさらに繰り返して完了させます。
- 焦点が悪い: これが発生した場合は、最良の結果を得るために中央運河の中央に焦点を合わせます。
- ROIの描画、位置、サイズ: ROIの位置とサイズは、トランセクションを成功させるために重要です。ROIは脊髄よりも大きく、脊髄の中心を中心とすべきである。これを解決するには、脊髄の腹側からROIを引き出し始め、背側に向かって上昇して解剖を成功させます。これは、アブレーション処置中のレーザーショットのシーケンスによって引き起こされる尾の動きによる可能性が高い。
- 低レーザー出力: このような場合は、より高い値で試してください。
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Representative Results
脊髄切除の検証
プロトコールが完全な脊髄切除を可能にするかどうかを評価するために、構造的および機能的調査が実施された。
まず、病変部位における蛍光の消失がレーザー照射による蛍光ではなく神経組織損傷によるものであることを確認するために、アセチル化チューブリンに対する抗体を用いた免疫染色( 材料表 及び 補足資料1参照)を行った。病変の尾側と吻側との間の軸索の完全な破壊が観察され、脊髄の完全な切断が確認された(図4B)。脊髄切除が成功した場合、病変部位全体に残りのニューロン突起が残ってはなりません(失敗した病変の例については 図4C を参照)。この技術を用いて、脊髄レーザー病変の成功率は75%(16匹の動物において4つの不完全な切除)と推定された。
レーザー病変後の機能喪失をカルシウムイメージングを用いて調査した。無傷の魚では、自発的に協調したニューロンネットワーク活動が脊髄全体に沿って蛍光ピークを生成する。切除が成功すると、病変の両側間のこの活動の伝播が中断される。脊髄切除の質を制御するために、tg(Xla.Tubb:GCaMP6s)幼虫に対して3dpfでレーザー病変を実施した。新しいマルチウェルプレートで収集した後、幼虫を軽度に麻酔した。低融点アガロースのガラスカバースリップに装着し、損傷後3時間から共焦点顕微鏡で蛍光タイムラプス記録を行った。病変部位の尾側での活性の喪失が観察された。実際、蛍光の定量化は、魚の自発的な活動によるスパイクが傷害後に吻側にのみ存在していたが、無傷の魚の同等の吻側および尾部位置で協調的に発生したことを示している(図4D、E)。損傷後の尾側の低残留信号は、吻側の筋肉収縮によって誘発される尾の動きに反応した感覚ニューロン(おそらく脊髄の尾側のRohon-Beard感覚ニューロン23)の活動によるものと考えられた。
レーザー病変によって誘発される再生プロセス
損傷後24時間後(hpi)、創傷は閉じ始め、48時間後に脊髄の初期構造の部分的な回復をもたらした(図5D)。カルシウムイメージングを用いて、48hpi後に部分的な機能的再接続が確認された(図5E、F)。尾部領域と吻側領域のスパイクの振幅の間の比率(著者らによってConnectivity Restoration Indexと名付けられた)の計算(図5G)は、脊髄再生中に予想されるように、3、24、および48hpiの間の増加を示した。
レーザー病変が免疫応答を引き起こす
マクロファージ(mpeg1:GFP+細胞)の動員は、tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP)幼虫レーザー病変を用いてレーザー病変後に観察された(図5H、I)。これは、ゼブラフィッシュ幼虫における脊髄の再生を成功させるためのマクロファージの不可欠な役割を実証する手動病変を用いた著者らによる以前の研究と一致している6,24。この観察は、レーザー損傷後に免疫反応を研究できることを示し、組織損傷が起こったことを裏付けている。
レーザー病変および手動病変は脊髄における神経新生の増加を引き起こす
これまでの研究では、脊髄損傷後に起こる神経新生を研究するために手動病変を使用してきました6,15。レーザー病変は、この現象を研究するための貴重なツールになる可能性があります。以前に発表された実験では、未病対照と比較して、手動脊髄損傷後の神経新生の増加が示されました15。ここではtg(mnx1:gfp)魚を運動ニューロンとして使用し、蛍光標識した。抗GFP抗体染色は、幼虫におけるGFPの視認性を改善するために使用された。これを、新しく生成されたニューロンにラベルを付けるEdU染色25(補足ファイル1を参照)と組み合わせた。EdUは、3dpfでの傷害の直後に添加され、EdUで標識された任意の細胞が傷害後に生成されたことを意味する。したがって、共局在染色を示す細胞は、脊髄損傷後に生まれる新しい運動ニューロンを表す。損傷部位の両側、または未病変対照における損傷部位の位置およびサイズに対応する領域(2つの50μm窓に捕捉された)における共局在細胞の数をカウントし、共局在細胞の平均数の差を一元配置ANOVA26を用いて分析した。
このプロトコルを、神経新生に対する各病変法の効果を比較するために、手動およびレーザー病変幼虫に対して使用した(図6)。手動病変とレーザー病変の間で標識細胞数に差は認められなかった。病変していない魚は、両方の病変条件下で病変した魚よりも少ない二重標識細胞を示した(図6D)。これは、病変していない魚と比較して、手動で病変した魚の神経新生の増加を示す以前の知見と一致しています15。
