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세포외 플럭스 분석을 이용한 단일 3D 미세조직 구상체의 미토콘드리아 에너지 대사 탐구

Published: February 03, 2022
doi:
10.3791/63346
, , , ,
1School of Biosciences,University of Birmingham, 2Nanomedicine, Drug Delivery & Nanotoxicology Lab, School of Pharmacy,University of Birmingham, 3Mitochondrial Profiling Centre,University of Birmingham

Summary

이 프로토콜은 사용자가 Seahorse 세포외 플럭스 분석을 사용하여 3D 암 세포주 유래 구상체에서 미토콘드리아 에너지 대사를 조사하는 데 도움이됩니다.

Abstract

구상체라고 불리는 3차원 (3D) 세포 응집체는 최근 몇 년 동안 시험관 내 세포 배양의 최전선이되었습니다. 세포를 2차원, 단세포 단층(2D 배양)으로 배양하는 것과는 달리, 스페로이드 세포 배양은 세포외 매트릭스 단백질의 발현, 세포 신호전달, 유전자 발현, 단백질 생산, 분화 및 증식을 포함하여 생체 내에 존재하는 생리적 세포 구조 및 특성을 촉진, 조절 및 지원한다. 3D 배양의 중요성은 종양학, 당뇨병, 줄기 세포 생물학 및 조직 공학을 포함한 많은 연구 분야에서 인정 받고 있습니다. 지난 십 년 동안 구상체를 생산하고 신진 대사 기능과 운명을 평가하기 위해 개선 된 방법이 개발되었습니다.

세포외 플럭스(XF) 분석기는 XF24 섬 포획 플레이트 또는 XFe96 스페로이드 마이크로플레이트를 사용하여 구상체와 같은 3D 미세조직에서 미토콘드리아 기능을 탐색하는 데 사용되었습니다. 그러나, XF 기술을 이용한 구상체에서 미토콘드리아 에너지 대사를 조사하는 뚜렷한 프로토콜과 최적화는 상세히 설명되지 않았다. 이 백서에서는 XFe96 XF 분석기가 있는 스페로이드 마이크로플레이트를 사용하여 단일 3D 구상체에서 미토콘드리아 에너지 대사를 조사하기 위한 상세한 프로토콜을 제공합니다. XF 기술은 서로 다른 암 세포주를 사용하여 크기가 다른 것뿐만 아니라 다른 부피, 세포 번호, DNA 함량 및 유형의 3D 구상체에서 세포 호흡을 구별 할 수있는 것으로 입증되었습니다.

올리고마이신, BAM15, 로테논 및 안티마이신 A의 최적의 미토콘드리아 이펙터 화합물 농도는 3D 구상체에서 미토콘드리아 에너지 대사의 특정 파라미터를 조사하는 데 사용됩니다. 이 백서에서는 또한 구상체에서 얻은 데이터를 정상화하는 방법에 대해 논의하고 XF 기술을 사용하여 스페로이드 대사를 탐구 할 때 고려해야 할 많은 고려 사항을 다룹니다. 이 프로토콜은 고급 시험관 내 스페로이드 모델에 대한 연구를 추진하는 데 도움이됩니다.

Introduction

생물학적 연구에서 시험관 내 모델의 발전은 지난 20 년 동안 빠르게 진행되었습니다. 이러한 모델에는 이제 오르간-온-칩 양식, 오가노이드 및 3D 미세조직 구상체가 포함되며, 이들 모두는 시험관내 및 생체내 연구 사이의 번역을 개선하기 위한 공통적인 초점이 되었다. 고급 시험관 내 모델, 특히 구상체의 사용은 조직 공학, 줄기 세포 연구, 암 및 질병 생물학 1,2,3,4,5,6,7 및 유전 독성 학 8,9,10, 나노 물질 독성학 11을 포함한 안전성 테스트를 포함한 여러 연구 분야에 걸쳐 있습니다. 12,13,14, 및 약물 안전성 및 효능 시험8,15,16,17,18,19.

