Summary
La cirugía estereotáxica para atacar los sitios cerebrales en ratones comúnmente implica el acceso a través de los huesos del cráneo y es guiada por puntos de referencia del cráneo. Aquí describimos un enfoque estereotáxico alternativo para apuntar al tronco encefálico caudal y la médula espinal cervical superior a través de la cisterna magna que se basa en la visualización directa de los puntos de referencia del tronco encefálico.
Abstract
La cirugía estereotáxica para atacar los sitios cerebrales en ratones es comúnmente guiada por puntos de referencia del cráneo. El acceso se obtiene a través de agujeros de rebaba perforados a través del cráneo. Este enfoque estándar puede ser un desafío para los objetivos en el tronco encefálico caudal y la médula cervical superior debido a desafíos anatómicos específicos, ya que estos sitios están alejados de los puntos de referencia del cráneo, lo que lleva a la imprecisión. Aquí describimos un enfoque estereotáxico alternativo a través de la cisterna magna que se ha utilizado para apuntar a regiones discretas de interés en el tronco encefálico caudal y el cordón cervical superior. La cisterna magna se extiende desde el hueso occipital hasta el atlas (es decir, el segundo hueso vertebral), está llena de líquido cefalorraquídeo y está cubierta por duramadre. Este enfoque proporciona una ruta de acceso reproducible a estructuras seleccionadas del sistema nervioso central (SNC) que de otro modo serían difíciles de alcanzar debido a las barreras anatómicas. Además, permite la visualización directa de puntos de referencia del tronco encefálico muy cerca de los sitios objetivo, lo que aumenta la precisión al administrar pequeños volúmenes de inyección a regiones restringidas de interés en el tronco encefálico caudal y el cordón cervical superior. Finalmente, este enfoque brinda la oportunidad de evitar el cerebelo, que puede ser importante para los estudios motores y sensoriomotores.
Introduction
La cirugía estereotáxica estándar para atacar los sitios cerebrales en ratones1 comúnmente implica la fijación del cráneo utilizando un conjunto de barras para los oídos y una barra bucal. Las coordenadas se estiman entonces en función de los atlas de referencia 2,3 y los puntos de referencia del cráneo, a saber, bregma (el punto donde se unen las suturas de los huesos frontal y parietal) o lambda (el punto donde se unen las suturas de los huesos parietal y occipital; Figura 1A,B). A través de un orificio de rebaba en el cráneo por encima del objetivo estimado, se puede llegar a la región objetivo, ya sea para la entrega de microinyecciones o instrumentación con cánulas o fibras ópticas. Debido a la variación en la anatomía de estas suturas y errores en la localización de bregma o lambda 4,5, la posición de los puntos cero en relación con el cerebro varía de un animal a otro. Si bien los pequeños errores en la focalización, que resultan de esta variabilidad, no son un problema para objetivos grandes o cercanos, su impacto es mayor para áreas de interés más pequeñas que están alejadas de los puntos cero en los planos anteroposterior o dorsoventral y / o cuando se estudian animales de tamaño variable debido a la edad, la tensión y / o el sexo. Hay varios desafíos adicionales que son únicos para la médula oblonga y el cordón cervical superior. En primer lugar, pequeños cambios en las coordenadas anteroposteriores se asocian con cambios significativos en las coordenadas dorsoventrales en relación con la duramadre, debido a la posición y forma del cerebelo (Figura 1Bi)2,6,7. En segundo lugar, el cordón cervical superior no está contenido dentro del cráneo2. En tercer lugar, la posición inclinada del hueso occipital y la capa suprayacente de los músculos del cuello2 hace que el enfoque estereotáxico estándar sea aún más desafiante para las estructuras ubicadas cerca de la transición entre el tronco encefálico y la médula espinal (Figura 1Bi). Finalmente, muchas dianas de interés en el tronco encefálico caudal y la médula cervical son pequeñas2, requiriendo inyecciones precisas y reproducibles 8,9.
Un enfoque alternativo a través de la cisterna magna elude estos problemas. La cisterna magna es un gran espacio que se extiende desde el hueso occipital hasta el atlas (Figura 1A, es decir, el segundo hueso vertebral)10. Está lleno de líquido cefalorraquídeo y cubierto por la duramadre10. Este espacio entre el hueso occipital y el atlas se abre al anteroflexionar la cabeza. Se puede acceder navegando entre los vientres pareados suprayacentes del músculo longus capitis, exponiendo la superficie dorsal del tronco encefálico caudal. Las regiones de interés pueden ser atacadas en función de los puntos de referencia de estas regiones si se encuentran cerca de la superficie dorsal; o mediante el uso del obex, el punto donde el canal central se abre en el ventrículo IV, como un punto cero para que las coordenadas alcancen estructuras más profundas. Este enfoque se ha utilizado con éxito en una variedad de especies, incluidas la rata11, el gato12, el ratón 8,9 y el primate no humano13 para atacar el grupo respiratorio ventral, la formación reticular medial medular, el núcleo del tracto solitario, el área postrema o el núcleo hipogloso. Sin embargo, este enfoque no se utiliza ampliamente, ya que requiere conocimientos de anatomía, un conjunto de herramientas especializado y habilidades quirúrgicas más avanzadas en comparación con el enfoque estereotáxico estándar.