これらの結果は、レーザー損傷が手動病変に匹敵する再生応答を惹起するように、カルシウムイメージングおよびアセチル化チューブリン染色の結果を支持する。これは、レーザー病変が単に細胞内の蛍光を漂白しているだけでなく、手動病変と同じ細胞応答を引き起こす傷害をもたらすことを示している。
レーザー病変は、手動病変よりも皮膚および筋肉の損傷が少ない
手作業による病変は、しばしば大量の筋肉および皮膚損傷をもたらす。対照的に、レーザー病変は、脊髄をより特異的に標的とすることができ、他の組織への損傷を減少させる。これを説明するために、Tg(β-actin:utrophin-mCh)幼虫を用いて、手動およびレーザー病変を行った。このラインは、F-アクチン結合タンパク質を蛍光標識し、脊髄細胞および筋線維の可視化を可能にする。その後、幼虫を生きたマウントし、画像化しました(図7A、B)。 図7A は、脊髄の損傷を示す。レーザーおよび手動病変条件の両方における損傷部位におけるウトロフィンの欠如は、両方の病変方法が脊髄内の細胞を損傷したことを示唆している。 図7B は、筋肉損傷を示す。未病状態では筋止層に明確な山形様構造があり、アクチン線維の束が見える。手動病変状態において筋トーム形状に目に見える破壊があり、より少ないアクチン線維が存在する。これは、重大な筋肉損傷を示しています。しかし、レーザー病変状態では、筋トームの山形構造が維持されている。筋線維には多少の損傷がありますが、これは手動病変状態では4つ以内と比較して1つまたは2つの筋腫内に含まれています。また、 図7Cの実体顕微鏡で撮影した画像に示すように、手動病変状態と比較してレーザー病変状態において軽微な皮膚損傷がある。
全体として、これらの結果は、再現可能な半自動レーザー病変が、ゼブラフィッシュの神経再生を研究するための強力なツールとなる可能性を秘めていることを示しています。
図1:半自動レーザー傷害ワークフローの概略図。 受精後3日間(dpf)、幼虫を96ウェルプレートにロードし、自動幼虫処理プラットフォーム上に置く。次いで、各幼虫を、画像化およびレーザー病変のために直立顕微鏡上の10x NA 0.5レンズの下に置かれた毛細血管に装填する。病変後、幼虫は収集およびさらなる実験のために新しい96ウェルプレートにアンロードされる。上部には、レーザー病変前後のtg(Xla.Tubb:DsRed)3dpf幼虫の透過画像および蛍光画像(スケールバー=50μm)が掲載されている。幼虫は吻側左向きで背側が上向きです(すべての図について)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:半自動ゼブラフィッシュ幼虫イメージングシステムおよびレーザー制御システムのソフトウェア起動。(B) VAST ソフトウェアのメイン ウィンドウには、空のキャピラリーが表示されます。(C)空白のプレートテンプレートを備えたLPサンプラーウィンドウ。(D) Watch_for_ROIs_py3.pyスクリプトが実行されている python IDE のビュー。オレンジ色の長方形は、レーザーアッテネータの初期化中にメッセージが表示された端子タブを示しています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:tg(Xla.Tubb:DsRed)3dpf幼虫上のレーザー病変配列の例(A)ImageJツールバーからラインROIツールを選択した後、20μmのラインを使用したレーザー病変の最初のステップ。(B)脊髄の完全な切断のための80μmラインを有する第2ステップ。(C) ImageJ からのレーザー制御に使用されるスクリプトのビュー。(D)レーザー病変中の画像のシーケンス。上:病変前;中央:最初のステップの直後。下:第2工程の直後(スケールバー=50μm)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:アセチル化チューブリン免疫染色(A-C)およびカルシウムイメージング(D,E)は、レーザー病変が脊髄組織の連続性を完全に破壊することを示している。(B)背側 - 腹側軸および内側 - 側軸の両方に沿った脊髄組織の完全な破壊を示す脊髄の完全な切除。(C)不完全なトランスセクション。(スケールバー = 50 μm)。(D) tg(Xla.Tubb:GCaMP6s)3 dpf幼虫上のトランスセクト脊髄。長方形は、病変の吻側(青色)および尾側(オレンジ色)における蛍光強度を定量化するために使用されるROIを示す。(e)吻側および尾側分析ROIsにおける経時的な蛍光強度変化のグラフ。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:レーザー損傷は免疫応答を誘発し、解剖学的および機能的回復を成功させる(A-D)レーザー病変の前(A)および後の異なる時間におけるtg(Xla.Tubb:DsRed)3dpf幼虫の最大強度投影蛍光画像:3時間後(B)、24時間後(C)、および48時間後(D)。(E-G)機能回復を評価するためのカルシウム画像化の使用。(E) 解析ROIを有する病変tg(Xla.Tubb:GCaMP6s)幼虫。(f)吻側および尾側分析ROIsにおける蛍光強度の経時変化のグラフ。(g)病変後3、24、48時間(N = 3)における尾側と吻側のスパイク振幅の比(接続性回復指数)の定量化。(H-I)病変後の免疫応答の特性評価。