정상 세포 형태학은 생물학적 표현형과 활성에 매우 중요하다. 세포를 3D 미세조직 구상체로 배양하면 세포가 형태학, 표현형 기능 및 아키텍처를 채택할 수 있으며, 이는 생체 내에서 관찰되는 것과 비슷하지만 고전적인 단층 세포 배양 기술로 포획하기는 어렵습니다. 생체내 및 시험관내 둘 다에서 , 세포 기능은 세포 미세환경에 의해 직접적으로 영향을 받는데, 이는 세포 통신 및 프로그래밍에 한정되지 않는다(예를 들어, 세포-세포 접합 형성, 세포 틈새를 형성할 기회); 즉각적인 환경에서 호르몬 및 성장 인자에 대한 세포 노출 (예를 들어, 염증 반응의 일부로서 세포 사이토카인 노출); 물리적 및 화학적 매트릭스의 조성 (예를 들어, 세포가 뻣뻣한 조직 배양 플라스틱 또는 탄성 조직 환경에서 성장하는지 여부); 그리고 가장 중요한 것은 세포 신진 대사가 영양과 산소에 대한 접근뿐만 아니라 젖산과 같은 대사 폐기물의 처리에 의해 어떻게 영향을 받는지입니다.

대사 플럭스 분석은 정의된 시험관내 시스템 내에서 세포 대사를 검사하는 강력한 방법입니다. 특히, XF 기술은 무손상 세포 및 조직의 세포 생물 에너지학의 실시간 변화를 실시간으로 분석 할 수있게합니다. 많은 세포 내 대사 사건이 수초에서 분 정도 내에 발생한다는 것을 감안할 때, 실시간 기능적 접근법은 시험관 내에서 손상되지 않은 세포 및 조직에서 세포 대사 흐름의 실시간 변화를 이해하는 데 가장 중요합니다.

이 논문은 강제 응집 접근법을 사용하여 시험관내 3D 스페로이드 모델로서 암 유래 세포주 A549 (폐 선암종), HepG2/C3A (간세포 암종), MCF-7 (유방 선암종) 및 SK-OV-3 (난소 선암종)을 배양하기 위한 프로토콜을 제공한다 (그림 1). 또한 (i) 애질런트 XFe96 XF 분석기를 사용하여 단일 3D 구상체의 미토콘드리아 에너지 대사를 조사하는 방법을 자세히 설명하고, (ii) 단일 3D 구상체를 사용하여 XF 분석을 최적화하는 방법을 강조하고, (iii) 이 접근법을 사용하여 3D 스페로이드 대사를 조사하는 데 있어 중요한 고려 사항 및 한계에 대해 논의합니다. 가장 중요한 것은,이 논문은 산소 소모율 (OCR)의 계산이 산화 인산화 및 세포 구상체에서 미토콘드리아 기능을 결정할 수있게 해주는 데이터 세트가 수집되는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜에 대해 분석되지는 않았지만 세포외 산성화 속도 (ECAR)는 XF 실험에서 OCR 데이터와 함께 측정되는 또 다른 매개 변수입니다. 그러나 ECAR은 종종 XF 데이터 세트에서 잘못 해석되거나 잘못 해석됩니다. 우리는 기술 제조업체의 기본 접근 방식에 따라 ECAR 계산의 한계에 대한 논평을 제공합니다.

Protocol

그림 1: 세포 구상체 생성을 위한 그래픽 워크플로우, 세포외 플럭스 분석 및 다운스트림 분석. 네 개의 암 세포주를 단층(A)으로 선택적으로 배양하고, 조직 배양 플라스크로부터 분리하고, 초저 부착 96-웰 마이크로플레이트에 시딩하여 구상체(B</s…

Representative Results

잘 형성되고 컴팩트한 구상체를 얻기 위해, 각 세포주는 시딩 밀도 및 배양 기간 동안 개별적으로 최적화되었다(도 3). A549, HepG2/C3A 및 SK-OV-3 세포주는 초기에 느슨한 응집체를 형성하였고, 이는 배양 7일 후까지 명확하게 정의된 둘레를 갖는 둥근 구상체로 진행되지 않았다. 반대로, MCF-7 세포는 3일 이내에 구상체를 형성할 수 있었다. 모든 스페로이드 모델에 대한 배양 기간 ?…

Discussion

주요 결과 및 결과
이 논문은 XFe96 XF 분석기와 함께 일련의 암 유래 세포주를 사용하여 단일 3D 구상체의 미토콘드리아 에너지 대사를 조사하는 상세한 프로토콜을 제공한다. 강제 응집을 위한 세포 기피제 기술을 사용하여 A549, HepG2/C3A, MCF7 및 SK-OV-3 세포 구상체의 신속한 배양을 위한 방법이 개발되고 기술된다. 이 프로토콜은 (1) 스페로이드 배양 프로토콜의 최적화 및 기술 제조업?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

N.J.C는 Sygnature Discovery Ltd (BB/M01116X/1, 1940003)와 함께 BBSRC MIBTP CASE Award의 지원을 받았습니다.

