엔토모병원성 진균 콜로니는 테네브리오 미끼, 갤러리아 미끼 및 선택적 인공 배지, 즉 클로람페니콜, 티아벤다졸 및 시클로헥시미드(CTC 배지)로 보충된 효모 추출물이 풍부한 감자 덱스트로스 한천을 사용하여 열대 토양 샘플로부터 분리된다.
본 연구의 목표는 토양 샘플로부터 엔토모병원성 진균(EPF)을 분리하기 위한 곤충 미끼 대 인공 선택적 배지 사용의 효과를 비교하는 것이다. 토양은 절지 동물 해충을 조절할 수있는 Metarhizium 및 Beauveria 속에 특히 속하는 EPF를 포함한 미생물의 풍부한 서식지입니다. 곰팡이를 기본으로하는 생물학적 제품은 주로 농업 절지 동물 해충 방제를 위해 시장에서 구입할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 높은 고유 생물 다양성에도 불구하고, 단지 몇 가지 균주만이 전 세계적으로 상업적 바이오 제품에 사용된다. 본 연구에서, 524개의 토양 샘플을 클로람페니콜, 티아벤다졸 및 시클로헥시미드(CTC 배지)로 보충된 효모 추출물이 풍부한 감자 덱스트로스 한천에서 배양하였다. 진균 콜로니의 성장은 3주 동안 관찰되었다. 모든 Metarhizium 및 Beauveria EPF는 속 수준에서 형태학적으로 확인되었습니다. 추가적으로, 일부 단리물은 종 수준에서 분자적으로 확인되었다. 이 524 개의 토양 샘플 중 스물 네 개는 곤충 미끼 방법 (갤러리아 멜로 넬라 및 테네브리오 몰리터)을 사용하여 EPF 발생에 대해 조사되었습니다. 총 51개의 EPF 균주(41개의 메타리지움 spp. 및 10개의 보베리아 spp.)를 524개의 토양 샘플로부터 분리하였다. 모든 곰팡이 균주는 농경지 또는 초원에서 분리되었습니다. 비교를 위해 선택된 24개의 샘플 중 91.7%는 갤러리아 미끼를 사용한 EPF에 대해 양성이었고, 62.5%는 테네브리오 미끼를 사용했으며, 41.7%는 CTC를 사용하여 양성이었다. 우리의 결과는 곤충 미끼를 사용하여 토양에서 EPF를 분리하는 것이 CTC 배지를 사용하는 것보다 더 효율적이라는 것을 시사했습니다. EPF의 식별 및 보존 외에도 분리 방법의 비교는 생물 다양성에 대한 지식에 긍정적 인 영향을 미칩니다. EPF 컬렉션의 개선은 과학 발전과 기술 혁신을 지원합니다.
토양은 엔토모병원성 진균(EPF)을 포함한 여러 미생물의 공급원입니다. 이 특정 곰팡이 그룹은 절지 동물 숙주, 특히 곤충을 식민지화하고 종종 죽일 수있는 능력에 의해 인식됩니다1. 분리, 특성화, 독성 균주의 선택 및 등록 후, EPF는 절지 동물 해충 방제를 위해 대량 생산되며, 이는 경제적 관련성2을 지원합니다. 따라서, EPF의 분리는 생물농약의 개발을 위한 첫 번째 단계로 간주된다. Beauveria spp. (Hypocreales : Cordycipitaceae)와 Metarhizium spp. (Hypocreales : Clavicipitaceae)는 절지 동물 해충 방제에 사용되는 가장 일반적인 곰팡이입니다3. EPF는 토양, 눈에 보이는 진균증을 가진 절지 동물, 식민지화 된 식물 및 식물 근권 4,5에서 성공적으로 분리되었습니다.
EPF의 분리는 또한이 특정 그룹의 다양성, 분포 및 생태학을 연구하는 데 유용 할 수 있습니다. 최근 문헌들은 EPF의 사용이 과소평가되고 있으며, 식물 생장을 개선하고4, 토양으로부터 독성 오염물질을 제거하고, 약6에서 사용될 수 있는 능력과 같은 EPF의 몇몇 비전통적 응용을 인용하고 있다. 본 연구는 곤충 미끼를 사용하여 토양에서 EPF를 분리하는 효율과 인공 배양 배지 7,8,9를 비교하는 것을 목표로합니다. EPF 격리의 맥락에서 곤충 미끼로 갤러리아 멜로 넬라 L. (Lepidoptera : Phyralidae)의 사용은 잘 받아 들여졌습니다. 이 유충은 전 세계적으로 과학계에서 숙주 – 병원체 상호 작용10,11을 연구하기위한 실험 모델로 사용됩니다. Tenebrio molitor L. (Coleoptera : Tenebrionidae) 유충은 독성과 관련된 연구 및 EPF의 격리를위한 또 다른 곤충 모델로 간주됩니다.이 곤충은 저렴한 비용으로 실험실에서 희귀하기 쉽기 때문에 7,12.
