Expressão bacteriana e purificação da matriz humana Metaloproteinase-3 usando cromatografia de afinidade

Summary

Sua marca purificação, diálise e ativação são empregadas para aumentar os rendimentos da expressão proteica de domínio catalítico de matriz solúvel-3 em bactérias. As frações proteicas são analisadas através de géis SDS-PAGE.

Abstract

As metaloproteínas matricial (MMPs) pertencem à família de proteases metzincinas com papéis centrais na degradação e remodelagem da matriz extracelular (ECM), bem como interações com diversos fatores de crescimento e citocinas. A superexpressão de MMPs específicos é responsável por diversas doenças, como câncer, doenças neurodegenerativas e doenças cardiovasculares. Os MMPs têm sido o centro das atenções recentemente como metas para desenvolver terapêuticas que possam tratar doenças correlacionadas à superexpressão de MMP.

Para estudar o mecanismo MMP em solução, são necessários métodos de expressão e purificação de proteínas recombinantes mais fáceis e robustas para a produção de MMPs ativos e solúveis. No entanto, o domínio catallítico da maioria dos MMPs não pode ser expresso em Escherichia coli (E. coli) em forma solúvel devido à falta de máquinas pós-transicionais, enquanto os sistemas de expressão dos mamíferos são geralmente caros e têm rendimentos mais baixos. Os órgãos de inclusão de MMP devem passar pelo processo tedioso e trabalhoso de purificação extensiva e re dobra, reduzindo significativamente o rendimento de MMPs na conformação nativa. Este artigo apresenta um protocolo usando células Rosetta2(DE3)pLysS (doravante referida como R2DP) para produzir domínio catalítico matrix metalloproteinase-3 (MMP-3cd), que contém uma tag N-terminal Sua seguida por pró-domínio (Hisx6-pro-MMP-3cd) para uso na purificação de afinidade. As células R2DP aumentam a expressão de proteínas eucarióticas através de um plasmídeo resistente a clororamfenícol contendo códons normalmente raros em sistemas de expressão bacteriana. Em comparação com a linha celular tradicional de escolha para expressão de proteína recombinante, BL21(DE3), a purificação usando esta nova cepa melhorou o rendimento do Hisx6-pro-MMP-3cd purificado. Após a ativação e desalagem, o domínio pro é cortado juntamente com o N-terminal His-tag, fornecendo MMP-3cd ativo para uso imediato em inúmeras aplicações in vitro . Este método não requer equipamentos caros ou proteínas de fusão complexas e descreve a rápida produção de MMPs humanos recombinantes em bactérias.

Introduction

A maioria das proteínas eucarióticas complexas sofrem modificações pós-transicionais elaboradas após a expressão, exigindo dobramento de proteína altamente assistida e cofatores para serem ^funcionais1. Produzir grandes quantidades de proteína humana solúvel em um hospedeiro bacteriano continua sendo um desafio significativo devido aos altos custos e à falta de métodos robustos de expressão e purificação, mesmo para experimentos laboratoriais de menor ^escala2,3. OS MMPs, endopeptidases humanas com grande peso molecular, são geralmente expressos como corpos de inclusão insolúveis quando expressos em E. coli. A extração de MMPs humanos solúveis muitas vezes leva a um processo de solubilização e reabascamento laborioso e ^demorado4.

Os MMPs têm papéis críticos em processos fisiológicos e patogênicos. Os MMPs humanos são uma família de 23 endopeptidases de zinco, categorizadas pela especificidade de estrutura e substrato, e expressas diferencialmente apesar de um domínio catalítico altamente ^{conservado5,6}. Os MMPs são secretados como zymogens inativos, regulados via ativação pós-translacional e seus inibidores endógenos, inibidores de tecidos de metaloproteinas (TIMPs)7,8,9,10. Embora inicialmente reconhecidos por seu papel na rotatividade do ECM, os MMPs também foram implicados no desenvolvimento, morfogênese, reparação de tecidos e ^{remodelação8}. A desregulação dos MMPs tem sido notavelmente ligada ao câncer, juntamente com doenças neurodegenerativas, cardiovasculares e fibrosas, entre outras ^doenças5,7.

O desenvolvimento de métodos robustos de produção de MMP em larga escala é fundamental para garantir o sucesso de estudos futuros de mecanismos MMP por meio de ensaios bioquímicos e baseados em células. Vários MMPs foram previamente expressos em ^bactérias11, incluindo MMPs com marca Hisx6, sem alterar a atividade MMP12,13,14,15. No entanto, esses métodos incluem passos longos e tediosos que podem ser difíceis de replicar.