Materials

A549 ECACC  #86012804 Lung carcinoma cell line
Agilent Seahorse XF RPMI Medium, pH 7.4 Agilent Technologies Inc. 103576-100 XF assay medium with 1 mM HEPES, without phenol red, sodium bicarbonate, glucose, L-glutamine, and sodium pyruvate
Agilent Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer Agilent Technologies Inc. – Instrument for measuring rates of spheroid oxygen uptake in single spheroids
Antimycin A Merck Life Science A8674 Mitochondrial respiratory complex III inhibitor
BAM15 TOCRIS bio-techne 5737 Mitochondrial protnophore uncoupler
Black-walled microplate Greiner Bio-One 655076 For fluorescence-based assays
CELLSTAR cell-repellent surface 96 U well microplates Greiner Bio-One 650970 Microplates for generating spheroids
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay Promega G9681 Assay for the determination of cell viability in 3D microtissue spheroids
Cultrex Poly-D-Lysine R&D Systems a biotechne brand 3439-100-01 Molecular cell adhesive for coating XFe96 spheroid microplates to facillitate attachment of spheroids
D-(+)-Glucose Merck Life Sciences G8270 Supplement for cell culture growth and XF assay medium
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11885084 Culture medium for HepG2/C3A spheroids
EVOS XL Core Imaging System Thermo Fisher Scientific AMEX1000 Phase-contrast imaging microscope
EZ-PCR Mycoplasma test kit Biological Industries 20-700-20 Mycoplasma screening in cell cultures
FIJI Is Just Image J Analysis of collated images
Foetal bovine serum Merck Life Science F7524 Supplement for cell culture medium
HepG2/C3A ATCC  #CRL-10741 Hepatic carcinoma cell line, a clonal derivative of the parent HepG2 cell line
Lactate-Glo Promega J5021 Assay for measurement of lactate within spheorid culture medium
L-glutamine (200 mM solution) Merk Life Sciences G7513 Supplement for cell culture growth and XF assay medium
M50 Stereo microscope Leica Microsytems LEICAM50 Stereo dissection micrscope; used for spheorid handling
MCF-7 ECACC #86012803 Breast adenocarcinoma cell line
Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes Merck Life Science O4876 ATP Synthase Inhibitor
Penicilin-Streptomycin Gibco 15140122 Antibiotics added to cell culture medium
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit Initrogen P7589 Analysis of dsDNA in spehroids
Rotenone Merck Life Science R8875 Mitochondrial Respiratory Complex I Inhibitor
RPMI 1640 Gibco 21875091 Culture medium for A549, MCF7, and SK-OV-3 spheroids
Seahorse Analytics Agilent Technologies Inc. Build 421 https://seahorseanalytics.agilent.com
Seahorse XFe96 Spheroid FluxPak Agilent Technologies Inc. 102905-100 Each Seahorse XFe96 Spheroid FluxPak contains: 6 Seahorse XFe96 Spheroid Microplates (102978-100), 6 XFe96 sensor cartridges, and 1 bottle of Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL (100840-000)
Serological pipette: 5, 10, and 25 mL Greiner Bio-One 606107; 607107; 760107 Consumables for cell culture
SK-OV-3 ECACC  #HTB-77 Ovarian adenocarcinoma cell line
Sodium pyruvate (100 mM solution) Merck Life Science S8636 Supplement for cell culture growth and XF assay medium
T75 cm2 cell culture flask Greiner Bio-One 658175 Tissue culture treated flasks for maintaining cell cultures
TrypLExpress Gibco 12604-021 Cell dissociation reagent
Wave controller software Agilent Technologies Inc. –
Wide orifice tip STARLAB International GmbH E1011-8400 Pipette tips with wide opening for spheroid handling
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Riferimenti

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Coltman, N. J., Rochford, G., Hodges, N. J., Ali-Boucetta, H., Barlow, J. P. Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids Using Extracellular Flux Analysis. J. Vis. Exp. (180), e63346, doi:10.3791/63346 (2022).
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