Summary

تنقية القنوات المحتملة لمستقبلات ذبابة الفاكهة العابرة الذاتية المنشأ

Published: December 28, 2021
doi:

Summary

استنادا إلى آلية تجميع مركب البروتين INAD ، في هذا البروتوكول ، تم تطوير استراتيجية معدلة لتنقية التقارب بالإضافة إلى المنافسة لتنقية قناة Drosophila TRP الذاتية.

Abstract

يعد النقل الضوئي لذبابة الفاكهة أحد أسرع مسارات الإشارات المقترنة ببروتين G المعروفة. لضمان خصوصية وكفاءة هذا الشلال ، ترتبط قناة كاتيون الكالسيوم (Ca2+) القابلة للنفاذ ، وإمكانات المستقبلات العابرة (TRP) ، بإحكام ببروتين السقالة ، وتعطيل D بدون جهد لاحق (INAD) ، وتشكل مركبا كبيرا من بروتين الإشارات مع كيناز البروتين C (ePKC) الخاص بالعين والفوسفوليباز Cβ / بدون مستقبلات المحتملة A (PLCβ / NORPA). ومع ذلك ، فإن الخصائص البيوكيميائية لقناة ذبابة الفاكهة TRP لا تزال غير واضحة. استنادا إلى آلية تجميع مركب بروتين INAD ، تم تطوير استراتيجية معدلة لتنقية التقارب بالإضافة إلى المنافسة لتنقية قناة TRP الذاتية. أولا ، كان جزء الهيستيدين النقي (له) الموسوم NORPA 863-1095 مرتبطا بحبات Ni ويستخدم كطعم لسحب مركب بروتين INAD الداخلي المنشأ من متجانسات رأس ذبابة الفاكهة. بعد ذلك ، تمت إضافة جزء من الجلوتاثيون S-transferase (GST) الموسوم باسم TRP 1261-1275 إلى حبات Ni للتنافس مع قناة TRP. وأخيرا ، تم فصل قناة TRP في supernatant عن الببتيد TRP 1261-1275 المفرط بواسطة كروماتوغرافيا استبعاد الحجم. هذه الطريقة تجعل من الممكن دراسة آلية بوابة قناة ذبابة الفاكهة TRP من كل من الزوايا الكيميائية الحيوية والهيكلية. يمكن أيضا قياس خصائص الفيزيولوجيا الكهربية لقنوات ذبابة الفاكهة TRP النقية في المستقبل.

Introduction

النقل الضوئي هو عملية يتم فيها تحويل الفوتونات الممتصة إلى رموز كهربائية للخلايا العصبية. وهو ينقل حصريا الأوبسينات وسلسلة الإشارات التالية المرتبطة ببروتين G في كل من الفقاريات واللافقاريات. في ذبابة الفاكهة ، باستخدام مجالات PDZ الخمسة ، ينظم تعطيل بروتين السقالة – بدون إمكانات لاحقة D (INAD) مجمع إشارات فوق جزيئي ، والذي يتكون من قناة محتملة للمستقبلات العابرة (TRP) ، و phospholipase Cβ / No receptor potential A (PLCβ / NORPA) ، وكيناز البروتين C (ePKC) (ePKC) 1. يضمن تكوين مجمع الإشارات فوق الجزيئية هذا التوطين الصحيح تحت الخلوي والكفاءة العالية وخصوصية آلات النقل الضوئي ذبابة الفاكهة. في هذا المعقد ، تعمل قنوات TRP الحساسة للضوء كمؤثرات في المصب ل NORPA وتتوسط تدفق الكالسيوم وإزالة الاستقطاب من المستقبلات الضوئية. أظهرت الدراسات السابقة أن فتح قناة ذبابة الفاكهة TRP يتم بوساطة البروتونات ، أو تعطيل بيئة الدهون المحلية ، أو القوة الميكانيكية2،3،4. تتفاعل قناة Drosophila TRP أيضا مع calmodulin5 ويتم تعديلها بواسطة الكالسيوم عن طريق كل من ردود الفعل الإيجابية والسلبية 6,7,8.