Aquí describimos un enfoque quirúrgico paso a paso para llegar al tronco encefálico y la médula cervical superior a través de la cisterna magna, visualizar puntos de referencia, establecer el punto cero (Figura 2) y estimar y optimizar las coordenadas objetivo para la entrega estereotáxica de microinyecciones en las regiones discretas del tronco encefálico y la médula espinal de interés (Figura 3). A continuación, discutimos las ventajas y desventajas relacionadas con este enfoque.
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Protocol
El autor declara que el protocolo sigue las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en el Centro Médico Beth Israel Deaconess.
1. Preparación de instrumentos quirúrgicos y marco estereotáxico
NOTA: La cirugía se realiza en condiciones asépticas. La esterilidad se mantiene mediante la técnica de punta estéril.
- Instale el brazo estereotáxico con una micropipeta o jeringa llena de un inyectable de su elección (virus adenoasociado (AAV) o trazador convencional) en el marco estereotáxico y prepare el adaptador de ratón (Figura 2A).
- Preparar instrumentos quirúrgicos en autoclave (Tabla de materiales) y colocarlos sobre una superficie estéril.
2. Inducción de anestesia y preparación del ratón
- Encienda O2 a 0.5 L/min y ajuste el vaporizador de isoflurano a 4.0, asegurándose de que el flujo de O2 sea a la caja de inducción.
PRECAUCIÓN: Asegúrese de que la caja de inducción de isoflurano se coloque en una capucha y que el isoflurano se retire del sitio quirúrgico. - Coloque el ratón (macho C57BL/6J de 10 semanas de edad) en la cámara de inducción.
- Una vez que la respiración se haya ralentizado, abra la cámara de inducción y levante ligeramente el ratón. Use cortapelos para eliminar el vello de la cabeza a los hombros.
3. Posicionamiento del ratón en el marco estereotáxico
- Mueva el ratón al marco estereotáxico y coloque la nariz en un cono nasal flexible. En esta etapa, asegúrese de que el flujo de O2 ahora se dirija al cono de la nariz.
- Coloque el ratón en el marco estereotáxico utilizando únicamente las barras para los oídos.
NOTA: Asegúrese de que las barras para los oídos estén uniformes y que la cabeza esté nivelada. - Anteroflex la cabeza del ratón a un ángulo de 90° guiando manualmente la nariz. Para asegurar esta posición, coloque una barrera de plástico entre los pilares de la barra auditiva del adaptador del mouse, paralela a los pilares. La parte plana del cráneo sirve como referencia, similar al enfoque de cráneo plano en la cirugía estereotáxica convencional.
NOTA: No flexione demasiado la cabeza (es decir, más allá de un ángulo de 90 ° entre el plano del hueso frontal del cráneo y el plano de la superficie de la mesa) ya que esto impide el flujo de aire a través de las vías respiratorias superiores. Si se impide el flujo de aire, reposicione el ratón, asegurándose de que el cuerpo esté apoyado debajo del tronco y se coloque una tarjeta de plástico a 90 ° entre el plano del hueso frontal del cráneo y el plano de la superficie de la mesa como se describe en la Figura 2A, C. - Coloque la almohadilla térmica debajo del mouse y luego asegúrese de que el cuello y el resto del cuerpo estén colocados al mismo nivel (es decir, a aproximadamente 180 ° o paralelos a la mesa). La caja de herramientas que sostiene las tijeras de resorte se puede utilizar para levantar el cuerpo a esta posición.
NOTA: Este paso es importante ya que el tronco encefálico caudal y el cordón cervical superior se mueven dependiendo de la posición, en contraste con las partes más rostrales del SNC que se mantienen en su lugar por el cráneo. - Inyecte una dosis única de 4 mg/kg de Meloxicam de liberación lenta (SR) por vía subcutánea (c.s.) a un volumen de 2 μL/g de peso corporal y coloque lubricante en los ojos.
- Limpie el sitio de la incisión quirúrgica primero con una almohadilla de preparación de alcohol al 70%, luego con una almohadilla de preparación de betadina y luego nuevamente con una almohadilla de preparación de alcohol y deje secar.
- Coloque una cortina debajo del cuerpo.
- Desinfecte las manos y póngase guantes estériles.
- Coloque una cortina en el sitio quirúrgico.
4. Cirugía para acceder a la cisterna magna
- Asegúrese de que el ratón esté anestesiado adecuadamente pellizcando los dedos de los pies o revisando el reflejo corneal.
- Reducir el isoflurano a niveles de mantenimiento (2.0).
- Haga una incisión de 1-1.2 cm con la cuchilla quirúrgica # 10 desde el borde del hueso occipital hacia los hombros en un movimiento suave.
- Haga una incisión en el rafe de la línea media del músculo trapecio. Esto expone los músculos pareados de longus capitis.
NOTA: En ratones, el músculo trapecio es un músculo muy delgado, casi transparente. Asegúrese de permanecer en la línea media y no corte los músculos subyacentes, ya que esto causará sangrado innecesario. - Coloque ambos ganchos retractores entre los músculos de longus capitis emparejados, uno orientado a la izquierda y el otro a la derecha. El peso de los hemostáticos proporciona tensión a los ganchos retractores que pueden modificarse reajustando la posición de los hemostáticos.