(h)6hpiにおけるマクロファージ(mpeg1+細胞、緑色)の蓄積を示す未病変(左)および病変(右)tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP)3 dfp幼虫の蛍光画像。(i)損傷した無傷の幼虫(N=3)における病変後6時間におけるマクロファージ数の定量化(スケールバー=50μm)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:病変誘発性運動ニューロンの生成は、レーザー病変と手動病変の間で同等である。 (A-C) レーザー病変(A)、手動病変(B)、および未病変(C)状態における、EdU染色によるtg(mnx1:gfp)5dpf幼虫のApoTome顕微鏡からの画像。矢印は、両方のマーカーに対して二重ラベル付けされたセルを示します。スケールバー = 100 μm. (A'-C') 白いボックスで示す二重標識細胞の倍率が高い。(d)各幼虫における共局在細胞の数に対する細胞数の定量化。傷害部位の両側に50μmの窓を設置し、共局在細胞をすべてのZスタック画像でカウントした。一元配置分散分析は、Tukeyのポストホックテストで実施されました27。レーザー病変と手動病変の間に有意差はない(p = 0.909)。レーザー病変(2.4倍変化、p = 0.011)および手動病変(2.3倍変化、p = 0.018)と比較して、未病変対照におけるmnx1:gfp+/EdU+細胞は有意に少ない。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:レーザー病変は、手動病変よりも少ない筋肉および皮膚損傷を誘発する。 (A-B)共焦点顕微鏡で撮影した、未病変、手動病変およびレーザー病変状態におけるtg(β-actin:utrophin-mCherry)3dpf幼虫の単一Zスタック画像。白い矢印は負傷部位を示す。(A)は脊髄と脊索が見えるZスタックを示す。SCは脊髄にラベルを付け、NCは脊索にラベルを付けます。(b)は筋線維が見えるZスタックを示す。(c)画像は、未病変、手動病変、およびレーザー病変条件における3dpf幼虫の実体顕微鏡で撮影した。幼虫をタングステンワイヤーピンを用いてプラットホームに固定した(レーザー病変画像で見える)。ブラックボックスは病変部位を示す。スケール バー = 50 μm。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足ファイル1:プロトコルの実験的詳細。トランスジェニックゼブラフィッシュ系統の生成、手動脊髄損傷、アセチル化チューブリン免疫組織化学、Hb9/EdU染色、イメージング、および画像処理および解析について説明する。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ゼブラフィッシュの再生中に作用するプロセスのより深い理解が緊急に必要とされています。この動物モデルは、生物医学研究、特に脊髄損傷に多くの利点をもたらします1。ほとんどの研究は、十分に訓練されたオペレータを必要とし、多組織損傷を誘発する手動病変を含む。レーザー病変プロトコルがここに提示され、病変特性を制御し、周囲の組織への損傷を低減することを可能にする。さらに、この手法は、比較的訓練を受けていない実験者がうまく使用できるほど簡単です。
プロトコルの重要なステップは、レーザのキャリブレーションとROIの定義です。実際には、較正は非常に安定しており(数ヶ月間でさえ)、ROIの適切なサイズと位置が決定されると、この技術の使用は簡単です。プロトコルは、特定の機器で病変を実行する方法を説明しましたが、レーザー病変の利点のほとんどは、回転ディスク顕微鏡などのさまざまなシステムで利用できます。
このプロトコルの主な制限は、脊髄の蛍光レポーターを使用する必要性と、病変を行うのに必要な時間(〜5分/魚)です。後者は、より少ない動物を必要とする高い再現性によって補われる。しかし、手作業による病変は、多くの病変動物が必要な薬物検査などの用途にはまだ実行可能です。ここに示すように、病変誘発性神経新生の程度は、レーザー病変と手動病変とで同等である。
しかし、レーザー損傷は莫大な可能性を秘めており、そのうちのいくつかは提供されるユニークな利点に関連しています。例えば、回転毛細血管は、制御された方法で多種多様な位置で病変を行うことを可能にする。例えば、Mauthner細胞において単一のニューロン軸索切除術を誘導するために使用され得る(データは示さず)、Bhatt et al.15の研究においても実証されている。これは、手動病変では不可能です。
この結果はまた、損傷が主に脊髄に封じ込められ、周囲の組織への損傷が最小限に抑えられていることも実証した。これは、レーザー病変の後に見られる細胞応答が、他の損傷組織からのシグナル伝達ではなく、脊髄特異的に起因する可能性が高いことを意味する可能性がある。それはまた、レーザー病変幼虫が実験のためのさらなる準備に耐えることができることを意味するかもしれない。例えば、電気生理学のための解剖は、鉗子28,29,30を用いて体幹皮膚を除去することを含み、これはすでに繊細な損傷部位に高い機械的圧力がかかり、軸索接続が再び切断される危険性がある。レーザー病変幼虫に見られる皮膚および筋肉組織の完全性は、病変部位をさらなる損傷から保護し、達成された再生のレベルをより正確に表現する結果となり得る。