As células mamíferas também podem ser usadas para expressar muitas proteínas humanas diferentes, garantindo as modificações pós-transacionais ^adequadas16. Embora o sistema de expressão de mamíferos seja a escolha ideal para produzir proteínas humanas recombinantes com modificações pós-translacionais adequadas, as principais desvantagens deste método são os baixos rendimentos iniciais, meios de crescimento caros e reagentes, longas linhas temporais para alcançar linhas de expressão estáveis e risco de contaminação com outras espécies, como fungos ou ^{bactérias2,11} . Além disso, a produção de MMP em linhas de células de mamíferos produz impurezas de proteínas celulares associadas, como TIMPs ou fibronectinas11. Ao contrário do lento crescimento celular observado em células mamíferas, o sistema de expressão bacteriana oferece produção de proteínas em larga escala em um curto período, juntamente com requisitos mais simples de mídia e crescimento. No entanto, devido à falta de outras proteínas celulares associadas (ou seja, TIMPs) em sistemas de expressão bacteriana, os MMPs ativos em concentrações mais elevadas estão sujeitos à degradação por meio da autoproteólise, resultando em baixo rendimento de ^MMP17.

Este artigo descreve um método detalhado para expressão bacteriana, purificação e ativação do recombinante Hisx6-pro-MMP-3cd usando E. coli como hospedeiro de expressão devido à sua acessibilidade, simplicidade e sucesso na produção de maiores rendimentos de MMPs2,3,18. Uma vez que a E. coli não tem o maquinário dobrável de proteínas e o processamento pós-transicional necessário para MMPs recombinantes e outras proteínas complexas, muitas cepas de E. coli foram projetadas para superar essas limitações, tornando a E. coli um hospedeiro mais adequado para a expressão de MMP-3cd humano recombinante,19,20 . Por exemplo, a cepa R2DP usada neste estudo aumenta a expressão eucariótica fornecendo um plasmídeo resistente a clororamfenícol contendo códons raramente usados em E. coli.

Como descrito neste protocolo, após a superexpressão de corpos de inclusão relativamente puros do vetor pET-3a (Figura 1) em células R2DP, proteínas do domínio catalítico Hisx6-pro-MMP-3 (MMP-3cd) são extraídas e desnaturadas4. Hisx6-pro-MMP-3cd3,19 foi purificado usando cromatografia de tag de afinidade. Após a redobramento e diálise, o pro-MMP-3cd (zymogen) foi ativado por acetato 4-aminofenilmerárico (APMA), e a análise SDS-PAGE é usada para avaliar os rendimentos e a necessidade de mais ^{purificação5,21}. Este protocolo descreve a expressão, purificação e ativação do MMP-3cd solúvel como exemplo. No entanto, também pode ser usado como guia para a expressão de outros MMPs e proteases humanas com expressão semelhante, e mecanismos de ativação (Figura 2). Para outras proteínas além do MMP-3cd, o leitor é aconselhado a determinar as composições e métodos de buffer ideais para sua proteína alvo antes de tentar este protocolo.

Figura 1: Mapa plasmídeo do pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd plasmid. O vetor pET-3a inclui um gene de resistência à ampicilina. Uma sequência de tags Hisx6-terminal N é clonada no vetor baseado em pET-3a, incluindo pró-MMP-3cd, para produzir a construção pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd sob controle do promotor T7 entre os locais de restrição BamHI e NdeI. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Expressão bacteriana de pro-MMP-3cd, purificação, repato e ativação. 1.1: pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd plasmid foi transformado em células BL21(DE3) ou R2DP. 1.2: A expressão proteica Pró-MMP-3cd foi induzida por IPTG. 1.3: A lise química e a sônica são utilizadas para extrair proteínas Hisx6-pro-MMP-3cd que são principalmente insolúveis e encontradas nos corpos de inclusão. A ureia foi usada para desnaturar e solubilizar proteínas de corpos de inclusão. 2.1. A proteína Hisx6-pro-MMP-3cd foi purificada por meio da purificação da cromatografia de afinidade. 3. O Hisx6-pro-MMP-3cd elucido foi lentamente redobrado durante a diálise através da remoção gradual da ureia do buffer. 4. Finalmente, a proteína MMP-3cd repato foi ativada usando APMA removendo o domínio pró-peptídeo n-terminal. A APMA é posteriormente removida da solução através da desalting. Os números correspondem a seções de protocolo descrevendo essas etapas. Abreviaturas: MMP-3cd = Domínio catalítico matrix metaloproteinase-3; APMA = acetato aminofenilmerálico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocol

1. Expressão MMP Clonagem e transformação de células pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd em células R2DP Digerir o plasmídeo pET-3a (ver a Tabela de Materiais) com enzimas de restrição NdeI e BamHI em Buffer digest (ver a Tabela de Materiais). Em um volume total de reação de 40 μL, adicione 4 μL de Buffer digest, 33 μL de 100 ng/μL plasmid e 1,5 μL de cada enzima de restrição e permita que a reação prossiga por ~2 h até a conclusão a 37 °C.</…