- Coloque el microscopio quirúrgico en su lugar para visualizar mejor el campo quirúrgico.
- Use las pinzas de laminectomía roma para separar los vientres izquierdo y derecho del músculo longus capitis emparejado, comenzando desde el occipucio, donde la línea media es fácilmente visible. Guíe las pinzas romas a través del hueso del occipucio en la línea media hasta donde se encuentra con la duramadre cisternal, y luego continúe a través de la duramadre hasta el atlas.
NOTA: No hay necesidad de cortar a través de los músculos de la capitis larga emparejados, ya que nada los mantiene unidos en la línea media; hacerlo causará sangrado innecesario. - Reposicionar los retractores y ajustar la tensión reposicionando los hemostáticos, abriendo la vista de la cisterna magna.
- Use las pinzas de laminectomía roma para separar los músculos más en la línea media para obtener una buena ventana de visualización del tronco encefálico y el cerebelo.
- Repita los pasos 4.7-4.9 según sea necesario hasta que el cerebelo y el tronco encefálico aparezcan a la vista debajo de la duramadre.
- Usando fórceps de laminectomía contundentes, limpie la duramadre de las pequeñas hebras de tejido conectivo moviendo los fórceps desde la línea media en una dirección lateral, hasta que haya una vista clara del tronco encefálico y para crear más espacio lateral, según sea necesario para el objetivo.
5. Apertura de la membrana cisternal
- Use las pinzas Dumont en ángulo (# 4/45) para agarrar la duramadre, que se extiende desde el hueso occipital hasta el atlas. Agarre la duramadre cerca del hueso occipital y use las tijeras de resorte para hacer una pequeña abertura (~ 0.5 a 1.5 mm) en la duramadre.
NOTA: En esta ubicación rostral, el espacio entre el tronco encefálico y la duramadre suprayacente es más amplio, proporcionando un amplio espacio para la manipulación segura de la duramadre. - Use las tijeras de resorte para levantar la duramadre y abrir más la duramadre. El tamaño de la ventana depende del objetivo.
NOTA: Se necesitará una ventana más grande al realizar múltiples inyecciones longitudinales o inyecciones bilaterales; una pequeña ventana será suficiente al realizar inyecciones unilaterales o de línea media únicas. - Una vez que se abre la duramadre, drene el exceso de líquido cefalorraquídeo con una punta de taco estéril.
6. Identificación de puntos de referencia y punto cero
- Vea la superficie dorsal del tronco encefálico con puntos de referencia detallados a través de la duramadre abierta. El obex, el punto donde el canal central se abre en el ventrículo IV, es el punto cero estándar anterior-posterior y mediolateral.
7. Coordenadas objetivo
NOTA: Para varios objetivos, hemos incluido una lista de coordenadas estándar con coordenadas anteriores posteriores (AP) y mediolaterales (ML) relativas a bregma de punto cero y coordenadas cisterna magna con coordenadas AP y ML relativas a obex de punto cero para facilitar la transición entre metodologías (Tabla 1). Las coordenadas dorsoventrales (DV) son relativas a la superficie del cerebro o cerebelo (enfoque estándar) o la superficie del tronco encefálico o del cordón cervical superior (enfoque cisterna magna) en el punto de entrada de AP y ML. La planificación debe hacerse antes de la cirugía.
- Utilice los tres conjuntos de coordenadas para determinar el objetivo: AP, ML y DV. Debido a la posición de la cabeza, la orientación relativa de las estructuras del tronco encefálico varía según la ubicación.
- Para la distancia objetivo >0,4 mm desde el caudal hasta el obex (Figura 1B, verde) realice lo siguiente.
- AP: Utilice cualquier atlas de referencia estereotáxico estándar (por ejemplo, atlas de Paxinos y Franklin2) o serie de tejido cortada en el plano transversal para estimar la distancia AP entre el obex y el objetivo.
- ML: Utilice cualquier atlas de referencia estereotáxico estándar o serie de tejido cortada en el plano transversal para estimar la distancia ml entre el obex y el objetivo.
- DV: Estimar las coordenadas relativas a la superficie del cerebro o cerebelo en el punto objetivo AP y ML. Utilice cualquier atlas de referencia estereotáxico estándar o serie de tejido cortada en el plano transversal para estimar la distancia entre la superficie del tronco encefálico en las coordenadas AP y ML deseadas y el objetivo.
- Para la distancia objetivo <0,4 mm desde el caudal hasta el obex (Figura 1B, naranja) realice lo siguiente.
- AP: Ajuste las coordenadas para tener en cuenta la anteroflexión del tronco encefálico. Para las coordenadas ventrales y rostrales, el punto de entrada del tronco encefálico AP será más caudal en relación con la coordenada AP objetivo en el plano estándar.
- ML: Derivar coordenadas objetivo a partir de un atlas de referencia estereotáxico estándar o una serie de tejidos cortadas en el plano transversal. Las coordenadas serán relativas a la línea media visualizada en el nivel de AP de destino.