حتى الآن ، استندت دراسات الفيزيولوجيا الكهربية على آلية بوابات ذبابة الفاكهة TRP والقنوات الشبيهة ب TRP (TRPL) إلى بقع غشاء تم استئصالها ، وتسجيلات الخلايا الكاملة من المستقبلات الضوئية ذبابة الفاكهة من النوع البري المنفصل ، والقنوات المعبر عنها بشكل غير متجانس في S2 أو SF9 أو HEK الخلايا2،9،10،11،12،13 ، ولكن ليس على القنوات النقية. كما أن المعلومات الهيكلية لقناة ذبابة الفاكهة TRP الكاملة الطول لا تزال غير واضحة. من أجل دراسة الخصائص الكهروفسيولوجية للبروتين النقي في بيئة غشائية معاد تشكيلها والحصول على معلومات هيكلية لقناة ذبابة الفاكهة TRP كاملة الطول ، فإن الحصول على قنوات TRP كاملة الطول النقية هو الخطوة الأولى الضرورية ، على غرار المنهجيات المستخدمة في دراسات قناة TRP للثدييات14،15،16،17.

في الآونة الأخيرة ، استنادا إلى آلية تجميع مركب بروتين INAD18,19,20 ، تم تطوير استراتيجية تنقية التقارب بالإضافة إلى المنافسة لأول مرة لتنقية قناة TRP من متجانسات رأس ذبابة الفاكهة بواسطة حبات الستربتافيدين5. بالنظر إلى السعة المنخفضة والتكلفة الباهظة لخرز الستربتافيدين ، يتم تقديم بروتوكول تنقية محسن هنا يستخدم بروتين الطعم الموسوم والخرز النيفي منخفض التكلفة المقابل بسعة أعلى بكثير. ستساعد الطريقة المقترحة على دراسة آلية بوابات قناة TRP من الزوايا الهيكلية وقياس الخصائص الكهروفسيولوجية لقناة TRP باستخدام البروتينات النقية.

Protocol

1. تنقية شظايا TRP الموسومة بضريبة السلع والخدمات وشظايا NORPA الموسومة به تنقية جزء TRP 1261-1275 الموسوم بضريبة السلع والخدمات حول بلازميد pGEX 4T-1 TRP 1261-127510 إلى خلايا الإشريكية القولونية (E. coli ) BL21 (DE3) باستخدام طريقة تحويل الصدمة الحرارية CaCl2 21. ق…

Representative Results

في هذه المقالة ، يتم توضيح طريقة تنقية البروتين لتنقية قناة ذبابة الفاكهة TRP الذاتية المنشأ (الشكل 1). أولا ، يتم تطبيق التعبير عن البروتين المؤتلف وتنقيته للحصول على الطعم والبروتينات المنافسة. بعد ذلك ، يتم التعبير عن جزء TRP 1261-1275 الموسوم ب GST في خلايا …

Discussion

INAD ، الذي يحتوي على خمسة نطاقات PDZ ، هو المنظم الأساسي لآلات النقل الضوئي ذبابة الفاكهة. أظهرت الدراسات السابقة أن INAD PDZ3 يرتبط بذيل قناة TRP C-terminal مع خصوصية رائعة (KD = 0.3 μM)18. يتفاعل الترادف INAD PDZ45 مع جزء NORPA 863-1095 مع تقارب ربط عال للغاية (KD = 30 nM). وتوفر هذه النتائج أسا?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 31870746) ، ومنح شنتشن للبحوث الأساسية (JCYJ20200109140414636) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة قوانغدونغ ، الصين (رقم 2021A1515010796) إلى W. L. نشكر LetPub (www.letpub.com) على مساعدتها اللغوية أثناء إعداد هذه المخطوطة.

