Summary
Denne artikel beskriver en bekvem metode til overvågning af dynamiske ændringer i antistoftitre for to immunoglobulinisotyper samtidigt (enten IgA, IgM eller IgG) som følge af et immunrespons på SARS-CoV-2-infektion eller vaccination. Dette 'Multianalyte Covid-19 Immune Response Panel' anvender tre indirekte immunassays bygget på kodede mikrosfærer, der læses ved hjælp af en flowbaseret multiplexlæser med 'dual-channel' kapacitet.
Abstract
Multiplexteknologier til forhør af flere biomarkører i koncert har eksisteret i flere årtier; Metoder til evaluering af flere epitoper på samme analysand er dog fortsat begrænsede. Denne rapport beskriver udviklingen og optimeringen af et multiplekset immunobead-assay til serologisk test af almindelige immunoglobulinisotyper (f.eks. IgA, IgM og IgG) forbundet med et immunrespons på SARS-CoV-2-infektion eller vaccination. Assays blev udført ved hjælp af en flowbaseret, multiplex fluorescerende læser med dual-channel kapacitet. Optimeringer fokuserede på analytfangsttid, detektionsantistofkoncentration og detektionsantistofinkubationstid. Analytiske assay-ydeevnekarakteristika (f.eks. assayområde (herunder nedre og øvre grænser for kvantificering) og intra- og interassaypræcision) blev fastlagt for enten IgG/IgM- eller IgA/IgM-serotypekombinationen i tandem ved hjælp af »dual channel«-tilstanden. Analyteoptagelsestider på 30 minutter for IgG, 60 minutter for IgM og 120 minutter for IgA var egnede til de fleste applikationer, hvilket gav en balance mellem analyseydelse og gennemstrømning. Optimale detektionsantistofinkubationer ved 4 μg /ml i 30 minutter blev observeret og anbefales til generelle anvendelser i betragtning af den generelt fremragende præcision (procentvis varianskoefficient (% CV) ≤ 20%) og observerede følsomhedsværdier. Det dynamiske område for IgG-isotypen strakte sig over flere størrelsesordener for hvert assay (Spike S1, Nucleocapsid og Membrane glycoproteiner), hvilket understøtter robuste titerevalueringer ved en fortyndingsfaktor på 1:500 til kliniske anvendelser. Endelig blev den optimerede protokol anvendt til overvågning af Spike S1-serokonversion til forsøgspersoner (n = 4), der gennemførte et SARS-CoV-2-vaccineregime. Inden for denne kohorte blev Spike S1 IgG-niveauer observeret for at nå maksimale titere 14 dage efter administration af anden dosis ved en meget højere (~ 40 gange) signalintensitet end enten IgM- eller IgA-isotyper. Interessant nok observerede vi meget variable Spike S1 IgG titer henfaldshastigheder, der stort set var emneafhængige, blev observeret, hvilket vil være emnet for fremtidige undersøgelser.
Introduction
Samtidig måling af flere sygdomsrelaterede biomarkører i biologiske prøver tillader beskrivende og forudsigelig indsigt i patologiske processer. Mens konventionelle enkeltanalytiske immunologiske procedurer, såsom enzymbundne immunosorbentassays (ELISA'er), har været hjørnestenen i kvantitative analyser i både kliniske og forskningsmiljøer, kan disse teknikker have betydelige begrænsninger med hensyn til gennemstrømning, mængden af prøver, der kræves til hver måling, og omkostningseffektivitet, der i høj grad begrænser undersøgelsen af flere biologiske elementer, der ofte er sammenflettet gennem sygdomsforløbet1 . Mikrosfærebaseret multiplexingteknologi er blevet en uundværlig platform for både diagnostiske og forskningsfaciliteter for sin evne til at kombinere assays for at forbedre laboratoriegennemstrømningen, afbøde prøveknaphed og reducere gentagne test for at maksimere omkostningsbesparelser 1,2,3,4. For nylig er yderligere forstærkning af denne multiplexingkraft blevet introduceret med instrumenter, der har dual-reporter-kapaciteter. Dual-reporter-funktionen implementerer to fluorescerende kanaler til detektion, der leverer en anden dimension af multiplexing, hvilket gør det muligt at detektere flere epitoper på den samme analyt.
Alvorligt akut respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) er det patogen, der er ansvarlig for den nuværende coronavirus sygdom 2019 (COVID-19) pandemi5. Mens RT-PCR-test er afgørende for infektionsbekræftelse i begyndelsen af sygdomsforløbet, har serologiske undersøgelser af antistoftitre vist sig at være afgørende for nøjagtig og fuldstændig kritik af enkeltpersoner vedrørende en tidligere eksponering eller genopretning; et svar på immunisering og/eller en evaluering af Covid-19-vaccinationseffektivitet 6,7.
Denne rapport afgrænser metoder til måling af serokonversion for flere SARS-CoV-2 virale antigener, der anvender et flowbaseret, multiplexlæser dobbeltrapporteringssystem. Specifikt beskrives samtidig påvisning af to antistofundertyper (konfigureret som IgG / IgM eller IgA / IgM) til et 3-plex SARS-CoV-2 antigenpanel, der inkluderer assays for Spike S1, Nucleocapsid og Membrane (aka Matrix) glycoproteiner. Denne tilgang giver en ideel virksomhed til indfangning af langsgående serokonversion og bidrager med et værdifuldt værktøj i arsenalet mod Covid-19-pandemien.
Protocol
Alle forsøgspersoner blev indskrevet med skriftligt informeret samtykke med fuld Institutional Review Board (IRB) godkendelse af Rush University Medical Center under protokol ORA 20101207 med alle institutionelle retningslinjer for etisk forskningspraksis overholdt. Blod blev opsamlet via konventionel flebotomi i lavendelvakutainere (K2EDTA) og behandlet med anbefalede protokoller. Det resulterende plasma blev arkiveret ved -80 °C, indtil vurderingerne blev udført.
1. Fremstilling af antigenkonjugerede mikrosfærer
- Vælg tre forskellige hætteglas med magnetiske mikrosfærer med unikke perleområder, registrering af perle-ID og partioplysninger for hvert anvendt hætteglas.
BEMÆRK: Følgende trin vil blive fulgt for hvert særskilt mikrosfæreområde. Mikrosfærer er lysfølsomme og bør beskyttes mod langvarig udsættelse for lys. Under vasketrin skal du passe på ikke at forstyrre mikrosfærerne. Hvis forstyrret, tillade en anden 60 s adskillelse. - Vortex mikrosfærebestanden i 60 s og sonikere i 5 minutter før brug for at dissociere aggregerede perler.
- Overfør 1,0 x 106 perler til et 1,5 ml lavproteinbindende mikrocentrifugerør.
- Indsæt røret i en magnetisk separator, og lad adskillelse forekomme i 60 s. Når røret stadig er i den magnetiske separator, skal du forsigtigt fjerne supernatanten uden at forstyrre perlepellet.
- Fjern røret fra den magnetiske separator, resuspend perlerne med 100 μL HPLC-grade vand og hvirvel i 30 s. Anbring røret tilbage i den magnetiske separator i 60 s, og fjern derefter supernatanten. Gentag denne vaskeprotokol to gange.