- DV: Estimar las coordenadas relativas a la superficie del tronco encefálico en el punto objetivo AP y ML. Ajuste la DV para tener en cuenta la anteroflexión del tronco encefálico. Para las coordenadas ventrales y rostrales, las coordenadas DV serán mayores que la distancia desde la superficie dorsal del tronco encefálico en el plano estándar.
- Para la distancia objetivo >0,4 mm desde el caudal hasta el obex (Figura 1B, verde) realice lo siguiente.
8. Inyección del objetivo
- Baje la pipeta o jeringa hasta el objetivo utilizando el brazo estereotáxico e inyecte la solución como para los enfoques estereotáxicos estándar. Dejar en su lugar durante 1-5 min después de la inyección, para evitar un seguimiento de la aguja cuando se utilizan volúmenes entre 3-50 nL. Luego, levante la pipeta o la jeringa con el brazo estereotáxico.
- Repita el paso 8.1. para múltiples objetivos.
9. Cierre del campo quirúrgico
- Retire los ganchos con cuidado del campo quirúrgico. Los músculos del longus capitis emparejados volverán a caer en una posición neutral, cubriendo completamente la cisterna magna. No cierre el músculo trapecio y la duramadre en la línea media, ya que son demasiado frágiles para sostener las suturas.
- Cierre la piel con tres suturas de nylon o polipropileno (5-0 o 6-0).
10. Cuidados postoperatorios
- Apague el isoflurano y retire el ratón del marco estereotáxico. Coloque el ratón en una jaula limpia en una almohadilla térmica y observe hasta que esté despierto y en movimiento.
- Controle el estado de salud, el peso y las suturas en los días postoperatorios 1-3. Retire las suturas el día 10 si aún no se han retirado.
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Representative Results
El enfoque cisterna magna permite apuntar a las estructuras del tronco encefálico caudal y del cordón cervical superior que de otro modo serían difíciles de alcanzar a través de enfoques estereotáxicos estándar o que son propensas a una orientación inconsistente. La cirugía para llegar a la cisterna magna requiere incisiones de la piel, una capa delgada de músculo trapecio y la abertura de la duramadre y, por lo tanto, es bien tolerada por los ratones. Es especialmente eficiente y menos invasivo cuando se dirige a múltiples sitios (longitudinalmente dispersos o bilaterales), ya que no requiere la perforación de múltiples orificios de rebabas como en los enfoques estereotáxicos estándar. En ratones, hemos dirigido rutinariamente estructuras como el núcleo hipogloso9, el grupo respiratorio ventral8 y la formación reticular adyacente8 en el tronco encefálico caudal utilizando el enfoque cisterna magna, como ilustramos aún más para el núcleo hipogloso y la médula ventromedial (GiV) en la Figura 3. Por ejemplo, el núcleo hipogloso es una columna delgada pero rostrocaudalmente alargada de motoneuronas en la médula dorsal oblonga y su polo rostral puede ser dirigido a través de un enfoque estándar. Sin embargo, como las coordenadas DV (~ 4.5 mm) son dictadas principalmente por el cerebelo suprayacente con solo 1.2-1.4 mm entrando en el tronco encefálico, una diferencia relativamente pequeña en el posicionamiento de la cabeza del ratón podría resultar fácilmente en una inyección fuera de lugar. Debido a la proximidad de este objetivo al obex de punto cero, puede ser dirigido de manera más confiable a través del enfoque cisterna magna. Además, el extremo caudal del núcleo hipogloso que se extiende hasta la transición entre el tronco encefálico y la médula espinal puede ser dirigido por el mismo enfoque cisterna magna, mientras que el enfoque estándar tendría que modificarse para alcanzar dicho sitio caudal inclinando el enfoque AP y ajustando las coordenadas para evitar el hueso occipital y la musculatura del cuello suprayacente.
Para determinar la precisión del enfoque cisterna magna versus el enfoque estándar, medimos la distancia entre los sitios objetivo previstos y reales en los planos anteroposterior, mediolateral y dorsoventral para ventral (médula ventromedial; GiA/V; N = 10) y dorsal (NuXII; N = 16) regiones. Las mediciones se realizaron en secciones transversales del tronco encefálico caudal (Figura 3). Los resultados (Figura 4) muestran errores significativamente menores en los planos anteroposterior, mediolateral y especialmente dorsoventral para el enfoque cisterna magna en comparación con el enfoque estándar. Estos resultados resaltan la mayor precisión del enfoque cisterna magna para estos objetivos. Hemos incluido coordenadas estereotáxicas estándar (relativas a bregma, derivadas de Paxinos y Franklin 2, pero optimizadas para nuestros estudios) y coordenadas cisterna magna (relativas al obex) en la Tabla 1. Todas estas coordenadas han sido optimizadas y verificadas como se muestra para el núcleo hipogloso y la médula ventromedial en la Figura 3.