Materials

Bacterial strains
BL21(DE3) Competent Cells Novagen 69450 Protein overexpression
Experiment models
D.melanogaster: W1118 strain Bloomington Drosophila Stock Center BDSC:3605 Drosophila head preparation
Material
20/30/40 mesh stainless steel sieves Jiufeng metal mesh company GB/T6003.1 Drosophila head preparation
30% Acrylamide-N,N′-Methylenebisacrylamide(29:1) Lablead A3291 SDS-PAGE gel preparation
Ammonium Persulfate Invitrogen HC2005 SDS-PAGE gel preparation
Cocktail protease inhibitor Roche 05892953001 Protease inhibitor
Coomassie brilliant blue R-250 Sangon Biotech A100472-0025 SDS-PAGE gel staining
DL-Dithiothreitol (DTT) Sangon Biotech A620058-0100 Size-exclusion column buffer preparation
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) Sangon Biotech A500838-0500 Size-exclusion column buffer preparation
Glycine Sangon Biotech A610235-0005 SDS-PAGE buffer preparation
Glutathione Sepharose 4 Fast Flow beads Cytiva 17513202 Affinity chromatography
Imidazole Sangon Biotech A500529-0001 Elution buffer preparation for Ni-column
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) Sangon Biotech A600168-0025 Induction of protein overexpression
LB Broth Powder Sangon Biotech A507002-0250 E.coli. cell culture
L-Glutathione reduced (GSH) Sigma-aldrich G4251-100G Elution buffer preparation for Glutathione beads
Ni-Sepharose excel beads Cytiva 17371202 Affinity chromatography
N-Dodecyl beta-D-maltoside (DDM) Sangon Biotech A610424-001 Detergent for protein purification
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-aldrich T9281-100ML SDS-PAGE gel preparation
PBS Sangon Biotech E607008-0500 Homogenization buffer for E.coli. cell
PMSF Lablead P0754-25G Protease inhibitor
Prestained protein marker Thermo Scientific 26619/26616 Prestained protein ladder
Size exclusion column (preparation grade) Cytiva 28989336 HiLoad 26/60 Superdex 200 PG column
Size exclusion column (analytical grade) Cytiva 29091596 Superose 6 Increase 10/300 GL column
Sodium chloride Sangon Biotech A501218-0001 Protein purification buffer preparation
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sangon Biotech A500228-0001 SDS-PAGE gel/buffer preparation
Tris base Sigma-aldrich T1503-10KG Protein purification buffer preparation
Ultrafiltration spin column Millipore UFC901096/801096 Protein concentration
Equipment
Analytical Balance DENVER APX-60 Metage of Drosophila head
Desk-top high-speed refrigerated centrifuge for 15mL and 50mL conical centrifugation tubes Eppendorf 5810R Protein concentration
Desk-top high-speed refrigerated centrifuge 1.5mL centrifugation tubes Eppendorf 5417R Centrifugation of Drosophila head lysate after homogenization
Empty gravity flow column (Inner Diameter=1.0cm) Bio-Rad 738-0015 TRP protein purification
Empty gravity flow column (Inner Diameter=2.5cm) Bio-Rad 738-0017 Bait and competitor protein purification from E.coli.
Gel Documentation System Bio-Rad Universal Hood II Gel Doc XR System SDS-PAGE imaging
High-speed refrigerated centrifuge Beckman coulter Avanti J-26 XP Centrifugation of E.coli. cells/cell lysate
High pressure homogenizer UNION-BIOTECH UH-05 Homogenization of E.coli. cells
Liquid nitrogen tank Taylor-Wharton CX-100 Drosophila head preparation
Protein purification system Cytiva AKTA purifier Protein purification
Refrigerator (-80°C) Thermo 900GP Drosophila head preparation
Spectrophotometer MAPADA UV-1200 OD600 measurement of E.coli. cells
Spectrophotometer Thermo Scientific NanoDrop 2000c Determination of protein concentration
Ultracentrifuge Beckman coulter Optima XPN-100 Ultracentrifuge Ultracentrifugation

