Визуализация сдвигов на схеме Нейрон-Глия с помощью метода визуализации кальция
Summary
Клеточная кальциевая визуализация является универсальной методологией для изучения динамической сигнализации отдельных клеток, на смешанных популяциях в культуре или даже на пробужденных животных, основанной на экспрессии кальциевых проницаемых каналов / рецепторов, которая дает уникальные функциональные сигнатуры.
Abstract
Здесь мы сообщаем о селективных моделях in vitro цепей на основе глии (астроциты, олигодендроциты и микроглия) и / или нейронов из периферических (ганглии дорсальных корней) и центральных тканей (кора, субвентрикулярная зона, органоид), которые динамически изучаются с точки зрения сдвигов кальция. Модель, выбранная для иллюстрации результатов, представляет собой сетчатку, простую ткань со сложными клеточными взаимодействиями. Кальций является универсальным мессенджером, участвующим в большинстве важных клеточных ролей. Мы объясняем в пошаговом протоколе, как нейронно-глиальные клетки сетчатки в культуре могут быть подготовлены и оценены, предвидя сдвиги кальция. В этой модели мы дифференцируем нейроны от глии на основе их селективного ответа на KCl и ATP. Кальциевые проницаемые рецепторы и каналы избирательно экспрессируются в разных компартментах. Для анализа реакции кальция мы используем ратиометрические флуоресцентные матрицы, такие как Fura-2. Этот зонд количественно оценивает концентрацию свободного Ca2 + на основе Ca2 + свободных и Ca2 + связанных форм, представляя два разных пика, основанных на интенсивности флуоресценции, воспринимаемой на двух длинах волн.
Introduction
Благодаря универсальным свойствам кальция как второго мессенджера, этот ион участвует в огромном количестве сигнальных активностей: транскрипции генов, рождении и смерти, пролиферации, миграции и дифференцировке, синаптической передаче и пластичности. Следовательно, метод, способный отслеживать динамику активации кальция с точностью и ловкостью, обеспечит способ наблюдения уникальных пространственно-временных реакций. Таким методом является метод визуализации клеточного кальция, который коррелирует функциональные данные сдвигов кальция с конкретными фенотипами клеток на основе их различных реакций.
Зонды Ca2+ были впервые разработаны в 1980-х годах, а более поздние улучшения позволили использовать эти молекулы в анализах живых клеток1. В качестве химического показателя Fura-2 считается стандартом для количественных измерений [Ca2+]i. Эфир ацетоксиметила (AM) этого показателя (т.е. Fura-2 AM) легко проникает в клеточную мембрану и может достигать внутриклеточных концентраций, в 20 раз превышающих инкубационное разбавление (например, [5 мкМ]o/[100 мкМ]i). Еще одним преимуществом Fura-2 является то, что он обладает хорошей устойчивостью к фотоотбеливанию; таким образом, визуализация этого индикатора в течение более длительных периодов времени не будет сильно влиять на его флуоресцентные возможности. Наконец, Fura-2 чувствителен к широкому диапазону уровней кальция, от ~100 нМ до ~100 мкМ, и имеет Kd ~145 нМ, что сопоставимо с покоящимся [Ca2+]i2. Позже была разработана визуализация кальция клеток с использованием лучших флуоресцентных микроскопов и методов вычислений вместе с ратиометрическими зондами, на которые не влияет нагрузка красителя.
Каждая клетка экспрессирует различные устройства кальция (насосы, транспортеры, рецепторы и каналы), которые способствуют конечному ответу в качестве определенной сигнатуры. Важным советом является поиск селективных реакций различных типов клеток, коррелирующих с их фенотипической экспрессией. Соответственно, существует, по крайней мере, два различных рецептора, которые действуют через сдвиги кальция: ионотропные рецепторы, которые пронизывают Ca2 + в быстром режиме, и медленные метаботропные рецепторы, связанные с сигнальными путями и внутриклеточными запасами, которые высвобождают Ca2 +, активируемые вторыми мессенджерами, такими как инозитолтрифосфат и циклическая ADP-рибоза3.
Например, клетки-предшественники экспрессируют нестин в незрелой сетчатке и показывают рецепторы ГАМК, деполяризованные ГАМК (или мусцимолом)4. Это происходит из-за Cl-электрохимического градиента с высоким внутриклеточным уровнем Cl−; по мере развития ткани транспортеры KCC2 переключаются с возбуждения на предшественниках на ингибирование на зрелых ГАМКергических нейронах5. С другой стороны, стволовые клетки, которые экспрессируют sox-2 в незрелой субвентрикулярной зоне (SVZ) постнатальных грызунов, также представляют метаботропные рецепторы H1, активированные гистамином, медленно увеличивающим Ca2+.6. Второй метаботропный рецептор из семейства протеазно-активированных рецепторов-1 (PAR-1), активированный тромбином и нисходящий к G(q/11) и фосфолипазе C (PLC), дает медленные сдвиги Ca2+ в олигодендроцитах (которые экспрессируют O4 и PLP), генерируемых мультипотентными нервными стволовыми клетками SVZ7.