- Røret fjernes fra den magnetiske separator, og de vaskede mikrosfærer resuspenderes i 90 μL 100 mM monobasisk natriumphosphat, pH 6,2 (aktiveringsbuffer) med hvirvel i 30 s.
- Der tilsættes 10 μL 50 mg/ml sulfo-NHS (fortyndet med aktiveringsbuffer) til mikrosfærerne og hvirvel forsigtigt i 10 s. Der tilsættes 10 μL 50 mg/ml EDC-opløsning (fortyndet med aktiveringsbuffer) og hvirvel forsigtigt i 10 s. Inkuber mikrosfærer i 20 minutter ved stuetemperatur (RT) med en blid hvirvel hvert 10. minut.
- Gentag vasketrin 1,4-1,5 med 50 mM MES, pH 5,0 (koblingsbuffer) i stedet for vand af LC/MS-kvalitet i alt to vaske.
- Røret fjernes fra den magnetiske separator, og perlerne resuspenderes med 100 μL koblingsbuffer med hvirvel i 30 s efterfulgt straks af tilsætning af den ønskede mængde protein.
- Det samlede volumen bringes op på 150 μL med koblingsbuffer. Bland koblingsreaktion med hvirvel i 30 s og inkuberes i 2 timer ved rotation ved RT.
BEMÆRK: For assays defineret heri blev konjugationer udført med følgende proteinkoncentrationer: Spike S1: 5 μg; Nucleocapsid: 5 μg; Membran: 12,5 μg. - Gentag vasketrin 1.4 med fosfatbufferet saltvand (PBS)-1% gedeserumalbumin, 0,01% polysorbat-20 (slukkebuffer) i stedet for vand af LC/MS-kvalitet i alt to vaske. Resuspend de vaskede mikrosfærer i 100 μL Quench Buffer indeholdende 0,05% natriumazid med hvirvel i 30 s.
BEMÆRK: Lad perlerne slukke helt i mindst 6 timer, før du går videre til en anden procedure. - Tæl antallet af genvundne mikrosfærer ved hjælp af en automatiseret celletæller eller et hæmocytometer. Registrer den observerede perlekoncentration.
- De koblede mikrosfærer opbevares på køl ved 4 °C i mørke.
2. Procedurer
- Assay ydeevne (Basisprotokol)
- Resuspend de koblede mikrosfærer med hvirvel i 30 s og sonikere i ~ 60-90 s.
- Fjern den krævede mængde af hvert perlekolloid fra det respektive rør, og kombiner perlekolloider i et nyt 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Indsæt røret i en magnetisk separator, og lad adskillelse forekomme i 60 sek. Når røret stadig er i den magnetiske separator, skal du forsigtigt fjerne supernatanten uden at forstyrre perlepellet.
- Fjern perlerne fra separatoren, resuspend perlerne med 100 μL PBS-1% bovint serumalbumin, 0,01% polysorbat-20 (Assay Buffer) og hvirvel i 30 s. Anbring røret i en magnetisk separator, og lad adskillelse forekomme i 60 s. Gentag denne vaskeprotokol (dvs. trin 2.1.3-2.1.4) to gange
- Koncentrationen af den 3-plex arbejdende mikrosfæreblanding justeres ved at tilsætte et passende volumen Assay Buffer for at generere en slutkoncentration på 100 mikrosfærer pr. 1 μL for hvert mål.
- Aliquot 12,5 μL af mikrosfæreblandingen fremstillet i trin 2.1.5 i hver brønd af en 384-brøndplade eller 25 μL i hver brønd i en 96-brøndplade.
- Plasma-/serumprøverne fortyndes 500 gange i Assay Buffer. Forbered standardprøver i henhold til den ønskede titrering.
- Der tilsættes 12,5 μL Assay Buffer som blindprøve, og hver af de fortyndede prøver eller standardkomponenter tilsættes i hver af de udpegede brønde i en prøveplade med 384 brønde eller 25 μL af blindprøven eller standarden i hver brønd i en prøveplade med 96 brønde.
- Dæk pladen med en aluminiumsforsegling eller folie, og inkuber i 1 time ved RT på en pladeryster indstillet til 700 o / min.
BEMÆRK: Skematisk for fortyndingskurverne findes i tabel 1. - Der fremstilles en opløsning af anti-humane detektionsantistoffer (sekundære antistofopløsninger) ved 4 μg/ml med assaybuffer som specificeret i trin 2.1.11.
- Forbered gede-anti-human IgM, konjugeret med Super Bright 436 (SB)/Goat-anti-human IgA, Phycoerythrin (PE) Konjugerede detektionsantistoffer ved 4 μg/ml; eller Gede-anti-human IgM, SB Konjugat/Ged-anti-human IgG, PE Konjugerede detektioner antistoffer ved 4 μg/ml.
BEMÆRK: For et 384-brønds pladeformat kræves 12,5 μL/brønd af den fremstillede sekundære antistofopløsning, og for et 96-brønd pladeformat kræves 25 μL/brønd. - Placer pladen på en magnetisk separator, vask hurtigt og vend kraftigt over en biologisk farlig beholder for at fjerne væske fra brøndene. Med pladen stadig omvendt, bank pladen kraftigt mod en tyk papirklat.
- Hver brønd vaskes med 100 μL Assay Buffer, og væsken fjernes ved kraftig inversion over en biohazard beholder, som tidligere beskrevet. Disse trin gentages (2.1.12-2.1.13) for i alt to vaske. Kassér alle brugte papirskiver i en biohazard beholder.
- Der tilsættes 12,5 μL af den sekundære antistofarbejdsopløsning til hver brønd i en 384-brøndplade eller 25 μL til hver brønd i en 96-brøndplade. Dæk pladen med en aluminiumsforsegling eller folie, og inkuber i 30 minutter ved RT på en pladeryster indstillet til 700 o / min.
- Gentag vasketrin 2.1.12-2.1.13
- Der tilsættes 75 μL Assay Buffer i hver brønd i en 384-brøndplade eller 100 μL i hver brønd i en 96-brøndplade. Dæk pladen med en aluminiumsforsegling eller folie, og inkuber i 5 minutter ved RT på en pladeryster indstillet til 700 o / min.
- Analysér 60 μL via instrumentanalysatoren i henhold til systemmanualen.
- Optimering af inkubationstid for prøvefangst
- Trinene i punkt 2.1 udføres ved hjælp af inkubationstiden på 30 minutter, 60 minutter og 120 minutter i trin 2.1.9.
BEMÆRK: Inkubationer kan udføres enten med forskellige plader eller ved at holde pause i trin 2.1.6, indtil tiden går videre til trin 2.1.9. for at opnå de ønskede inkubationstider. - Fortsæt med pladeaflæsningen på analysatoren ved hjælp af 60 μL af assayblandingen i henhold til producentens anbefalinger.
- Trinene i punkt 2.1 udføres ved hjælp af inkubationstiden på 30 minutter, 60 minutter og 120 minutter i trin 2.1.9.