Riferimenti

  1. Tsunoda, S., et al. A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade. Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).
  2. Huang, J., et al. Activation of TRP channels by protons and phosphoinositide depletion in Drosophila photoreceptors. Current Biology: CB. 20 (3), 189-197 (2010).
  3. Chyb, S., Raghu, P., Hardie, R. C. Polyunsaturated fatty acids activate the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL. Nature. 397 (6716), 255-259 (1999).
  4. Hardie, R. C., Franze, K. Photomechanical responses in Drosophila photoreceptors. Science. 338 (6104), 260-263 (2012).
  5. Chen, W., et al. Calmodulin binds to Drosophila TRP with an unexpected mode. Structure. 29 (4), 330-344 (2021).
  6. Hardie, R. C. Effects of intracellular Ca2+ chelation on the light response in Drosophila photoreceptors. Journal of Comparative Physiology. A, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 177 (6), 707-721 (1995).
  7. Scott, K., Sun, Y., Beckingham, K., Zuker, C. S. Calmodulin regulation of Drosophila light-activated channels and receptor function mediates termination of the light response in vivo. Cell. 91 (3), 375-383 (1997).
  8. Hardie, R. C., Minke, B. Phosphoinositide-mediated phototransduction in Drosophila photoreceptors: the role of Ca2+ and trp. Cell Calcium. 18 (4), 256-274 (1995).
  9. Delgado, R., et al. Light-induced opening of the TRP channel in isolated membrane patches excised from photosensitive microvilli from Drosophila photoreceptors. Neuroscienze. 396, 66-72 (2019).
  10. Lev, S., Katz, B., Minke, B. The activity of the TRP-like channel depends on its expression system. Channels (Austin). 6 (2), 86-93 (2012).
  11. Hardie, R. C., Raghu, P. Activation of heterologously expressed Drosophila TRPL channels: Ca2+ is not required and InsP3 is not sufficient. Cell Calcium. 24 (3), 153-163 (1998).
  12. Gutorov, R., et al. Modulation of transient receptor potential C channel activity by cholesterol. Frontiers in Pharmacology. 10, 1487 (2019).
  13. Yagodin, S., et al. Thapsigargin and receptor-mediated activation of Drosophila TRPL channels stably expressed in a Drosophila S2 cell line. Cell Calcium. 23 (4), 219-228 (1998).
  14. Guo, W., Chen, L. Recent progress in structural studies on canonical TRP ion channels. Cell Calcium. 83, 102075 (2019).
  15. Li, X., Fine, M. TRP channel: The structural era. Cell Calcium. 87, 102191 (2020).
  16. Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).
  17. Cao, E., Liao, M., Cheng, Y., Julius, D. TRPV1 structures in distinct conformations reveal activation mechanisms. Nature. 504 (7478), 113-118 (2013).
  18. Liu, W., et al. The INAD scaffold is a dynamic, redox-regulated modulator of signaling in the Drosophila eye. Cell. 145 (7), 1088-1101 (2011).
  19. Ye, F., Liu, W., Shang, Y., Zhang, M. An exquisitely specific PDZ/target recognition revealed by the structure of INAD PDZ3 in complex with TRP channel. Structure. 24 (3), 383-391 (2016).
  20. Ye, F., et al. An unexpected INAD PDZ tandem-mediated plcβ binding in Drosophila photo receptors. eLife. 7, (2018).
  21. Rahimzadeh, M., Sadeghizadeh, M., Najafi, F., Arab, S., Mobasheri, H. Impact of heat shock step on bacterial transformation efficiency. Molecular Biology Research Communications. 5 (4), 257-261 (2016).
  22. Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, S. . Drosophila: A laboratory handbook. Second Edition. 80 (2), (2005).
  23. Nicolas, G., Sillans, D. Immediate and latent effects of carbon dioxide on insects. Annual Review of Entomology. 34 (1), 97-116 (1989).
  24. Arachea, B. T., et al. Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins. Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).
  25. Hellmich, U. A., Gaudet, R. Structural biology of TRP channels. Handbook of Experimental Pharmacology. 223, 963-990 (2014).

Play Video

Citazione di questo articolo
Liu, J., Liu, Y., Chen, W., Ding, Y., Lan, X., Liu, W. Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels. J. Vis. Exp. (178), e63260, doi:10.3791/63260 (2021).

View Video