В целом, нейроны экспрессируют зависимые от напряжения кальциевые каналы, а также основные рецепторы нейротрансмиттеров, проницаемые для Ca2+, как глутаматергические (AMPA, NMDA, kainate) и периферические и центральные никотиновые рецепторы. Хлорид калия обычно используется в качестве деполяризующего агента для активации периферических нейронов, как ганглиозные нейроны дорсального корня8 или центральные нейроны, как из субвентрикулярной зоны9 или сетчатки10. С другой стороны, АТФ признан основным глиотрансмиттером (в дополнение к D-серину), который активирует селективные Ca2+ проницаемые члены P2X, такие как P2X7 и P2X4. Оба рецептора представляют эквивалентные токи Ca2+, аналогичные тем, которые показаны NMDA-рецепторами, признанными крупнейшими токами Ca2+, активируемыми передатчиками11. Рецепторы P2X7 высоко экспрессируются на микроглии, но при более низкой плотности на астроцитах и олигодендроцитах, играя роль в высвобождении провоспалительных цитокинов12. Рецепторы P2X7 также экспрессируются на клетках Шванна13 и глии Мюллера в сетчатке14,15.
Известно, что сетчатка показывает почти все передатчики, наблюдаемые в мозге. Например, вертикальная ось (фоторецепторы, биполярные и ганглиозные клетки сетчатки) в основном глутаматергическая, с кальциепроницаемыми ampA или кайнатными рецепторами, экспрессируемыми в OFF-биполярных клетках и mgluR6, экспрессируемыми в ON-биполярных клетках16. Любопытно, что все три рецептора также обнаружены в глии Мюллера, которые связаны с путями кальция и инозитолтрифосфата17,18. Горизонтальная тормозная ось, состоящая из горизонтальных и амакриновых клеток, секретирует не только ГАМК, но и дофамин, ацетилхолин и другие классические нейромедиаторы. Амакриновые клетки являются основными типами клеток, обнаруженных в культурах птичьей сетчатки, показывая несколько типов кальциевых каналов, таких как глутаматергические, пуринергические, никотиновые и зависимые от напряжения кальциевые каналы. По этой причине это отличная модель для оценки различных свойств сдвигов кальция между нейронами и глией.
Таким образом, комбинация различных рецепторов и каналов, суммируемых с селективными фенотипическими маркерами во время развития с различными паттернами ответа агониста, позволяет создавать уникальные сигнатуры в стволе, предшественнике, нейроне, астроците, олигодендроците и микроглии, которые работают через селективные сигнальные устройства.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы использовали ткань сетчатки, чтобы показать, что реакции кальция, опосредованные KCl или АТФ, четко разделены на нейронные и глиальные реакции соответственно (рисунок 1). Хотя некоторые данные в литературе подразумевают, что рецепторы P2X7 экспрессируются в нейронах, кот…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Гранты, спонсоры и источники финансирования: MH является получателем стипендии PhD CNPq. HRF является получателем стипендии постдока, поддерживаемой CNPq (номер гранта HRF 152071/2020-2). RAMR поддерживается CNPq и FAPERJ (номера грантов E-26/202.668/2018, E-26/010.002215/2019, 426342/2018-6 и 312157/2016-9 и INCT-INNT (Национальный институт трансляционной неврологии).
Materials
| 15 mm coverslip | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | 111550 | Cell suport |
| 510 nm long-pass filter | Carl Zeiss | ||
| ATP | Sigma | A1852 | |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504044 | Suplement |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| CoolSNAP digital camera | Roper Scientific, Trenton, NJ | ||
| D-(+)-Glucose | Neon | 1466 | |
| DMEM/ F-12 | Gibco | 12400-24 | Cell culture medium |
| Excel Software | Microsoft | ||
| Fetal Calf Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | Suplement |
| Fluorescence Microscope | Axiovert 200; Carl Zeiss | B 40-080 | |
| Fura-2 AM | Molecular Probes | F1221 | Ratiometric Ca2+ indicator |
| Gentamicin Sulfate | Calbiochem | 1405-41-0 | antibiotics |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| Lambda DG-4 apparatus | Sutter Instrument, Novato, CA | DG-4PLUS/OF30 | |
| Laminin | Gibco | 23017-015 | Help cell adhesion |
| Metafluor software | Universal Imaging Corp. West Chester, PA | ||
| MgCl2 | Sigma | M4880 | |
| Na2HPO4 | Vetec | 129 | |
| NaCl | Isofar | 310 | |
| NaHCO3 | Vetec | 306 | |
| PH3 platform | Warner Intruments, Hamden, CT | 64-0286 | |
| Pluronic F-127 | Molecular Probes | P6866 | nonionic, surfactant |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | Help cell adhesion |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Gibco | 25200056 | Dissociation enzyme |
Riferimenti
- Tsien, R. Y., Pozzan, T., Rink, T. J. Calcium homeostasis in intact lymphocytes: cytoplasmic free calcium monitored with a new, intracellularly trapped fluorescent indicator. Journal of Cell Biology. 94 (2), 325-334 (1982).
- Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. Chemical calcium indicators. Methods. 46 (3), 143-151 (2008).
- Islam, M. S. Calcium Signaling: From Basic to Bedside. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1131, 1-6 (2020).
- De Melo Reis, R. A., et al. Functional identification of cell phenotypes differentiating from mice retinal neurospheres using single cell calcium imaging. Cellular and Molecular Neurobiology. 31 (6), 835-846 (2011).
- Ganguly, K., Schinder, A. F., Wong, S. T., Poo, M. GABA itself promotes the developmental switch of neuronal GABAergic responses from excitation to inhibition. Cell. 105 (4), 521-532 (2001).
- Schitine, C., et al. Ampakine CX546 increases proliferation and neuronal differentiation in subventricular zone stem/progenitor cell cultures. European Journal of Neuroscience. 35 (11), 1672-1683 (2012).
- Xapelli, S., et al. Modulation of subventricular zone oligodendrogenesis: a role for hemopressin. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 59 (2014).
- Ribeiro-Resende, V. T., et al. Mice lacking GD3 synthase display morphological abnormalities in the sciatic nerve and neuronal disturbances during peripheral nerve regeneration. PLoS One. 9 (10), 108919 (2014).
- Xapelli, S., et al. Activation of type 1 cannabinoid receptor (CB1R) promotes neurogenesis in murine subventricular zone cell cultures. PLoS One. 8 (5), 63529 (2013).
- Kubrusly, R. C. C., et al. Neuro-glial cannabinoid receptors modulate signaling in the embryonic avian retina. Neurochemistry International. 112, 27-37 (2018).
- Egan, T. M., Khakh, B. S. Contribution of calcium ions to P2X channel responses. Journal of Neuroscience. 24 (13), 3413-3420 (2004).
- Illes, P. P2X7 Receptors Amplify CNS Damage in Neurodegenerative Diseases. International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), (2020).
- Faroni, A., et al. Purinergic signaling mediated by P2X7 receptors controls myelination in sciatic nerves. Journal of Neuroscience Research. 92 (10), 1259-1269 (2014).
- Freitas, H. R., et al. Cannabinoids Induce Cell Death and Promote P2X7 Receptor Signaling in Retinal Glial Progenitors in Culture. Molecular Neurobiology. 56 (9), 6472-6486 (2019).
- Freitas, H. R., et al. Glutathione-Induced Calcium Shifts in Chick Retinal Glial Cells. PLoS One. 11 (4), 0153677 (2016).
- Yang, X. L. Characterization of receptors for glutamate and GABA in retinal neurons. Progress in Neurobiology. 73 (2), 127-150 (2004).
- Reis, R. A., Kubrusly, R. C., de Mello, M. C., de Mello, F. G. Transient coupling of NMDA receptor with ip3 production in cultured cells of the avian retina. Neurochemistry International. 26 (4), 375-380 (1995).
- López-Colomé, A. M., Ortega, A., Romo-de-Vivar, M. Excitatory amino acid-induced phosphoinositide hydrolysis in Müller glia. Glia. 9 (2), 127-135 (1993).
- Ventura, A. L., de Mello, F. G., de Melo Reis, R. A. Methods of dopamine research in retina cells. Methods in Molecular Biology. 964, 25-42 (2013).
- Miras-Portugal, M. T., Sebastián-Serrano, &. #. 1. 9. 3. ;., de Diego García, L., Díaz-Hernández, M. Neuronal P2X7 Receptor: Involvement in Neuronal Physiology and Pathology. Journal of Neuroscience. 37 (30), 7063-7072 (2017).
- Illes, P., Khan, T. M., Rubini, P. Neuronal P2X7 Receptors Revisited: Do They Really Exist. Journal of Neuroscience. 37 (30), 7049-7062 (2017).
- Schitine, C. S., et al. Functional plasticity of GAT-3 in avian Müller cells is regulated by neurons via a glutamatergic input. Neurochemistry International. 82, 42-51 (2015).
- Ferreira, D. D., Stutz, B., de Mello, F. G., Reis, R. A., Kubrusly, R. C. Caffeine potentiates the release of GABA mediated by NMDA receptor activation: Involvement of A1 adenosine receptors. Neuroscienze. 281, 208-215 (2014).
- Faria, R. X., Freitas, H. R., Reis, R. A. M. P2X7 receptor large pore signaling in avian Müller glial cells. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 49 (3), 215-229 (2017).
- Passos, A., et al. Regulation of the Serotonergic System by Kainate in the Avian Retina. Cellular and Molecular Neurobiology. 39 (7), 1039-1049 (2019).
- de Melo Reis, R. A., Ventura, A. L., Schitine, C. S., de Mello, M. C., de Mello, F. G. Müller glia as an active compartment modulating nervous activity in the vertebrate retina: neurotransmitters and trophic factors. Neurochemical Research. 33 (8), 1466-1474 (2008).
- Harada, K., Kamiya, T., Tsuboi, T. Gliotransmitter Release from Astrocytes: Functional Developmental, and Pathological Implications in the Brain. Frontiers in Neuroscience. 9, 499. 9, 499 (2015).