Representative Results

Ao executar amostras em SDS-PAGE, porque a proteína é expressa na forma de corpos de inclusão insolúveis, as frações límpidas e sônicas devem conter pouco ou nenhum extrato Hisx6-pro-MMP-3cd, uma vez que a proteína ainda não foi resolutizada em ureia. A Figura 3 compara as frações de elução de purificação his-tag de Células Hisx6-pro-MMP-3cd de células BL21(DE3) e células R2DP. As frações de elução foram agrupadas separadamente para as células BL21(DE3) e R2DP antes d…

Discussion

A produção em larga escala de MMPs solúveis, humanos e recombinantes continua sendo uma tarefa desafiadora. As células mamíferas podem expressar MMPs funcionais a altos custos e longos tempos de espera, enquanto a E. coli produz rapidamente altas quantidades de corpos de inclusão de MMP que devem ser purificados e reobsecados11,16. As células R2DP aumentam significativamente o rendimento dos organismos de inclusão de MMP, permitindo um processo d…

Materials

0.22 µm sterile filter	Sigma Aldrich	SLGP033RS	Used to remove some contaminants from the protein extract before purification, and prevent the Ni-NTA column from clogging
1 L Erlenmeyer flasks	Thermo Fisher Scientific	S76106F	n/a
1 L glass bottles	Thermo Fisher Scientific	06-414-1D	n/a
1.5 mL microfuge tubes	Thermo Fisher Scientific	02-682-002	n/a
15 mL conical tubes	Thermo Fisher Scientific	339650	n/a
18 G, 1-in. beveled needle	Amazon	B07S7VBHM2	Used in combination with the dialysis casette
2 mL desalting column	Thermo Fisher Scientific	89890	Removes APMA following activation
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES)	Thermo Fisher Scientific	AAA1610422	n/a
250 mL conical bottle cushions	Thermo Fisher Scientific	05-538-53A	Stabilize conical bottles during large-volume centrifugation
250 mL conical bottles	Thermo Fisher Scientific	05-538-53	n/a
400 mL stirred cell	Sigma Aldrich	UFSC40001	Re-concentrates a much larger volume than the centrifugal filter unit. Rosetta2(DE3)pLysS cells produce high volumes of protein that may exceed the 15 mL limit of the centrifugal filter unit
4-aminophenylmercuric acetate (APMA)	Sigma Aldrich	A9563-5G	Activates MMP-3 by cleaving the propeptide
5 mL syringe	Thermo Fisher Scientific	NC0829167	Used in combination with the dialysis casette
50 mL conical tubes	Thermo Fisher Scientific	339650	Used for storage in many purification steps
50 mL re-concentration tube	Sigma Aldrich	UFC901024D	Used for re-concentrating protein samples after dialysis or removing contaminants
Agar	Thermo Fisher Scientific	BP1423-500	Buffer ingredient that solidifies autoclaved LB media upon cooling
Ampicillin	Thermo Fisher Scientific	BP1760-25	Antibiotic used with pET3a vector; used at 100 µg/mL in LB media
BamHI	NEB	R3136S	Restriction enzyme to be used with the pET3a vector
Calcium chloride (CaCl2)	Thermo Fisher Scientific	600-30-23	The calcium ion stabilizes MMP structure
Cell spreaders	Thermo Fisher Scientific	50-189-7544	Can be used to spread cells across a petri dish after transformation
Chloramphenicol	Thermo Fisher Scientific	22-055-125GM	Antibiotic used with pET3a vector; used at 34 µg/mL in LB media
Dialysis Buffer 1	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 µM ZnCl2, 4 M Urea.
Dialysis Buffer 2	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 µM ZnCl2, 2 M Urea.
Dialysis Buffer 3	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2 , 1 µM ZnCl2.
Dialysis clips	Thermo Fisher Scientific	68011	Used in combination with snakeskin dialysis tubing
Dialysis tubing	Thermo Fisher Scientific	88243	Alternative dialysis method that holds much larger sample volumes, but with higher risk of sample loss
Digest buffer	NEB	B7204S	Buffer used in digesting the pET3a vector
Disposable cuvettes	Thermo Fisher Scientific	21-200-257	Used to measure the bacterial culture OD during growth and expression
Dithiothreitol (DTT)	Thermo Fisher Scientific	D107125G	Assists with protein denaturation by reducing any disulfide bonds
DNA assembly mix	NEB	E2621S	Used to ligate the Hisx6-pro-MMP-3cd PCR product and digested pET3a vector
DNase I	NEB	M0303S	Endonuclease for degrading unfavorable DNA contaminants that could later affect protein purification
Ethanol	Thermo Fisher Scientific	A995-4	n/a