Figura 1: Representación esquemática de puntos de referencia clave, áreas objetivo y el plano del enfoque estereotáxico cisterna magna. (A) Puntos de referencia anatómicos clave y posicionamiento en el plano sagital. B) Esferas a las que se puede llegar mediante el enfoque estereotáxico estándar frente al enfoque estereotáxico cisterna magna y la relación con sus puntos de referencia. i) El enfoque estándar hace uso de puntos de referencia óseos bregma y lambda, que están distantes de las regiones objetivo en magenta y púrpura. El área en magenta (médula ovina oblonga y cordón cervical superior) es difícil de alcanzar debido a la inclinación del hueso occipital y los músculos del cuello. El área en púrpura (médula rostral oblonga) es propensa al movimiento y distante de los puntos de referencia tradicionales. ii) El enfoque cisterna magna es apropiado para acceder a la médula caudal oblonga y al cordón cervical superior y tiene ventajas al estudiar estructuras del tronco encefálico que se organizan en columnas longitudinales que se extienden desde la médula caudal oblongata rostralmente, hasta el nivel de la protuberancia caudal. (C) Esquema de los planos de varios atlas de referencia estereotáxicos en relación con el enfoque cisterna magna. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Descripción general esquemática paso a paso del enfoque estereotáxico cisterna magna. (A) Adaptador de ratón con barras para los oídos colocadas uniformemente en el nivel más alto, la barra bucal en una posición más baja y una tarjeta de plástico para asegurar la cabeza anteroflexionada en un ángulo de 90 °. (B) Asegure el ratón en el marco estereotácxico utilizando las barras auriculares y anteroflex la cabeza a 90° y manténgalo en posición a través de una tarjeta de plástico rígido, con el marco estereotáxico como referencia. (C) Asegúrese de que el cuerpo esté elevado para que esté en el mismo plano que el occipucio. Palpate puntos de referencia clave. (D) Hacer una incisión en la piel desde el occipucio hasta la parte rostral de los hombros. (E) Hacer una incisión en el rafe del músculo trapecio. Asegúrese de permanecer en la línea media y no corte los músculos subyacentes. (F) Identificar la línea media entre los dos vientres del músculo longus capitis, comenzando en el occipucio, y guiar los fórceps de laminectomía en dirección caudal. (G) Coloque cada uno de los ganchos de la herida entre los vientres del músculo longus capitis y vuelva a colocarlos hasta que la cisterna magna esté a la vista. (H) Identificar puntos de referencia óseos (hueso occipital, atlas), la duramadre que se extiende entre estas estructuras óseas, y el cerebelo y el tronco encefálico subyacentes. Limpie la duramadre según sea necesario para exponer el nivel objetivo. (I) Usando tijeras de resorte y fórceps finos abra la duramadre. (J) Identifique el obex, que forma el punto cero AP y ML. Mueva la pipeta a las coordenadas AP y ML de su elección. Baje la pipeta hasta que llegue a la superficie dorsal del tronco encefálico. Este es el punto cero DV. Baje la pipeta a la coordenada deseada. (K) Retire la pipeta y los ganchos de la herida y deje que los músculos del longus capitis retomen su posición original. (L) Cierre la herida y retire el ratón del marco estereotáxico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Evaluación de las coordenadas objetivo. Fotomicrografías de bajo aumento del tronco encefálico caudal. (A) Inyección de la subunidad b de la toxina del cólera trazadora retrógrada (CTb; azul) en el núcleo hipogloso de un ratón reportero ChAT-cre L10 GFP (verde) (hembra, 6 meses de edad). Tenga en cuenta que la inyección de CTb está restringida al núcleo hipogloso. (B) Transfección de células glutamatérgicas de un ratón vGluT2-ires-cre L10 GFP reportero (verde) (macho, 2 meses de edad) con un trazador anterógrado condicional (magenta) en la parte ventral de la médula medial caudal oblonga (polo caudal de la región GiV). (C) Rastreo retrógrado condicional en un ratón vGLuT2-ires-cre (macho, 2 meses de edad) que muestra transfección TVA (magenta) de neuronas glutamatérgicas e infección por rabia modificada (verde) en la médula oblonga medial caudal (polo caudal de la región GiV). El virus de la rabia se inyectó en la médula espinal cervical superior. Los puntos de referencia internos sirven como guía. Abreviaturas-cAmb: Núcleo compacto del complejo ambiguus; Ap: Área Postrema; DMV: Núcleo motor dorsal del vago; GiV: Núcleo gigantocelular, parte ventral; IO: Oliva inferior; IRt: Núcleo Reticular Intermedio; LRN: Núcleo reticular lateral; NuXII- Núcleo hipogloso; sol: Núcleo del Tracto Solitario; Sp5: Núcleo trigémino espinal; VRG: grupo respiratorio ventral. Barra de escala: 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Comparación de la precisión entre los enfoques estándar y cisterna magna. Distancia media entre el centro del objetivo previsto y el centro del sitio real en el plano anteroposterior (A), el plano mediolateral (B) y el plano dorsoventral (C). Los datos se obtuvieron de N = 13 ratones adultos utilizando un enfoque estándar y N = 13 ratones adultos utilizando un enfoque cisterna magna. El radio del objetivo se fijó en 30 μm. Los resultados muestran una mayor precisión en el plano anteroposterior (t(24) = 2,08, p = 0,049; prueba t de dos colas; alfa 0,05), plano mediolateral (t(24) = 2,55, p = 0,018; prueba t de dos colas; alfa 0,05) y plano dorsoventral (t(24) = 4,33, p = 0,0002; prueba t de dos colas; alfa 0,05). Los gráficos de barras representan la media con desviación estándar y los puntos individuales representan valores en cada ratón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Visión general de las coordenadas estereotáxicas estándar y cisterna magna para apuntar a las estructuras del tronco encefálico caudal. Tenga en cuenta que tanto para el enfoque estándar como para el de cisterna magna, las coordenadas del atlaspaxinos y Franklin 2 se han ajustado hasta que las regiones de interés fueron adecuadamente dirigidas según lo verificado por la histología (Figura 3). Además, tenga en cuenta que las áreas en la formación reticular carecen de límites bien definidos y están aquí etiquetadas como en Paxinos y Franklin2. Abreviaturas-AP: anteroposterior. ML: mediolateral. DV: dorsoventral. ChAT: Colina acetiltransferasa; F: Femenino; M: Hombre; M&F: Masculino y Femenino; NA: no aplicable; Pet1: factor de transcripción 1 expresado por plasmacitoma; Sert: Transportador de serotonina, vGaT: Transportador vesicular de GABA; vGluT2: Transportador de glutamato vesicular 2; WT: Tipo salvaje. Todas las coordenadas están en milímetros (mm). Haga clic aquí para descargar esta tabla.
