Modellazione dell'emorragia intraventricolare neonatale attraverso l'iniezione intraventricolare di emoglobina
Summary
Presentiamo un modello di emorragia intraventricolare neonatale utilizzando cuccioli di ratto che imita la patologia osservata negli esseri umani.
Abstract
L’emorragia intraventricolare neonatale (IVH) è una conseguenza comune della nascita prematura e porta a lesioni cerebrali, idrocefalo postemorragico (PHH) e deficit neurologici per tutta la vita. Mentre la PHH può essere trattata con procedure di diversione temporanea e permanente del liquido cerebrospinale (CSF) (serbatoio ventricolare e shunt ventricolo-peritoneale, rispettivamente), non ci sono strategie farmacologiche per prevenire o trattare la lesione cerebrale indotta da IVH e l’idrocefalo. Sono necessari modelli animali per comprendere meglio la fisiopatologia della fecondazione in vitro e testare i trattamenti farmacologici. Mentre esistono modelli di IVH neonatale, quelli che provocano in modo affidabile l’idrocefalo sono spesso limitati dalla necessità di iniezioni di grandi volumi, che possono complicare la modellazione della patologia o introdurre variabilità nel fenotipo clinico osservato.
Recenti studi clinici hanno implicato l’emoglobina e la ferritina nel causare l’allargamento ventricolare dopo IVH. Qui, sviluppiamo un modello animale semplice che imita il fenotipo clinico di PHH utilizzando iniezioni intraventricolari di piccolo volume del prodotto di rottura del sangue emoglobina. Oltre a indurre in modo affidabile l’allargamento ventricolare e l’idrocefalo, questo modello provoca lesioni della sostanza bianca, infiammazione e infiltrazione delle cellule immunitarie nelle regioni periventricolari e della sostanza bianca. Questo articolo descrive questo metodo semplice e clinicamente rilevante per modellare IVH-PHH in ratti neonatali utilizzando l’iniezione intraventricolare e presenta metodi per quantificare le dimensioni del ventricolo dopo l’iniezione.
Introduction
L’IVH neonatale ha origine dalla matrice germinale, un sito di rapida divisione cellulare adiacente ai ventricoli laterali del cervello in via di sviluppo. Questa struttura altamente vascolare è vulnerabile all’instabilità emodinamica correlata alla nascita prematura. Il sangue viene rilasciato nei ventricoli laterali nell’emorragia della matrice germinale (GMH)-IVH quando i vasi sanguigni fragili all’interno della matrice germinale si rompono. Nel caso di IVH di grado IV, l’infarto emorragico periventricolare può anche contribuire al rilascio di prodotti ematici all’interno del cervello. 1 La combinazione di GMH-IVH può causare PHH, in particolare dopo emorragie di alto grado (gradi III e IV)1. La PHH può essere trattata con il posizionamento di uno shunt ventricolo-peritoneale, ma il posizionamento dello shunt non inverte la lesione cerebrale che può verificarsi dall’IVH. Sebbene la moderna terapia intensiva neonatale abbia abbassato i tassi di IVH2, 3, non ci sono trattamenti specifici per la lesione cerebrale o l’idrocefalo causati da IVH una volta che si è verificato. Una limitazione significativa nello sviluppo di trattamenti preventivi per le lesioni cerebrali indotte da IVH e PHH è la comprensione incompleta della fisiopatologia IVH.
Recentemente, i primi livelli di CSF dell’emoglobina del prodotto chiave di degradazione del sangue hanno dimostrato di essere associati al successivo sviluppo di PHH nei neonati con IVH4 di alto grado. Inoltre, i livelli di CSF delle proteine della via di manipolazione del ferro – emoglobina, ferritina e bilirubina – sono associati alla dimensione del ventricolo nell’IVH neonatale. Ciò è stato dimostrato anche in una coorte multicentrica di neonati con PHH pretermine, dove livelli più elevati di ferritina nel liquido cerebrospinale ventricolare erano associati a una dimensione del ventricolo più grande5.