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Thermo Fisher Scientific	J15694-AE	Used in denaturation. Prevents oxidation and subsequent formation of disulfide bonds
Gel recovery kit	Promega	A9281	Isolates and purifies DNA from agarose gels
Glycerol	Thermo Fisher Scientific	G33-500	Used for making glycerol stocks, which are frozen at -80 °C
Gravity flow column	BioRad	7321010	Used for Ni-NTA purification of recombinantly His-tagged proteins
Guanidine hydrochloride (GdnHCl)	Thermo Fisher Scientific	AAA135430B	Second chaotropic agent used for disrupting protein secondary structure.
High-transformation efficiency cells	NEB	C2987	High-transformation efficiency cells with greater chance of success for cloning the N-terminal His-tag into the pET3a-pro-MMP-3cd construct
HT Elution Buffer	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M urea, 250 mM imidazole. Adjust pH to 7.4
HT Equilibration Buffer	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M urea. Adjust pH to 7.4
HT Regeneration Buffer	n/a	n/a	20 mM MES, 0.1 M NaCl. Adjust pH to 5.0
HT Wash Buffer	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M urea, 25 mM imidazole. Adjust pH to 7.4
Hydrochloric acid (HCl)	Thermo Fisher Scientific	A144C-212	Used to pH buffers
Imidazole	Thermo Fisher Scientific	AAA1022122	Mimics the histidine side group. Used to separate non-specifically binding proteins from the his-tagged target protein
Inclusion Body Buffer	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 2% v/v Triton X 100, 0.5 M Urea. Adjust pH to 8.0
Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside (IPTG)	Thermo Fisher Scientific	FERR0392	A reagent that induces target gene expression in pET3a. Make 0.5 mL 1 M aliquots, filter sterilize and store in -20 °C
LB Amp CamR media	n/a	n/a	To be poured into a sterible 1 L bottle or 1 L flask. For 1 L, add 25 g LB Broth. Sterilize by autoclaving. Once cooled to below 50 °C, add ampicillin to 100 µg/mL and chloramphenicol to 34 µg/mL
LB Amp CamR plates	n/a	n/a	To be poured into sterile petri dishes. Pour until the petri dish lid is completely covered. 1 L of media yields 40-60 plates. For 1 L: 25 g LB Broth, 16 g Agar. Sterilize by autoclaving. Once cooled to below 50 °C, add ampicillin to 100 µg/mL and chloramphenicol to 34 µg/mL
LB Broth	Thermo Fisher Scientific	BP1426-2	Pre-mixed with tryptone, yeast extract, and sodium chloride
Lysis Buffer	n/a	n/a	50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 0.133 g/mL lysozyme, 0.49% v/v Triton X-100. Adjust pH to 8.0
Lysozyme	MP Biomedicals	195303	Used in protein extraction. Enzyme that lyses bacterial cell walls
Miniprep kit	Promega	A1330	If successful, extracts the pET3a-pro-MMP-3cd construct from transformants
NdeI	NEB	R0111S	Restriction enzyme to be used with the pET3a vector
Ni-NTA resin	Thermo Fisher Scientific	PI88221	Used to bind recombinant his-tagged proteins. This strong interaction can be displaced with higher concentrations of imidazole
PCR mix	NEB	M0492S	A PCR reagent for inserting an N-terminal his-tag into the pET3a-pro-MMP-3cd vector
pET plasmid	Addgene	n/a	The pET3a vector offers ampicillin resistance, inducible expression of a target gene, and sequencing with T7 primers
Petri dishes	VWR	25384-342	Used for plating transformants on LB agar media
R2DP cells	Novagen	714033	BL21 derivatives with enhanced expression of eukaryotic proteins. Contain tRNAs of codons found to be rare in e. coli
SOC growth media	NEB	B9020S	Non-selective growth media for rapid growth during transformation
Sodium chloride (NaCl)	Thermo Fisher Scientific	BP358-1	Used in buffers and helps with protein stability
Sodium deoxycholate	Thermo Fisher Scientific	PI89905	Detergent used in protein extraction. Lyses cell walls
Solubilization Buffer	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 10 mM DTT, 6 M Urea. Adjust pH to 8.0
Tris base	Thermo Fisher Scientific	BP152-1	Common buffer used in the physiological pH range. Temperature-sensitive
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	M1122980101	Detergent used for cell lysis
Urea	Thermo Fisher Scientific	AAJ75826A7	First chaotropic agent for disrupting protein secondary structure
Zinc chloride (ZnCl2)	Thermo Fisher Scientific	AAA162810E	Stabilizes MMP structure. The zinc ion is found in the catalytic site of MMP-3