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Discussion
La cirugía estereotáxica estándar comúnmente se basa en puntos de referencia del cráneo para calcular las coordenadas de los sitios objetivo en el SNC1. Luego se accede a los sitios objetivo a través de orificios de rebaba que se perforan a través del cráneo1. Este método no es ideal para el tronco encefálico caudal, ya que los sitios objetivo se encuentran distantes de los puntos de referencia del cráneo en los planos anteroposterior y dorsoventral2 y como la anatomía del cráneo y los músculos suprayacentes hacen que el acceso sea un desafío6 (Figura 1Bi). Nuestro estudio describe un enfoque estereotáxico alternativo para acceder a los sitios objetivo en el tronco encefálico caudal y la médula espinal superior llamado enfoque cisterna magna. Las características clave que hacen que este método sea diferente de un enfoque estereotáctico estándar son el posicionamiento, con la anteroflexión de la cabeza para abrir la cisterna magna, y el uso de puntos de referencia clave del tronco encefálico en la superficie dorsal del tronco encefálico como puntos de referencia como el obex. Nuestros resultados indican que este enfoque es adecuado para la entrega de pequeños volúmenes (5-50 nL) de trazadores o virus adenoasociados (AAV) en estructuras discretas del tronco encefálico. Además, el uso de un punto de referencia que represente un hito del SNC, en lugar de una estructura ósea, y que esté muy cerca del objetivo previsto aumenta la reproducibilidad y la precisión para objetivos pequeños y pequeños volúmenes de inyección, según sea relevante para el mapeo de circuitos y los estudios quimiogenéticos (Figura 3)14,15.
Como con cualquier protocolo, el enfoque cisterna magna tiene pasos que son críticos para lograr la reproducibilidad. Al igual que con cualquier enfoque estereotáxico que depende de coordenadas en tres planos diferentes (anteroposterior, mediolateral y dorsoventral), el posicionamiento es crítico. Para el enfoque cisterna magna, esto implica no solo la posición de la cabeza, que debe ser anteroflexionada a 90°, sino también la del cuerpo, que debe elevarse para que el tronco encefálico caudal y el cordón cervical superior estén en el mismo plano. Otro paso crítico es evitar manipulaciones innecesarias que causen sangrado, ya que esto dificultaría la visualización de puntos de referencia clave. Hay dos manipulaciones que conllevan un alto riesgo de sangrado. En primer lugar, la duramadre que cubre la cisterna magna está cubierta por un músculo relativamente grande (longus capitis). Como este es un músculo emparejado, con un vientre a cada lado de la línea media, los dos vientres de este músculo solo necesitarán separarse suavemente en la línea media. La incisión de estos músculos no es necesaria y causará sangrado. En segundo lugar, en la apertura exitosa de la duramadre, un número variable de venas con un curso variable se hará visible en la parte superior de la superficie dorsal del tronco encefálico caudal y el cordón cervical superior. Estas venas deben evitarse aplicando pequeños ajustes en las coordenadas (hasta 0,1 mm) o, si el paradigma experimental lo permite, seleccionando un objetivo diferente.