In questo studio, abbiamo sviluppato un modello clinicamente rilevante di danno cerebrale indotto da IVH e idrocefalo utilizzando l’iniezione di emoglobina nei ventricoli cerebrali, che consente la quantificazione della lesione cerebrale e PHH e la sperimentazione di nuove strategie terapeutiche (Figura 1) 6, 7. Questo modello IVH utilizza cuccioli di ratto neonatale, che vengono posti in anestesia generale per tutta la durata della procedura. Viene praticata un’incisione della linea mediana sul cuoio capelluto e le coordinate derivate dai punti di riferimento del cranio – il bregma o lambda – vengono utilizzate per colpire i ventricoli laterali per l’iniezione. L’iniezione lenta utilizzando una pompa per infusione fornisce emoglobina nel ventricolo. Questo protocollo è facile da usare, versatile e può modellare diversi componenti di IVH che si traducono in PHH.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo modello IVH che utilizza l’iniezione di emoglobina consente lo studio della patologia dell’IVH specificamente mediata dall’emoglobina. Per gli studi complementari, l’emoglobina può anche essere facilmente somministrata in vitro e non confonde i saggi biochimici per le proteine prodotte da microglia / macrofagi che sono presenti nel sangue intero.
Le principali teorie di IVH-PHH includono l’ostruzione meccanica della circolazione del liquido cerebrospinale, la rottura delle cig…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JMS ha ricevuto finanziamenti da NIH / NINDS R01 NS110793 e K12 (Neurosurgeon Research Career Development Program). BAM ha ricevuto finanziamenti da NIH / NINDS K08 NS112580-01A1, University of Kentucky Neuroscience Research Priority Area Award e un Hydrocephalus Association Innovator Award.
Materials
| 0.3 mL insulin syringe | BD Microfine + Insulin Syringe | 230-4533 | 0.3-0.5 mL synringes will work |
| 1.5 mL microtube | USA Scientific | 1615-5500 | Lot No. K194642H -3 511 |
| 4.7T MRI | Agilent/Varian | 4.7T/33 cm | Agilent/Varian DirectDrive 4.7-T (200-MHz) MRI system |
| 6-0 monofilament suture | ETHICON | 667G | |
| 9.4T MRI | Bruker | BioSpec 94/20 | Used in this protocol without the cryoprobe |
| Analytical balance | CCURIS Instruments | W3200-320 | |
| Artificial CSF (aCSF) | Tocris Bioscience | 3525 | Batch No: 72A |
| Betadine | Purdue Products L.P. | 301005-00 | NDC 67618-150-09 |
| Carprofen (injectable) | Zoetis Inc. | PI 4019448 | Rimadyl |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | |
| Heating pad | Sunbeam | E12107-819 | UL 612A, Z-1228-001 |
| Hemoglobin | MP Biomedicals | 100714 | LOT NO. SR02321 |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| Isoflurane vaporizer | VETEQUIP | 911103 | |
| Light for stereotactic insturment | Dolan-Jenner industries | Fiber-Lite MI-150 | |
| Microinjection syringe pump | World Precision Instruments | MICRO21 | Serial 184034 T08K |
| MRI software | Bruker BioSpin | Paravision 360 3.2 | |
| Oxygen | Airgas Healthcare | UN1072 | LOT NUMBER S1432080XA02 |
| Sprague Dawley rats | Charles River Laboratories | Strain code: 001 | |
| Stereotactic instrument | KOPF Instuments | Model 900LS Lazy Susan | |
| Sterile cotton tipped applicator | Fischerbrand | 23-400-118 | |
| Surgical blade | covetrus | #10 | |
| Topical triple antibiotic | Triple Antibiotic Ointment | NDC 51672-2120-1 | |
| Ventricle volume quantification software | ITK-SNAP | ITK-SNAP 4.0.0 beta |
Riferimenti
- Robinson, S. Neonatal posthemorrhagic hydrocephalus from prematurity: Pathophysiology and current treatment concepts: A review. Journal of Neurosurgery: Pediatrics. 9 (3), (2012).
- Hasselager, A. B., Børch, K., Pryds, O. A. Improvement in perinatal care for extremely premature infants in Denmark from. Danish Medical Journal. 63 (1), (1994).