さらに、レーザー損傷後の損傷の局在化の改善は、異なる再生プロセス間の結合の延長を制限し、手動病変を使用する場合、より微妙なプロセスをマスクする可能性がある。ここで説明する幼虫ゼブラフィッシュの実験的傷害へのアプローチは、定量生物学、生物物理学、および計算生物学の文脈における新しい研究の範囲を開くかもしれない。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この研究はBBSRC(BB/S0001778/1)の支援を受けた。CRは、プリンセスロイヤルテノバススコットランド医学研究奨学金プログラムによって資金提供されています。David Greenald(CRH、エジンバラ大学)とKaty Reid(CDBS、エジンバラ大学)に、トランスジェニック魚の親切な贈り物に感謝します( 補足ファイルを参照)。Daniel Soong(CRH、エジンバラ大学)が3iスピニングディスクコンフォカルに親切にアクセスしてくれたことに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Microscope software Zen Blue 2.0 | Carl Zeiss | ||
| ImageJ/FIJI | Open-Source | ||
| Visual Studio Code | Microsoft | ||
| Microscope and accessories | |||
| ApoTome microscope | Carl Zeiss | ||
| C-Plan-Apochromat 10X (0.5NA) dipping lens | Carl Zeiss | ||
| dual AxioCam 506 m CCD cameras | Carl Zeiss | ||
| Laser scanning confocal microscope LSM880 | Carl Zeiss | ||
| Spinning-disk module CSU-X1 | Yokogawa | ||
| Upright microscopeAxio Examiner D1 | Carl Zeiss | ||
| UV laser | Micropoint | ||
| VAST BioImager | Union Biometrica | ||
| Labware | |||
| 90 mm Petri dish | Thermo-Fisher | 101R20 | |
| 96-well plate | Corning | 3841 | |
| Chemicals | |||
| Click-It EdU Imaging Kit | Invitrogen | C10637 | |
| aminobenzoic-acid-ethyl methyl-ester (MS222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Antibodies | |||
| Donkey anti-chicken Alexa Fluor 488 | Jackson | 703-545-155 | |
| Donkey anti-mouse Cy3 | Jackson | 715-165-150 | |
| Mouse anti-GFP | Abcam | AB13970 | |
| Mouse anti-tubulin acetylated antibody | Sigma | T6793 | |
| Transgenic zebrafish lines | |||
| Tg(beta-actin:utrophin-mCherry) | N/A | Established by David Greenhald, University of Edinburgh | |
| Tg(mnx1:gfp) | N/A | First described in [Flanagan-Steet et al. 2005] | |
| Tg(Xla.Tubb:DsRed) | N/A | First described in [Peri and Nusslein-Volhard 2008] | |
| Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP) | N/A | Established by Katy Reid, University of Edinburgh | |
| Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) | N/A | Established by David Greenhald, University of Edinburgh |
References
- Becker, C. G., Becker, T. Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration. Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).
- Ohnmacht, J., et al. Spinal motor neurons are regenerated after mechanical lesion and genetic ablation in larval zebrafish. Development. 143 (9), 1464-1474 (2016).