Una ventaja importante del enfoque cisterna magna es que proporciona acceso al tronco encefálico y a las estructuras cervicales superiores que son difíciles de alcanzar cuando se utiliza el plano estereotáxico estándar, ya que se encuentran cerca del extremo caudal o simplemente caudal del hueso occipital. Además, para los objetivos en la médula oblonga, el enfoque evita el cerebelo y, por lo tanto, los efectos de la lesión cerebelosa o el etiquetado espurio a través de un tracto con aguja, que pueden afectar los resultados del estudio cuando se utiliza la metodología estándar no son una preocupación. Otra ventaja del enfoque cisterna magna es que la superficie dorsal del tronco encefálico se hace visible. Esto brinda la oportunidad de utilizar un punto de referencia en la superficie dorsal como punto de referencia para las coordenadas. Además, el enfoque es flexible y se puede optimizar dependiendo del objetivo. Por ejemplo, utilizamos un punto de referencia de línea media, el obex, como punto de referencia. Sin embargo, cuando se dirigen a estructuras dorsales, la estructura de interés en sí misma puede dictar el paisaje de la superficie dorsal. Por ejemplo, el núcleo cuneado externo sobresale dorsalmente y, por lo tanto, se puede visualizar e inyectar directamente. Para objetivos laterales, como el grupo respiratorio ventral o el complejo ambiguo, la ventana de la cisterna magna se puede aumentar en dirección lateral. Del mismo modo, para la orientación de las estructuras cervicales superiores, la ventana se puede extender hacia el atlas. Si bien utilizamos un adaptador de ratón colocado en un marco estereotáctico de animales grandes, el enfoque se puede adaptar fácilmente a otros marcos o configuraciones, siempre que se sigan los pasos clave. Por ejemplo, en lugar de una tarjeta de plástico, la barra bucal se puede colocar contra el puente de la nariz para mantener la cabeza en una posición anteroflexionada estable. Vale la pena señalar que las coordenadas de los sitios objetivo del tronco encefálico con el obex como punto cero, como se proporciona en la Tabla 1, sirven como referencia, y los ajustes pueden indicarse en función de la tensión del ratón, la edad, el sexo, la calibración del brazo estereotáxico y la técnica de posicionamiento, similar a los ajustes que se deben realizar al derivar las coordenadas objetivo para un enfoque estándar de un atlas de referencia. Esto requiere una visión del plano del enfoque, especialmente para objetivos más rostrales como se ilustra en la Figura 1. Las pruebas de coordenadas se pueden realizar mediante el uso de diferentes trazadores, por ejemplo, perlas fluorescentes o subunidad b de toxina del cólera marcada con fluores para diferentes coordenadas en el mismo ratón. Los análisis histológicos de las secciones del tronco encefálico/tejido espinal (no cubiertas en este protocolo) proporcionan retroalimentación sobre la localización en relación con los puntos de referencia internos objetivos 8,9,11,16 o para su comparación con un atlas de referencia. Las coordenadas se pueden ajustar, probar de nuevo y finalizar.
El enfoque cisterna magna también tiene limitaciones. Las regiones del SNC a las que se puede llegar a través de este enfoque están restringidas a la protuberancia caudal, la médula oblonga y el cordón cervical superior. Mientras que la protuberancia caudal se puede acceder fácilmente a través del enfoque estándar, el enfoque cisterna magna tiene ventajas al estudiar subdivisiones de estructuras orientadas longitudinalmente que se extienden desde la médula oblonga hasta la protuberancia caudal, como es el caso de las subdivisiones dentro de la formación reticular. Otra limitación relativa ocurre cuando se utiliza este enfoque por segunda vez en el mismo ratón, por ejemplo, en el rastreo de rabia modificada14. La presencia de tejido cicatricial puede aumentar la duración de la cirugía u ocultar puntos de referencia menores. Sin embargo, en nuestras manos, este método todavía ha sido superior al enfoque estereotáxico estándar en este caso, ya que el sitio de la primera inyección se puede documentar en relación con la posición de las venas de otros puntos de referencia únicos, lo que facilita encontrar el punto de entrada exacto hacia atrás. Si bien este enfoque es superior para los estudios de rastreo en la médula caudal y la médula espinal superior, no se puede usar para implantar hardware de forma crónica. Por lo tanto, para la optogenética in vivo y los estudios de imágenes de calcio que requieren la implantación de fibras ópticas17 , el enfoque cisterna magna se puede utilizar primero para administrar un AAV al sitio objetivo, seguido de una segunda cirugía utilizando un enfoque estándar para instrumentar ratones con fibras o cánulas. Este enfoque permite mantener el sitio de destino discreto, mientras que la colocación de fibra / hardware es más indulgente (es decir, puede ser menos precisa), debido al tamaño relativamente grande del hardware. Por último, el enfoque cisterna magna requiere habilidades quirúrgicas más avanzadas que un enfoque estereotáxico estándar. En lugar de reconocer puntos de referencia óseos simples, requiere una visión de los puntos de referencia musculoesqueléticos y del tronco encefálico más complejos. Además, como con cualquier cirugía delicada, el éxito y la eficiencia del procedimiento dependen de un conjunto de herramientas adecuado que esté en excelentes condiciones. Este protocolo aborda estos últimos problemas y puede ser utilizado como una guía detallada por los experimentadores.