- Optimering af sekundær antistofkoncentration
- Denne procedure udføres som beskrevet i punkt 2.1, med undtagelse af de endelige koncentrationer af reagenser i den sekundære antistofarbejdsopløsning (fremstillet i trin 2.1.10-2.1.11), modificeret som følger:
Gede-humane (eller kanin) IgM, SB-konjugerede detektionsantistoffer ved 8, 4, 2, 1 og 0,5 μg/ml.
Gede-humane (eller kanin) IgA, PE-konjugerede detektionsantistoffer ved 8, 4, 2, 1 og 0,5 μg/ml.
Gede-anti-humane (eller kanin) IgG, PE-konjugerede detektionsantistoffer ved 8, 4, 2, 1 og 0,5 μg/ml.
Gede-menneske-menneske (eller kanin) IgG, PE-konjugat/ged-menneskefjendsk (eller kanin) IgM, SB-konjugeret detektionsantistoffer ved 8, 4, 2, 1 og 0,5 μg/ml.
Gede-menneskefjendske (eller kanin)IgA, PE-konjugat/gede-menneske-menneske (eller kanin) IgM, SB-konjugerede detektionsantistoffer ved 8, 4, 2, 1 og 0,5 μg/ml. - Fortsæt med pladeaflæsningen på analysatoren ved hjælp af 60 μL af assayblandingen i henhold til producentens anbefalinger.
- Denne procedure udføres som beskrevet i punkt 2.1, med undtagelse af de endelige koncentrationer af reagenser i den sekundære antistofarbejdsopløsning (fremstillet i trin 2.1.10-2.1.11), modificeret som følger:
- Optimering af sekundær antistof inkubationstid
- Denne procedure udføres som beskrevet i punkt 2.1 med 15 min, 30 min, 60 min og 120 min inkubationsvarighed som defineret i trin 2.1.14.
- Fortsæt med pladeaflæsningen på analysatoren ved hjælp af 60 μL af assayblandingen i henhold til producentens anbefalinger.
- Evaluering af emneprøver med optimerede dobbeltkanalassays
- Indsaml forsøgspersoner plasmaprøver (n = 4) på dage -21, -11, -1/0, +14, +28, +60, +90 og +120 i forhold til afslutningen af Covid-19 vaccine (dvs. anden dosis) administration.
BEMÆRK: Dag 0 repræsenterer det tidspunkt, hvor vaccinationen blev afsluttet. - Udfør alle assays ved hjælp af basisprotokollen (afsnit 2.1.) som enten et IgG/IgM- eller IgA/IgM-dobbeltkanalassay.
- Normaliser resultaterne til den maksimale observerede MFI-værdi (Median Fluorescent Intensity) for hvert specifikt immunglobulin og assay.
- Indsaml forsøgspersoner plasmaprøver (n = 4) på dage -21, -11, -1/0, +14, +28, +60, +90 og +120 i forhold til afslutningen af Covid-19 vaccine (dvs. anden dosis) administration.
Representative Results
Typiske analyseresultater og præstationsevalueringer
Immunobead-assays giver almindeligvis en sigmoidal kurve, når de vurderes over flere (log) størrelsesordener, som illustreret i hvert af panelerne i figur 1. Brugeren skal eksperimentelt definere det optimale koncentrationsområde for hver analysand i multiplexen for at bestemme hele kvantificeringsområdet og sikre, at ekstremerne ikke overprøves (områder, der nærmer sig den nedre kvantificeringsgrænse [LLOQ] eller øvre kvantificeringsgrænse [ULOQ]). Det faktiske interval, der kræves til et assay, dikteres imidlertid af fordelingen af målanalysanderne i en biologisk matrix (dvs. de 'ukendte') ved en given fortyndingsfaktor. Selvom standardkurver typisk fortolkes via lineær regression med en 4- eller 5-parametrisk fit-algoritme, giver den lineære del af en given kurve typisk den største tillid til kvantitativ nøjagtighed med en lineær (y = mx + b) kvantificeringsmodel. At matche kalibreringskurven med de observerede værdier for en ukendt ved en given fortyndingsfaktor bør være målet for kvantitativ analyseudvikling.
I denne henseende blev en 7-punkts standardkurve baseret på en 1: 5 seriel fortyndingsserie evalueret for hver af Spike S1, Nucleocapsid og Membrane antistoffer, der spænder mellem 1 μg / ml og 0,000064 μg / ml for Spike S1 og Nucleocapsid og 5 μg / ml og 0,00032 μg / ml for membran, som vist i figur 1. Den nedre detektionsgrænse (LLOD) for hvert assay blev defineret som den laveste analytkoncentration, der gav et signal, der kunne skelnes fra dets baggrund. LLOD kan identificeres ved den tidligere beskrevne ligning 8,9, LLOD = LoB + 1,645 (SDlav koncentrationsprøve). LoB er den nedre grænse for blank, og det er den "tilsyneladende" koncentration af analyt, der produceres fra emnet, når der forventes en nulværdi, og det kan konstateres ved hjælp af denne ligning LoB = Meanblank + 1.645 (SDblank)8. Baseret på denne metode varierede MFI-værdierne for Spike S1-analysen fra 134,38 til 20191,2, hvor 134,38 MFI repræsenterer 0,00024 μg / ml og defineret som LLOD. For membranassayet var det praktiske MFI-interval 52,24 til 4764,9, med 52,24 MFI beregnet til at være 0,004885 μg / ml og tildelt som LLOD. MFI-området for Nucleocapsid-assayet var 517,9 til 19666,34, med 517,9 specificeret som 0,00024 μg/ ml, hvilket var LLOD. Den øvre detektionsgrænse (ULOD) defineres som koncentrationen af analysand, hvorefter ændringen i MFI ikke længere er lineær, og signalresponsen er mættet. Det skal bemærkes, at den fulde sigmoidale karakter af disse kurver ikke kan observeres for de testede standarder, med undtagelse af Nucleocapsid-kurven. I betragtning af de observerede MFI-værdier for alle ukendte, der er analyseret til dato (ved en fortynding på 1:500), ligger de imidlertid inden for det præsenterede kurveområde for hver analysand og kvantificeres let ved hjælp af en 4- eller 5-parametrisk tilpasning via lineær regression.
Analyse præcision
Intraassaycision: Fire replikater af assays blev udført på samme plade for at vurdere assaypræcisionen, beregnet som %CV eller kvotienten for standardafvigelsen og gennemsnittet ganget med 100. Standardpunkt 2 og 5 blev valgt for disse tabeller med værdier katalogiseret i tabel 2. Den typiske acceptable øvre grænseværdi for %CV-værdier er ≤20 %, som blev observeret for disse data, med undtagelse af den for standard 2 i membran IgG, som sandsynligvis skyldes baggrundsniveauer og kan korrigeres ved at fjerne randværdier (data ikke vist). Det skal bemærkes, at der blev observeret en tilsyneladende ustabilitet med hensyn til læsning for membranassays, hvor MFI-værdierne var <200, oftest i tilfælde af IgA- og IgM-isotyper.
Inter-assay præcision: Tre forskellige partier af perlesæt blev forberedt for hvert assay og testet, som defineret for Intra-assay præcision (ovenfor og som vist i figur 1). Variabiliteten mellem assays blev vurderet ved at beregne %CV ud fra gennemsnitsresultaterne for hver af de tre batcher, som vist i tabel 3. Igen er den øvre grænse for en acceptabel %CV fastsat til ≤20 %, som findes for alle testede betingelser (med en lignende virkning som standard 2 i membran IgG, som vist ovenfor). Det skal bemærkes, at batch-til-batch-variabilitet i netto MFI-værdier almindeligvis observeres inden for flere batcher af de samme immunoreagenter under brugerdefineret analyseudvikling. Anvendelsen af en kalibreringskurve, der er fremstillet af et kommercielt opnået antimålantistof (f.eks. kaninanti spike S1) efterfulgt af et anti-artsdetektionsantistof, kan give konsistens i analyseresultaterne og muliggøre sammenligninger mellem flere batcher på forskellige tidspunkter.
Inter-assaypræcision med humane prøver: Evalueringen af inter-assaypræcision blev gentaget med humane plasmaprøver (n = 5) indsamlet inden for en måned efter først rapporterede symptomer på en SARS-CoV-2-infektion; udført med tre forskellige partier af assays (dvs. forskellige præparater af perlesættene). Disse resultater er vist i tabel 4 og viser præcision med en %CV-værdi med den typiske øvre grænseværdi på ≤20 %. De gennemsnitlige % CV-værdier for Spike S1, Nucleocapsid og Membrane IgG-titere blev beregnet til at være henholdsvis 9,9% (interval 2,6%-18%), 11,0% (interval 3,5% -24,4%) og 7,6% (interval 3,2% -12,9%). Lignende observationer blev foretaget med IgM- og IgA-titerne af disse tre analytter, der alle gav %CV-værdier <20%. Den eneste undtagelse herfra var emne 5 IgM-titere for membranproteinet, som efterfølgende blev udelukket som en outlier. Præcisionsværdierne for humane fagevalueringer er i overensstemmelse med dem, der er set ovenfor for kaninantistofferne, hvilket tyder på, at disse assays let kan omkonfigureres til evaluering af titere af antigenerne i flere arter med ringe indvirkning på assaypræcisionen. Som nævnt ovenfor var der en tilsyneladende ustabilitet med hensyn til at læse værdier observeret for membranassays, hvor MFI-værdierne var <200, oftest i tilfælde af IgA- og IgM-isotyper.
Optimering af primær antistofkoncentration
Analysandens "indfangningstid" blev evalueret med de antigenkonjugerede perler, og antistofferne i plasmaprøverne eller i standarderne blev testet ved at ændre længden af den primære inkubation (30 minutter, 1 time, 2 timer og 4 timer). Forskellen i den gennemsnitlige MFI præsenteres som kvotienten for en specifik inkubation og den maksimale inkubationstid, betegnet % Max., i figur 2, mellem en inkubationstid på 30 minutter (minimumsvarighed) og en inkubationstid på 4 timer (maksimal varighed). Værdier ved 120 minutter var optimale for IgG-titere for Spike S1, membranen og Nucleocapsid-antistofferne, hvilket indikerer en hurtig-primær antistofbindende kinetik, hvilket giver fleksibilitet til at øge assaygennemstrømningen. Imidlertid blev der observeret langsommere kinetik for IgA- og IgM-isotyperne (data ikke vist), der demonstrerede maksimale indfangningsniveauer ved 4 timers tidspunktet, som vist i figur 2. Samlet set er der en balance mellem at nærme sig assaymætning og den praktiske tidsmæssig hensigtsmæssighed for at køre hvert assay, når det er i produktion (for at maksimere gennemstrømningen). Med dette blev egnede signaler til kvantitative formål ved minimale inkubationstider på 30 min for IgG, 60 min for IgM og 120 min for IgA observeret i disse fund.
Optimering af sekundær antistofkoncentration
Fem koncentrationer af sekundære antistoffer (gede-anti-human IgG, PE-konjugeret; ged anti-human IgA, PE-konjugeret; ged anti-human IgM, SB-konjugeret) blev testet (0,5, 1, 2, 4 og 8 μg / ml). Alle antistoffer afslørede store signalområder uden tydelig signalmætning under nogen tilstand, hvilket sikrede en lineær måling for nogen af koncentrationerne. Som et eksempel var det gennemsnitlige signal genereret fra Spike S1-analysen ved hjælp af gede-anti-human IgM, SB-konjugeret ved 0,5 μg / ml 13,2% af MFI'en genereret fra det maksimale signal (8 μg / ml), mens MFI genereret fra 4 μg / ml var 73,3% af MFI'en manifesteret ved det maksimale signal. Detaljer om rækkevidden af signaler fra de andre Spike S1-antistofisotyper, membranantistofferne og Nucleocapsid-antistofferne er inkluderet i tabel 5 og figur 3. Som et praktisk punkt afspejles den primære virkning mellem den optimale sekundære antistofkoncentration og den tidligere angivne 4 μg / ml sekundær antistofkoncentration med hensyn til assayfølsomhed og analyseomkostninger. Det vil sige, at en sekundær antistofkoncentration på 8 μg/ml kan være ønskelig til anvendelse med lave antistoftitre eller lave mængder værdifuld prøve, men omkostningerne forbundet med disse assays vil være betydeligt højere end anvendelsen af den tidligere definerede 4 μg/ml koncentration. Omvendt ville tilfælde, hvor der skulle observeres høje antistoftitre (såsom personer, der har oplevet Covid-19-vaccinationer eller med ikke-begrænsende mængder sera), se en cost-benefit ved anvendelse af de lavere mængder sekundære antistoffer (f.eks. 1 μg / ml).
Optimering af sekundær antistofinkubation
Den potentielle indflydelse af varigheden af den sekundære antistofinkubation blev også undersøgt ved at ændre inkubationens længde (15, 30, 60 og 120 min). Generelt oversteg forskellen i den gennemsnitlige MFI som præsenteret som kvotienten for en specifik inkubation og den maksimale inkubationstid, kaldet %Max, mellem en inkubationstid på 15 minutter (minimumsvarighed) og en inkubation på 120 minutter (maksimal varighed) ikke henholdsvis 30%, 55% og 50% for Spike S1, membranen og Nucleocapsid-antistofferne, hvilket indikerer et hurtigt kinetisk trin i sekundær antistofbinding og et middel til at øge assaygennemstrømningen. Tabel 6 indeholder oplysninger om signalændringer for alle inkubationstider. Illustrationer af de observerede signaler fra forskellige inkubationer af denne analyse er vist i figur 4.
Dobbeltkanals ydeevne og specificitet
For hver analysand blev en enkelt reporterformatkørsel (kun IgG-PE, kun IgA-PE eller kun IgM-SB) sammenlignet med det signal, der blev genereret for den samme analysand, da den blev kørt i et dual-reporter-format (f.eks. kun Spike S1 IgG-PE versus Spike S1 IgG-PE i kombination med Spike S1 IgM-SB i dual-reporter-formatet). Assaypræcision (udtrykt som % CV) for de signaler, der blev oprettet i de to formater, blev brugt til at analysere forholdet i resultaterne af dette eksperiment. % CV-værdierne for Spike S1-assays var henholdsvis 6,19%, 16,4% og 23% for IgM, IgG og IgA. For membranassayet var %CV-værdierne henholdsvis 3,3%, 7,9% og 16,4% for IgM, IgG og IgA. Endelig gav Nucleocapsid-analysen % CV-værdier på henholdsvis 8,7%, 10,3% og 24,2% for IgM, IgG og IgA. De præcisionsværdier, der er observeret for IgM- og IgA-isotyperne, tyder på, at en længere inkubationstid kan give overlegne assayresultater på grund af de kendte bindende kinetiske forskelle på tværs af disse klasser af immunglobuliner. Figur 4 viser overensstemmelsen mellem formaterne for forskellige koncentrationer af sekundære antistoffer.
For at bekræfte specificiteten af reporterkanaler blev en enkelt reporterkanal testet på én gang, mens den anden kanal blev tildelt som et tomt for at spørge om det ikke-specifikke signal (blødningseffekt). Disse resultater indikerer, at der er ubetydelig krydssignalforurening mellem de to reporterkanaler i betragtning af den høje specificitet på tværs af spektret af forhold. Disse resultater er illustreret i figur 5. Samlet set observerede vi en interferens på 6,45 % på tværs af kanal 1 til kanal 2. Men da signalernes størrelse blev taget i betragtning, observerede vi følgende potentielle interferensniveauer i dobbelt reportertilstand: Spike IgG / IgM ved 71.98%, Spike IgA / IgM ved 28.11%; Membran IgG / IgM ved 7,41%, Membran IgA / IgM ved 134,61%; og Nucleocapsid IgG/ IgM på 146,03%, Nucleocapsid IgA/ IgM på 112,13%. I den specificerede konfiguration ville dette kræve måling af Spike IgM i kombination med IgA-isotypen, Membrane IgM med IgM-isotypen og nucleocapsidmålinger, der ikke udføres i et dual-channel-format. Dette resultat kan nødvendiggøre en undersøgelse af inversionen af mærkningsstrategien, hvorved IgA og IgG måles i kanal 2 og IgM i kanal 1.
Evaluering af serokonversionshændelser efter Covid-19-vaccination
Serokonversion blev overvåget hos fire forsøgspersoner efter vurdering af IgA, IgM og IgG med Spike S1-analysen på tidspunkter, der spænder fra prævaccination til fire måneder efter afslutningen af Covid-19-vaccinationsserien. Målinger blev udført i dobbeltkanaltilstand (IgG / IgM og IgA / IgM, med IgM-værdier i gennemsnit). Alle forsøgspersoner modtog vaccinen som en 2-trins immunisering i henhold til standardpraksis med et 21-dages interval mellem første og anden dosis. Plots af hvert forsøgs immunrespons er vist i figur 6A-C. Immunresponsværdier for Nucleocapsid- og Membrane-antigenerne blev observeret på baggrundsniveauer for alle evaluerede immunglobuliner (data ikke vist), hvilket var i overensstemmelse med, at forsøgspersonerne ikke havde nogen dokumenteret tidligere SARS-CoV-2-infektion i tiden før vaccination. Samlet set var de observerede Spike S1 IgA- og IgM-værdier ca. 40 gange lavere end IgG-isotypetitrene, idet spidstitrene blev cresting så snart som 14 dage for både IgM- og IgG-isotyper, og IgA-isotypen nåede toptitre mellem tidspunktet for den anden dosis (dag 0) og 14 dage efter anden dosis. afhængigt af emnet. Især begynder Spike S1 IgG-titerne at forfalde i løbet af de fire måneder efter afslutningen af vaccinationen med en meget variabel hastighed på en emneafhængig måde.
Figur 1: Repræsentative 3-plex standardkurver. Repræsentative standardkurver for de tre analysander præsenteret som en 7-punkts seriel fortyndingskurve på 1:5 startende ved (A) 1 μg/ml for Spike S1, (B) 5 μg/ml for membran og (C) 1 μg/ml for Nucleocapsid og antistoffer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Optimering af primær antistof/prøveinkubationstid: Det gennemsnitlige MFI-signal produceret fra forskellige inkubationstider for primært antistof/prøver (antistofindfangning) fra 30 min. til 4 timer for standard 1-7 (som angivet i tabel 1). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Sekundære antistofkoncentrationsoptimeringer og dobbeltkanals ydeevne. Kurver illustrerer den gennemsnitlige MFI (normaliseret til den højeste registrerede værdi i serien) produceret ud fra testede sekundære antistofkoncentrationer, der spænder fra 0,5-8 μg/ml. Hver forekomst blev udført både som et enkelt- og dobbeltkanalsassay for at værdsætte forskelle i det eksperimentelle format. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Optimering af inkubationstid for sekundære antistoffer, dobbeltkanalformat. Repræsentative plot af observerede MFI-værdier (normaliseret til den højeste registrerede værdi i serien) med hensyn til inkubationstid med sekundære antistoffer. Eksperimenter blev udført som dobbeltkanalassays som (A-C) IgA / IgM eller (D-F) IgG / IgM kombinationer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Specificitetsvurderinger for dobbeltkanalassays. Analyseresultater af dobbeltkanalsassayformatet med en af hver kombination angivet som blank for at illustrere manglen på fluorescerende eller interferens på tværs af kanaler. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Illustration af serokonversion efter Covid-19 vaccination. Plots, der illustrerer de relative titere af (A) IgG, (B) IgM og (C) IgA-antistoffer til Spike S1-antigenet i løbet af Covid-19-vaccination (Prævaccination - 4 måneder efter afslutning); tiden vises i dage i forhold til afslutningen af vaccinationsserien; generelle punkter i vaccineadministrationen er angivet (røde linjer). Eksperimenter blev udført i dobbeltkanaltilstand som beskrevet i protokollen. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Standardnummer | Fortyndingsserier | Anti-Spike S1 eller N (μg/ml) | Anti-membran (μg/ml) |
| Hvid | Hvid | - | - |
| 1 | Std7 1:1 | 1 | 5 |
| 2 | Std6 1:5 | 0.2 | 1 |
| 3 | Std5 1:25 | 0.04 | 0.2 |
| 4 | Std4 1:125 | 0.008 | 0.04 |
| 5 | Std3 1:625 | 0.0016 | 0.008 |
| 6 | Std2 1:3125 | 0.00032 | 0.0016 |
| 7 | Std1 1:15625 | 0.000064 | 0.00032 |
Tabel 1: Fortyndingsserier for standardkurver: Tabel over fortyndingsfaktorer, der er anvendt til standardkurverne for IgG-serotypen præsenteret som en 7-punkts, 1:5 seriel fortyndingskurve startende ved 1 μg/ml for α-Spike S1 og α-Nucleocapsid og 5 μg/ml for α-membran antistoffer.
| Analyt | Prøve | Rep 1 | Rep 2 | Rep 3 | Rep 4 | Ave | Sd | %CV |
| Spids S1 | STD2 | 369.4 | 356.9 | 295.2 | 271.5 | 323.3 | 47.4 | 14.6 |
| Std5 | 3869.1 | 3437 | 3970.2 | 4240.7 | 3879.3 | 334 | 8.6 | |
| Membran | STD2 | 40.6 | 37.7 | 49.9 | 27.8 | 39 | 9.1 | 23.3 |
| Std5 | 733.2 | 731.3 | 724 | 678.1 | 716.7 | 26 | 3.6 | |
| Nucleocapsid | STD2 | 1746.7 | 1790.8 | 1577.3 | 1664.8 | 1694.9 | 94.2 | 5.6 |
| Std5 | 15598.1 | 14735.5 | 18369.5 | 17408.5 | 16527.9 | 1657.7 | 10 |
Tabel 2: Præcision inden for assay: Procentvis varianskoefficient (%CV) beregnet ud fra fire replikater af standardantistofblandinger ved standard 2 (STD2) og standard 5 (STD5) med en enkelt assaybatch i samme eksperiment. Værdier angivet for replikater og gennemsnit repræsenterer de observerede MFI-værdier.
| Analyt | Prøve | Parti 1 | Parti 2 | Batch3 | Ave | Sd | %CV |
| Spids S1 | STD2 | 383.2 | 424.4 | 379.9 | 395.8 | 24.8 | 6.3 |
| Std5 | 5639.7 | 6062.5 | 6384.3 | 6028.8 | 373.4 | 6.2 | |
| Membran | STD2 | 39.1 | 58.5 | 59.1 | 52.2 | 11.4 | 21.8 |
| Std5 | 732.3 | 941.4 | 701.1 | 791.6 | 130.7 | 16.5 | |
| Nucleocapsid | STD2 | 1342.6 | 1621 | 1718.2 | 1560.6 | 195 | 12.5 |
| Std5 | 13543.9 | 14843.2 | 17883.4 | 15423.5 | 2227.2 | 14.4 |
Tabel 3: Inter-assay præcision med standardprøver: Procentvis varianskoefficient (%CV) beregnet ud fra tre forskellige batcher af assays, evalueret ved standard 2 og standard 5 i samme eksperiment. Værdier angivet for replikater og gennemsnit repræsenterer de observerede MFI-værdier.
| IgG-PE | IgM-SB | IgA-PE | |||||
| Ave. MFI | %CV | Ave. MFI | %CV | Ave. MFI | %CV | ||
| Spids S1 | Emne 1 | 8002.3 | 17.7 | 1949.5 | 1.3 | 2045.8 | 5.5 |
| Emne 2 | 19155.8 | 7.3 | 918.6 | 4.1 | 1684.5 | 3.9 | |
| Emne 3 | 17865.6 | 18.0 | 549.4 | 3.8 | 961.3 | 8.1 | |
| Emne 4 | 11901.1 | 2.6 | 1603 | 4.8 | 8736.4 | 5.5 | |
| Emne 5 | 9801.8 | 4.0 | 1014.1 | 3.0 | 2747.6 | 9.3 | |
| Nucleocapsid | Emne 1 | 15097.8 | 11.3 | 1049.7 | 9.9 | 5276.5 | 3.9 |
| Emne 2 | 15204.3 | 12.1 | 265.9 | 5.2 | 6761.3 | 11.9 | |
| Emne 3 | 18471.7 | 24.4 | 329.1 | 4.5 | 14308 | 2.9 | |
| Emne 4 | 16424.7 | 3.5 | 2418.1 | 0.1 | 4234.7 | 4.2 | |
| Emne 5 | 13344.9 | 3.6 | 225.6 | 10.0 | 13436.5 | 9.7 | |
| Membran | Emne 1 | 514.6 | 8.6 | 180.6 | 14.0 | 141.2 | 9.8 |
| Emne 2 | 196.8 | 5.2 | 57 | 20.7 | 55.5 | 13.0 | |
| Emne 3 | 553.7 | 12.9 | 54.5 | 21.2 | 191.2 | 18.6 | |
| Emne 4 | 377.9 | 3.2 | 68.1 | 22.1 | 62 | 2.3 | |
| Emne 5 | 325.4 | 8.2 | 11.4 | 91.6 | 74.6 | 20.8 |
Tabel 4: Interassaypræcision med humane prøver: Gennemsnitlig procentvis varianskoefficient (% CV) beregnet ud fra tre batcher af assays testet med plasmaprøver (fortyndet 500 gange) fra fem forsøgspersoner med SARS-CoV-2-infektioner.
| Spids S1 | Membran | Nucleocapsid | |||||
| μg/ml | Ave. MFI | % Maks. | Ave. MFI | % Maks. | Ave. MFI | % Maks. | |
| Igm | 0.5 | 186 | 13.2 | 32 | 25.2 | 132.7 | 13.6 |
| 1 | 304.2 | 21.6 | 45.8 | 36 | 194.4 | 19.9 | |
| 2 | 664.5 | 47.2 | 78.8 | 61.9 | 458.2 | 47 | |
| 4 | 1032.1 | 73.3 | 101.3 | 79.6 | 707.8 | 72.6 | |
| 8 | 1407.1 | 100 | 127.2 | 100 | 975 | 100 | |
| IgG | 0.5 | 809.7 | 4.9 | 27.5 | 15 | 1355.6 | 6.3 |
| 1 | 1696.9 | 10.2 | 40.6 | 22.2 | 2782.1 | 13 | |
| 2 | 4543.8 | 27.3 | 68.3 | 37.3 | 6661.2 | 31.2 | |
| 4 | 10003.5 | 60 | 110.7 | 60.5 | 12605.6 | 59 | |
| 8 | 16662.8 | 100 | 182.9 | 100 | 21360.6 | 100 | |
| IgA | 0.5 | 797.4 | 19.3 | 31.1 | 47.2 | 2056.5 | 16.1 |
| 1 | 1529.5 | 37 | 41.4 | 62.8 | 3869 | 30.4 | |
| 2 | 2261.3 | 54.7 | 48.6 | 73.3 | 6648.9 | 52.2 | |
| 4 | 2320.4 | 56.2 | 48.3 | 73.2 | 6548.1 | 51.4 | |
| 8 | 4132.2 | 100 | 65.9 | 100 | 12744.8 | 100 | |
Tabel 5: Optimering af sekundær antistofkoncentration: Det gennemsnitlige MFI-signal produceret fra forskellige koncentrationer af sekundære antistoffer fra 0,5 μg/ml til 8 μg/ml. Værdien af hvert signal præsenteres også som en procentdel af signalet ved 8 μg/ml ("Max.") for at demonstrere relativ signalstørrelse.
| Spids S1 | Membran | Nucleocapsid | |||||
| Inkubationstid (min.) | Ave. MFI | % Maks. | Ave. MFI | % Maks. | Ave. MFI | % Maks. | |
| Igm | 15 | 1185 | 72.2 | 40.4 | 48.9 | 609.5 | 53.3 |
| 30 | 1416.6 | 86.3 | 58.4 | 70.7 | 894.2 | 78.2 | |
| 60 | 1324.8 | 80.7 | 73.6 | 89.1 | 945.6 | 82.7 | |
| 120 | 1641.2 | 100 | 82.6 | 100 | 1143.2 | 100 | |
| IgG | 15 | 12917.6 | 80.5 | 244.4 | 44.9 | 15429.8 | 80.8 |
| 30 | 14915.4 | 92.9 | 434.7 | 79.9 | 18797 | 98.5 | |
| 60 | 15340.3 | 95.6 | 421.4 | 77.5 | 18694.4 | 97.9 | |
| 120 | 16050.3 | 100 | 544 | 100 | 19085.8 | 100 | |
| IgA | 15 | 3141.9 | 78.2 | 75 | 66.8 | 9103 | 86.6 |
| 30 | 3569.1 | 88.8 | 83.9 | 74.8 | 9563.8 | 91 | |
| 60 | 3539.1 | 88 | 86 | 76.6 | 9555.7 | 90.9 | |
| 120 | 4020 | 100 | 112.2 | 100 | 10512.9 | 100 |
Tabel 6: Optimering af sekundær antistofinkubationstid: Det gennemsnitlige MFI-signal produceret fra forskellige inkubationstider for sekundære antistoffer, der spænder fra 15 min til 120 min. Værdien af hvert signal er også repræsenteret som en procentdel af signalet ved 120 min ("Max.") for at demonstrere relativ signalstørrelse.
Discussion
Værdsættelsen af et immunrespons på SARS-CoV-2-eksponering i forbindelse med RT-PCR-baseret overvågning af infektionsstatus er blevet godt beskrevet som en recept til at afklare forløbet af genopretning fra Covid-19, til at tjene som et middel til at identificere rekonvalescerende plasma med potentiel terapeutisk værdi og til at undersøge infektionsrater påbefolkningsskalabasis 10,11. Forskellige eksempler på forståelse af serokonversion hos mennesker inkluderer protein (antigen) arrays12, immunoblots13, hurtige immunokromatografiske konstruktioner14 og enzymbundne immunosorbentassays (ELISA'er)15,16,17. Hver af disse ovennævnte teknikker kan vurdere flere immunoglobulinisotyper individuelt med mindre ændringer. Disse procedurer kan imidlertid ikke anvendes i praksis til at muliggøre parallel analyse af flere isotyper, som præsenteret i dette manuskript, hvilket gør omkostnings- og gennemstrømningsfaktorer til begrænsninger for deres administration på en befolkningsbaseret teststrategi. Flere af disse applikationer giver også mulighed for at sammenkæde niveauer af flere antigener parallelt enten som præsenteret eller i ændrede formater, såsom en multiplex ELISA18,19. Endelig giver immunobead-platformen mulighed for at evaluere niveauer af flere antigener parallelt20,21, men er blevet begrænset til en enkelt epitop (dvs. immunoglobulinisotype) pr. assay, medmindre det nylige instrument med 'dual-channel' assayfunktioner imidlertid anvendes.
I denne rapport opregnes protokoller, der etablerer pålidelig måling af flere epitoper i et immunobead-assay ved hjælp af instrumentet i 'dual-channel' -tilstand i et casestudie af serokonversion af Covid-19-vaccinerede individer. Metoden demonstrerede fremragende præcision (% CV-værdier typisk <20%) ved hjælp af manuelle analysedesign, der kan forbedres med integrationen af laboratorieautomatiserede systemer. Assayfølsomhed og dynamisk område for alle udvalgte analytter og epitoper var egnede til rutinemæssige evalueringer. Selv om manglen på kommercielt tilgængelige antiantigen-IgA- og IgM-immunoreagenter begrænsede kvantificeringen til IgG-isotypen, udelukker en sådan begrænsning ikke muligheden for at tilbyde semikvantitative vurderinger eller vurderinger i forhold til en specifik prøve som kalibrant22,23.
Det validerede immunobead-assay blev tildelt til at undersøge serokonversion i en kohorte af personer immuniseret med Covid-19-vaccinen. I modsætning til andre lignende platforme tillader instrumentfamilien prospektering af serokonversion hos hundreder af individer om dagen i en manuel arbejdsgang og tusinder om dagen i en automatiseret ordning. Samlet set bekræfter disse resultater, at "dual channel"-metoden har passende følsomhed til beskrivelse af flere epitoper parallelt for det identiske assay og er levedygtig i en multianalytkontekst. En forskel i følsomhed over for kanal 1 og kanal 2, som udført med henholdsvis phycoerythrin og Super Bright 436 fluorophorer, kan berettige design af et specifikt eksperiment for at sikre, at der opnås levedygtige analyseresultater for et givet eksperiment. Det vil sige, at reservationen af kanal 1 for epitoper eller analytter med en lavere prævalens kan være nødvendig for at opretholde et dynamisk område af analysen, der inkluderer de observerede værdier af ukendte. Ud over denne overvejelse var analysedesign indlysende og bør være let tilgængeligt for laboratorier med begrænset analytisk kapacitet. Denne overvejelse bør bestemt afvejes, når man overvejer kanal 1 til kanal 2-interferens, som vi bemærkede for figur 5, hvorved interferens fra isotyper med højere forekomst kan forårsage vildledende analytiske fejl for dem i meget lavere forekomst, når de måles i et dobbeltkanalformat. Dette potentiale for interferens i situationer med meget forskellige analysandkoncentrationer kan udgøre en betydelig begrænsning af tilgangen, hvis den ikke håndteres korrekt i analysedesignfasen.
Afslutningsvis blev der præsenteret en metode til hurtigt at måle antistoftitre fra de vigtigste immunoglobulinisotyper forbundet med et immunrespons på Covid-19-infektion eller vaccination. Anvendelse af denne tilgang på en langsgående måde til vurdering af serokonversion kan give indsigt, der bedre kan bruges til at styre og / eller overvåge sygdomsforløbet eller alternativt guide potentielle Covid-19 boostervaccineprogrammer.