- Johnston, P. G., Gillam-Krakauer, M., Fuller, M. P., Reese, J. Evidence-Based Use of Indomethacin and Ibuprofen in the Neonatal Intensive Care Unit. Clinics in Perinatology. 39 (1), (2012).
- Mahaney, K. B., Buddhala, C., Paturu, M., Morales, D., Limbrick, D. D., Strahle, J. M. Intraventricular Hemorrhage Clearance in Human Neonatal Cerebrospinal Fluid: Associations with Hydrocephalus. Stroke. , (2020).
- Strahle, J. M., et al. Longitudinal CSF Iron Pathway Proteins in Posthemorrhagic Hydrocephalus: Associations with Ventricle Size and Neurodevelopmental Outcomes. Annals of Neurology. 90 (2), (2021).
- Strahle, J. M., et al. Role of Hemoglobin and Iron in hydrocephalus after neonatal intraventricular hemorrhage. Neurosurgery. 75 (6), (2014).
- Garton, T. P., He, Y., Garton, H. J. L., Keep, R. F., Xi, G., Strahle, J. M. Hemoglobin-induced neuronal degeneration in the hippocampus after neonatal intraventricular hemorrhage. Brain Research. 1635, (2016).
- Goulding, D. S., Caleb Vogel, ., Gensel, R., Morganti, J. C., Stromberg, J. M., Miller, A. J., A, B. Acute brain inflammation, white matter oxidative stress, and myelin deficiency in a model of neonatal intraventricular hemorrhage. Journal of Neurosurgery: Pediatrics. 26 (6), (2020).
- Strahle, J., Garton, H. J. L., Maher, C. O., Muraszko, K. M., Keep, R. F., Xi, G. Mechanisms of Hydrocephalus After Neonatal and Adult Intraventricular Hemorrhage. Translational Stroke Research. 3, (2012).
- Jinnai, M., et al. A Model of Germinal Matrix Hemorrhage in Preterm Rat Pups. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, (2020).
- Georgiadis, P., et al. Characterization of acute brain injuries and neurobehavioral profiles in a rabbit model of germinal matrix hemorrhage. Stroke. 39 (12), (2008).
- Cherian, S. S., Love, S., Silver, I. A., Porter, H. J., Whitelaw, A. G. L., Thoresen, M. Posthemorrhagic ventricular dilation in the neonate: Development and characterization of a rat model. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 62 (3), (2003).
- Balasubramaniam, J., Xue, M., Buist, R. J., Ivanco, T. L., Natuik, S., del Bigio, ., R, M. Persistent motor deficit following infusion of autologous blood into the periventricular region of neonatal rats. Experimental Neurology. (1), (2006).
- Volpe, J. J. Brain injury in premature infants: a complex amalgam of destructive and developmental disturbances. The Lancet Neurology. 8 (1), (2009).
- Dobbing, J., Sands, J. Comparative aspects of the brain growth spurt. Early Human Development. 3 (1), (1979).
- Craig, A., et al. Quantitative analysis of perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human. Experimental Neurology. 181 (2), (2003).
- Lodygensky, G. A., Vasung, L., Sv Sizonenko, ., Hüppi, P. S. Neuroimaging of cortical development and brain connectivity in human newborns and animal models. Journal of Anatomy. 217 (4), (2010).
- Dean, J. M., et al. Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human. Developmental Neuroscience. 33 (34), (2011).
- Engelhardt, B. Development of the blood-brain barrier. Cell and Tissue Research. 314 (1), (2003).
- Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for bloodĝ€"brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), (2010).
- Alles, Y. C. J., Greggio, S., Alles, R. M., Azevedo, P. N., Xavier, L. L., DaCosta, J. C. A novel preclinical rodent model of collagenase-induced germinal matrix/intraventricular hemorrhage. Brain Research. 1356, (2010).
- Christian, E. A., et al. Trends in hospitalization of preterm infants with intraventricular hemorrhage and hydrocephalus in the United States. Journal of Neurosurgery: Pediatrics. 17 (3), 2000-2010 (2016).