En conclusión, el enfoque cisterna magna es complementario al enfoque estereotáxico estándar y proporciona múltiples ventajas cuando se dirige al tronco encefálico caudal y al cordón cervical superior, a los que no se puede acceder fácilmente a través de un enfoque estereotáxico estándar. Utiliza puntos de referencia que son SNC en lugar de puntos de referencia óseos que están muy cerca de los objetivos previstos, lo que aumenta la reproducibilidad y la precisión. Esto hace que el enfoque sea especialmente valioso cuando es necesario administrar pequeños volúmenes de inyección a sitios discretos en el contexto de un mapeo detallado o estudios quimiogenéticos. Este enfoque también es relevante para los enfoques quimiogenéticos funcionales, optogenéticos, fotometría de fibra o lesiones, donde un virus O toxina AAV se administra a un objetivo con función motora o integración sensoriomotora como lectura: evita un curso a través del cerebelo para objetivos en la médula oblonga y, por lo tanto, limita su interferencia en los resultados del estudio. Desde el punto de vista del bienestar animal, el procedimiento no requiere perforar múltiples orificios de rebabas para acceder a los sitios bilateral o longitudinalmente, lo que reduce la duración de la cirugía y la invasividad del procedimiento. Si bien describimos el enfoque en detalle para ratones, los mismos principios se aplican a otras especies 11,12,13.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por R01 NS079623, P01 HL149630 y P01 HL095491.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol pad | Med-Vet International | SKU: MDS090735Z | skin preparation for the prevention of surgical site infection |
| Angled forceps, Dumont #5/45 | FST | 11251-35 | only to grab dura |
| Betadine pad | Med-Vet International | SKU:PVP-PAD | skin preparation for the prevention of surgical site infection |
| Cholera toxin subunit-b, Alexa Fluor 488/594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | 488: C34775, 594: C22842 | Fluorescent tracer |
| Clippers | Wahl | Model MC3, 28915-10 | for shaving fur at surgical site |
| Electrode holder with corner clamp | Kopf | 1770 | to hold glass pipette |
| Flowmeter | Gilmont instruments | model # 65 MM | to regulate flow of isoflurane and oxygen to mouse on the surgical plane |
| Fluorescent microspheres, polystyrene | Thermo Fisher Scientific | F13080 | Fluorescent tracer |
| Heating pad | Stoelting | 53800M | thermoregulation |
| Induction chamber with port hook up kit | Midmark Inc | 93805107 92800131 | chamber providing initial anasthesia |
| Insulin Syringe | Exelint International | 26028 | to administer saline and analgesic |
| Isoflurane | Med-Vet International | SKU:RXISO-250 | inhalant anesthetic |
| Isoflurane Matrix VIP 3000 vaporizer | Midmark Inc | 91305430 | apparatus for inhalant anesthetic delivery |
| Laminectomy forceps, Dumont #2 | FST | 11223-20 | only to clean dura |
| Medical air, compressed | Linde | UN 1002 | used with stimulator & PicoPump for providing air for precision solution injection |
| Meloxicam SR | Zoo Pharm LLC | Lot # MSR2-211201 | analgesic |
| Microhematocrit borosilicate glass pre calibrated capillary tube | Globe Scientific Inc | 51628 | for transfection of material to designated co-ordinates |
| Mouse adaptor | Stoelting | 0051625 | adapting rat stereotaxic frame for mouse surgery |
| Needle holder, Student Halsted- Mosquito Hemostats | FST | 91308-12 | for suturing |
| Oxygen regulator | Life Support Products | S/N 909328, lot 092109 | regulate oxygen levels from oxygen tank |
| Oxygen tank, compressed | Linde | USP UN 1072 | provided along with isoflurane anasthesia |
| Plastic card | not applicable | not applicable | any firm plastic card, cut to fit the stereotactic frame (e.g. ID card) |
| Pneumatic PicoPump ( or similar) | World Precision Instruments (WPI) | SYS-PV820 | For precision solution injection |
| Saline, sterile | Mountainside Medical Equipment | H04888-10 | to replace body fluids lost during surgery |
| Scalpel handle, #3 | FST | 10003-12 | to hold scalpel |
| Scissors, Wagner | FST | 14070-12 | to cut polypropylene suture |
| Spring scissors, Vannas 2.5mm with accompanying box | FST | 15002-08 | scissors only to open dura, box to elevate body |
| Stereotactic micromanipulator | Kopf | 1760-61 | attached to electrode holder to adjust position based on co-ordinates |
| Stereotactic 'U' frame assembly and intracellular base plate | Kopf | 1730-B, 1711 | frame for surgery |
| Sterile cotton tipped applicators | Puritan | 25-806 10WC | absorbing blood from surgical field |
| Sterile non-fenestrated drapes | Henry Schein | 9004686 | for sterile surgical field |
| Sterile opthalmic ointment | Puralube | P1490 | ocular lubricant |
| Stimulator & Tubing | Grass Medical Instruments | S44 | to provide controlled presurred air for precision solution injection |
| Surgical Blade #10 | Med-Vet International | SKU: 10SS | for skin incision |
| Surgical forceps, Extra fine Graefe | FST | 11153-10 | to hold skin |
| Surgical gloves | Med-Vet International | MSG2280Z | for asceptic surgery |
| Surgical microscope | Leica | Model M320/ F12 | for 5X-40X magnification of surgical site |
| Suture 5-0 polypropylene | Oasis | MV-8661 | to close the skin |
| Tegaderm | 3M | 3M ID 70200749250 | provides sterile barrier |
| Universal Clamp and stand post | Kopf | 1725 | attached to stereotactic U frame and intracellular base plate |
| Wound hook with hartman hemostats | FST | 18200-09, 13003-10 | to separate muscles and provide surgical window |
References
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