Disclosures
Dr. Borgia er opfinderen af den serologiske test, der anvendes i dette manuskript, som er patentanmeldt. Artiklen præsenteres kun på en beskrivende måde uden statistiske analyser præsenteret for at undgå potentiel bias introduceret af forfatterkonflikt.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker at takke Rush Biomarker Development Core for brugen af deres faciliteter, Rush Biorepository til emneindskrivning og biospecimenbehandling og Walder Foundations Chicago Coronavirus Assessment Network (Chicago CAN) Initiative tilskudsnumre SCI16 (J.R.S. og J.A.B.) og 21-00147 (J.R.S. og J.A.B.) og en pris fra Swim Across America Foundation (J.A.B.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 384-well black side polystyrene microtiter plates | Thermo Fisher | 12-565-346 | |
| Activation buffer (0.1 M NaH2PO4, pH 6.2) | Prepared in house | ||
| Assay buffer (PBS, 1% Bovine Serum Albumin, 0.01% Polysorbate-20) | Prepared in house | ||
| Bovine Serum Albumin, heat shock fraction | MilliporeSigma | A-7888-50G | |
| Coupling buffer (50 mM MES, pH 5.0) | Prepared in house | ||
| COVID 19 M Coronavirus Recombinant Matrix Protein (6xHis tag) | MyBioSource | MBS8574735 | |
| Disposable pipette tips | |||
| EDC (1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride) | Thermo Fisher | PIA35391 | |
| Goat Albumin, Fraction V Powder | MilliporeSigma | A2514-1G | |
| IgA Goat anti-Human, R-PE, Polyclonal | Thermo Fisher | OB205009 | |
| IgG Goat anti-Human, R-PE, Polyclonal | Thermo Fisher | OB204009 | |
| IgG Goat anti-Rabbit, R-PE, Polyclonal | Thermo Fisher | OB403009 | |
| IgM Goat anti-Human, R-PE, Polyclonal | Thermo Fisher | OB202009 | |
| IgM Mouse anti-Human, SB 436, Clone SA-DA4 | Thermo Fisher | 62999842 | |
| Instrument Analyzer | Luminex Corp. | INTELLIFLEX-RUO | |
| Low-Bind microcentrifuge tubes (1.5 mL) | Thermo Fisher | 13-698-794 | |
| MagPlex-C Microspheres, Region XXX | Luminex Corp. | MC10XXX-01 | |
| MES hydrate (2-(N-Morpholino) ethane sulfonic acid hydrate) | MilliporeSigma | M2933 | |
| Microplate aluminum sealing tape | Thermo Fisher | 07-200-683 | |
| Polysorbate-20 | Thermo Fisher | BP337-500 | |
| Quality Biological Inc. PBS, pH 7.2 | Thermo Fisher | 50-751-7328 | |
| Quench buffer (PBS, 1% Goat Serum Albumin, 0.01% Polysorbate-20) | Prepared in house | ||
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Nucleocapsid Protein (His tag) | Sino Biologicals | 40588-V08B | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Protein (S1 Subunit, His tag) | Sino Biologicals | 40591-V08H | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike RBD Antibody, Rabbit pAb | Sino Biologicals | 40592-T62 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Nucleocapsid Antibody, Rabbit mAb | Sino Biologicals | 40588-R0004 | |
| SARS-CoV-2 (COVID-19) Membrane Antibody (IN), Rabbit pAb | ProSci | 10-516 | |
| Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | Thermo Fisher | PIA39269 | |
| Wash Buffer (PBS, 0.01% Polysorbate-20) | Prepared in house | ||
| Water, LC/MS grade | Thermo Fisher | W-64 |
References
- Tighe, P. J., Ryder, R. R., Todd, I., Fairclough, L. C. ELISA in the multiplex era: potentials and pitfalls. Proteomics - Clinical Applications. 9, 406-422 (2015).
- Baker, H. N., Murphy, R., Lopez, E., Garcia, C. Conversion of a capture ELISA to a Luminex xMAP assay using a multiplex antibody screening method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e4084 (2012).
- Powell, R. L., et al. A multiplex microsphere-based immunoassay increases the sensitivity of siv-specific antibody detection in serum samples and mucosal specimens collected from rhesus macaques infected with SIVmac239. BioResearch Open Access. 2 (3), 171-178 (2013).
- Volpetti, F., Garcia-Cordero, J., Maerkl, S. J. A microfluidic platform for high-throughput multiplexed protein quantitation. PLoS One. 10 (2), 0117744 (2015).
- Rabi, F. A., Al Zoubi, M. S., Kasasbeh, G. A., Salameh, D. M., Al-Nasser, A. D. SARS-CoV-2 and coronavirus disease 2019: What we know so far. Pathogens. 9 (3), 231 (2020).
- Asif, M., Xu, Y., Xiao, F., Sun, Y. Diagnosis of COVID-19, vitality of emerging technologies and preventive measures. Chemical Engineering Journal. 423, Lausanne, Switzerland. 130189 (2021).
- La Marca, A., Capuzzo, M., Paglia, T., Roli, L., Trenti, T., Nelson, S. M. Testing for SARS-CoV-2 (COVID-19): a systematic review and clinical guide to molecular and serological in-vitro diagnostic assays. Reproductive Biomedicine Online. 41 (3), 483-499 (2020).
- Armbruster, D. A., Pry, T. Limit of blank, limit of detection and limit of quantitation. The Clinical Biochemist. Reviews. 29, Suppl 1 49-52 (2008).
- Tarhoni, I., et al. Relationship between circulating tumor-associated autoantibodies and clinical outcomes in advanced-stage NSCLC patients receiving PD-1/-L1 directed immune checkpoint inhibition. Journal of Immunological Methods. 490, 112956 (2021).
- Deeks, J. J., et al. Antibody tests for identification of current and past infection with SARS-CoV-2. The Cochrane Database of Systematic Reviews. 6, 013652 (2020).
- Mahalingam, S., et al. Landscape of humoral immune responses against SARS-CoV-2 in patients with COVID-19 disease and the value of antibody testing. Heliyon. 7 (4), 06836 (2021).
- Ruano-Gallego, D., et al. A multiplex antigen microarray for simultaneous IgG and IgM detection against SARS-CoV-2 reveals higher seroprevalence than reported. Microbial Biotechnology. 14 (3), 1228-1236 (2021).
- Shah, J., et al. IgG and IgM antibody formation to spike and nucleocapsid proteins in COVID-19 characterized by multiplex immunoblot assays. BMC Infectious Diseases. 21 (1), 325 (2021).
- Gambino, C. M., et al. Comparison of a rapid immunochromatographic test with a chemiluminescence immunoassay for detection of anti-SARS-CoV-2 IgM and IgG. Biochemia Medica (Zagreb). 30 (3), 030901 (2020).
- Algaissi, A., et al. SARS-CoV-2 S1 and N-based serological assays reveal rapid seroconversion and induction of specific antibody response in COVID-19 patients. Scientific Reports. 10, 16561 (2020).
- Chiereghin, A., et al. Recent advances in the evaluation of serological assays for the diagnosis of SARS-CoV-2 infection and COVID-19. Frontiers in Public Health. 8, 620222 (2020).
- Nicol, T., et al. Assessment of SARS-CoV-2 serological tests for the diagnosis of COVID-19 through the evaluation of three immunoassays: Two automated immunoassays (Euroimmun and Abbott) and one rapid lateral flow immunoassay (NG Biotech). Journal of Clinical Virology: The Official Publication of the Pan American Society for Clinical Virology. 129, 104511 (2020).
- Butt, J., et al. From multiplex serology to serolomics-A novel approach to the antibody response against the SARS-CoV-2 proteome. Viruses. 13 (5), 749 (2021).
- Byrum, J. R., et al. multiSero: open multiplex-ELISA platform for analyzing antibody responses to SARS-CoV-2 infection. medRxiv. , (2021).
- Dobano, C., et al. Highly sensitive and specific multiplex antibody assays to quantify immunoglobulins m, a, and g against SARS-CoV-2 antigens. Journal of Clinical Microbiology. 59 (2), 01731 (2021).
- Schultz, J. S., et al. Development and validation of a multiplex microsphere immunoassay using dried blood spots for SARS-CoV-2 seroprevalence: Application in first responders in first responders in Colorado, USA. Journal of Clinical Microbiology. 59 (6), 00290 (2021).
- Beavis, K. G., et al. Evaluation of the EUROIMMUN anti-SARS-CoV-2 ELISA assay for detection of IgA and IgG antibodies. Journal of Clinical Virology: The Official Publication of the Pan Americal Society for Clinical Virology. 129, 104468 (2020).
- Jung, J., et al. Clinical performance of a semi-quantitative assay for SARS-CoV2 IgG and SARS-CoV2 IgM antibodies. Clinica Chimica Acta: International Journal of Clinical Chemistry. 510, 790-795 (2020).