다양한 PCR 기술을 사용하는 것과 같은 배양-독립적인 방법은 토양13,14를 포함하는 그들의 기질 상의 EPF를 검출하고 정량화하는데 적용될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 이들 진균 콜로니를 적절하게 단리하기 위해, 이들의 기질은 선택적인 인공 배지(9) 상에서 배양되어야 하거나, 샘플에 존재하는 진균은 민감한 곤충(15)을 사용하여 미끼화될 수 있다. 한편, CTC는 클로람페니콜, 티아벤다졸 및 시클로헥시미드로 보충된 효모 추출물이 풍부한 감자 덱스트로스 한천으로 구성된 도딘이 없는 인공 배지입니다. 이 배지는 Fernandes et al.에 의해 개발되었다. 9 토양에서 자연적으로 발생하는 Beauveria spp. 및 Metarhizium spp.의 회수를 극대화합니다. 한편, G. mellonella 및 T. molitor 유충은 또한 토양으로부터 EPF 분리 물을 얻기 위한 미끼로서 성공적으로 사용될 수 있다. 그럼에도 불구하고 Sharma et al.15에 따르면,이 두 미끼 곤충의 병용 사용과 비교를보고하는 연구는 거의 없습니다. 포르투갈 포도원 토양은 Metarhizium robertsii (Metscn)의 상당한 회복을 나타냈다. T를 사용하는 소로킨. G. 멜로넬라 유충과 비교하여 몰리터 유충; 대조적으로, Beauveria bassiana (Bals. -Criv.) Vuill 격리는 G. mellonella 미끼15의 사용과 관련이 있습니다. 따라서, 어떤 EPF 분리 방법(즉, G. mellonella-bait, T. molitor-bait 또는 CTC 배지)을 사용할지에 대한 결정은 연구의 목표 및 실험실 인프라에 따라 고려되어야 한다. 본 연구의 목표는 토양 샘플로부터 EPF를 분리하기 위한 곤충 미끼 대 인공 선택 배지 사용의 효과를 비교하는 것이다.
자연 및 농업 토양 서식지는 EPF22 및 우수한 자연 저수지의 전형적인 환경입니다. 본 연구에서, 곤충 미끼 대 선택적 배지를 사용하는 EPF 분리의 두 가지 방법이 다루어졌다. 격리를위한 첫 번째 단계는 토양 샘플의 수집입니다. 토양 샘플의 적절한 저장 및 확인이 중요합니다. 위도, 경도, 토양 유형 및 생물 군계에 대한 정보는 역학, 모델링 및 지리 공간 과목23,24</su…
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 브라질의 Coordenacão de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Financial code 001, Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) (프로젝트 번호 E-26/010.001993/2015) 및 Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) 브라질에서 자금을 조달했습니다.
Autoclave | Phoenix Luferco | 9451 | |
Biosafety cabinet | Airstream ESCO | AC2-4E3 | |
Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
Climate chambers | Eletrolab | EL212/3 | |
Coverslip | RBR | 3871 | |
Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
Drigalski spatula | Marienfeld | 1800024 | |
GPS app | Geolocation app | 2.1.2005 | |
Lactophenol blue solution | Sigma-Aldrich | 61335 | |
Microscope | Zeiss Axio star plus | 1169 149 | |
Microscope camera | Zeiss Axiocam 105 color | 426555-0000-000 | |
Microscope softwere | Zen lite Zeiss 3.0 | ||
Microscope slide | Olen | k5-7105-1 | |
Microtube | BRAND | Z336769-1PAK | |
Petri plates | Kasvi | K30-6015 | |
Pipette tip | Vatten | VT-230-200C/VT-230-1000C | |
Pippette | HTL – Labmatepro | LMP 200 / LMP 1000 | |
Plastic pots | Prafesta descartáveis | 8314 | |
Polypropylene bags | Extrusa | 38034273/5561 | |
Potato dextrose agar | Kasvi | K25-1022 | |
Prism software 9.1.2 | Graph Pad | ||
Shovel | Tramontina | 77907009 | |
Tenebrio mollitor | Safari | QP98DLZ36 | |
Thiabendazole | Sigma-Aldrich | T8904 | |
Tween 80 | Vetec | 60REAVET003662 | |
Vortex | Biomixer | QL-901 | |
Yeast extract | Kasvi | K25-1702 |