- Anguita-Salinas, C., et al. Cellular dynamics during spinal cord regeneration in larval zebrafish. Developmental Neuroscience. 41 (1-2), 112-122 (2019).
- Chapela, D., et al. A zebrafish drug screening platform boosts the discovery of novel therapeutics for spinal cord injury in mammals. Scientific Reports. 9, 1-12 (2019).
- Schlüßler, R., et al. Mechanical mapping of spinal cord growth and repair in living zebrafish larvae by brillouin imaging. Biophysical Journal. 115 (5), 911-923 (2018).
- Cavone, L., et al. A unique macrophage subpopulation signals directly to progenitor cells to promote regenerative neurogenesis in the zebrafish spinal cord. Developmental Cell. 56 (11), 1617-1630 (2021).
- Keatinge, M., et al. CRISPR gRNA phenotypic screening in zebrafish reveals pro-regenerative genes in spinal cord injury. PLoS Genetics. 17 (4), 1-21 (2021).
- National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research. , Available from: https://nc3rs.org.uk (2021).
- Hui, S. P., et al. Genome wide expression profiling during spinal cord regeneration identifies comprehensive cellular responses in Zebrafish. PLOS ONE. 9 (1), 1-23 (2014).
- Vasudevan, D., et al. Regenerated interneurons integrate into locomotor circuitry following spinal cord injury. Experimental Neurology. 342, 1-10 (2021).
- Becker, T., Becker, C. G. Dynamic cell interactions allow spinal cord regeneration in zebrafish. Current Opinion in Physiology. 14, 64-69 (2020).
- Wehner, D., et al. Wnt signaling controls pro-regenerative Collagen XII in functional spinal cord regeneration in zebrafish. Nature Communications. 8 (126), 1-16 (2017).
- Briona, L. K., Dorsky, R. I. Spinal cord transection in the larval Zebrafish. Journal of Visualised Experiments: JoVE. (87), (2014).
- Kamei, C. N., Liu, Y., Drummond, I. A. Kidney regeneration in adult Zebrafish by gentamicin induced injury. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (102), (2015).
- Bhatt, D. H., Otto, S. J., Depoister, B., Fetcho, J. R. Cyclic AMP-induced repair of zebrafish spinal circuits. Science. 305 (5681), 254-258 (2004).
- Xu, Y., Chen, M., Hu, B., Huang, R., Hu, B. In vivo imaging of mitochondrial transport in single-axon regeneration of zebrafish mauthner cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11 (4), 1-12 (2017).
- Nichols, E. L., Smith, C. J. Functional regeneration of the sensory root via axonal invasion. Cell Reports. 30 (1), 9-17 (2020).
- Ellström, I. D., et al. Spinal cord injury in zebrafish induced by near-infrared femtosecond laser pulses. Journal of Neuroscience Methods. 311, 259-266 (2016).
- Green, L. A., Nebiolo, J. C., Smith, C. J. Microglia exit the CNS in spinal root avulsion. PLOS Biology. 17 (2), 1-30 (2019).
- Early, J. J., et al. An automated high-resolution in vivo screen in zebrafish to identify chemical regulators of myelination. eLife. , 1-31 (2018).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- AndOr Micropoint Manual. , Available from: https://andor.oxinst.com/downloads/view/andor-micropoint-manual (2021).
- Knafo, S., et al. Mechanosensory neurons control the timing of spinal microcircuit selection during locomotion. eLife. 6, 25260 (2017).
- Tsarouchas, T. M., et al. Dynamic control of proinflammatory cytokines Il-1β and Tnf-α by macrophages in zebrafish spinal cord regeneration. Nature Communications. 9, (2018).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Howell, D. Statistical methods for psychology. , Duxbury. 324-325 (2002).
- Tukey, J. Comparing individual means in the analysis of variance. Biometrics. 5 (2), 99-114 (1949).
- Song, M., Mohamad, O., Chen, D., Yu, S. P. Coordinated development of voltage-gated Na+ and K+ currents regulates functional maturation of forebrain neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 22 (10), 1551-1563 (2013).
- Hong, S., Lee, P., Baraban, S., Lee, L. P. A novel long-term, multi-channel and non-invasive electrophysiology platform for Zebrafish. Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).
- Menelaou, E., McLean, D. L. Hierarchical control of locomotion by distinct types of spinal V2a interneurons in zebrafish. Nature Communications. 10, 1-12 (2019).
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医学 第177号Erratum
Formal Correction: Erratum:Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae
Posted by JoVE Editors on 04/07/2022.
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Controlled Semi-Automated Lased-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae
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Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae
