Aplicaciones de la interferencia de ARN en cucarachas americanas
Summary
El presente protocolo describe las pautas paso a paso para las técnicas de operación de ARNi en P. americana.
Abstract
Las cucarachas, una plaga sanitaria, son especies esenciales en el desarrollo de insectos y estudios metamórficos debido a su fácil alimentación y características hemimetábolas. Junto con secuencias genómicas bien anotadas, estas ventajas han hecho de la cucaracha americana, Periplaneta americana, un importante modelo de insecto hemimetábolo. Limitado por la escasez de estrategia de knockout, el knockdown de genes efectivo basado en la interferencia de ARN (RNAi) se convierte en una técnica indispensable en la investigación de genes funcionales de P. americana. El presente protocolo describe las técnicas de operación de ARNi en P. americana. El protocolo incluye (1) la selección de la P. americana en las etapas de desarrollo adecuadas, (2) la preparación para el ajuste de la inyección, (3) la inyección de dsRNA y (4) la detección de la eficiencia de derribo de genes. El ARNi es una poderosa herramienta genética inversa en P. americana. La mayoría de los tejidos de P. americana son sensibles al dsRNA extracelular. Su simplicidad permite a los investigadores obtener rápidamente fenotipos disfuncionales bajo una o múltiples inyecciones de dsRNA dirigidas, lo que permite a los investigadores utilizar mejor la P. americana para estudios de desarrollo y metamórficos.
Introduction
La interferencia de ARN (RNAi), un mecanismo conservado evolutivamente, se convierte gradualmente en una herramienta genética inversa esencial para inhibir la expresión génica en muchos organismos1, ya que Andrew Fire y Craig Mello2 desarrollaron la estrategia de silencio genético mediado por ARN de doble cadena (dsRNA). El dsRNA se escinde en fragmentos de 21-23 nucleótidos, pequeños ARN interferentes (siRNAs), por la enzima Dicer en las células para activar la vía del ARNi. Luego, los siRNAs se incorporan al complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC), que se acopla al ARNm objetivo, causa la escisión del ARNm y finalmente resulta en la pérdida de la funcióndel gen 3,4,5. Entre las especies de insectos, hasta ahora se han reportado muchos experimentos sistémicos de ARNi en muchos órdenes de insectos, como Orthoptera, Isoptera, Hemiptera, Coleoptera, Neuroptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera y Blattodea 5,6,7,8.
Las cucarachas (Blattaria) son una familia de insectos esenciales en estudios de desarrollo y metamórficos con sus ciclos de crecimiento rápido, fuerte adaptabilidad al medio ambiente y alta plasticidad de desarrollo9. Antes de descubrir que el ARNi era compatible con las cucarachas, las investigaciones anteriores solo se centraron en la prevención y el control de las cucarachas debido a la escasez de técnicas de manipulación genética en las cucarachas. La estructura única de la cucaracha ootheca hizo que fuera un desafío realizar la eliminación de genes basada en inyección de embriones con el sistema CRISPR-Cas9. Además, la mayoría de los tejidos de las cucarachas (como P. americana) muestran una respuesta arNi sistémica robusta, lo que permite la rápida generación de fenotipos disfuncionales mediante la inyección de uno o más dsRNAsdirigidos 9,10,11. Estas características hicieron del ARNi una técnica indispensable en la investigación funcional génica en P. americana.
A pesar de que se ha informado del uso de ARNi en la investigación de genes funcionales en P. americana , no se disponía de una descripción detallada o paso a paso. Este informe proporciona una guía operativa paso a paso para el ARNi en P. americana, útil para el estudio de la función génica en otras cucarachas. Además, esta guía no se limita a Blattodea y se puede aplicar a muchos otros insectos con modificaciones menores.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este informe describió una estrategia metodológica de ARNi paso a paso en P. americana; Cabe destacar que también se puede aplicar a otras cucarachas (Blattella germanica, por ejemplo) y muchos otros insectos con cambios menores. Sin embargo, la eficiencia de silenciamiento génico del ARNi no siempre es lo suficientemente alta, con una desventaja obvia en comparación con la estrategia de eliminaciónde genes 13. El siguiente efecto residual a nivel de gen puede interferir co…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Grant Nos. 32070500, 31620103917, 31330072 y 31572325 a C.R., Sh.L.), por la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Guangdong (Grant No. 2021B1515020044 y 2020A1515011267 a C.R.), por el Departamento de Ciencia y Tecnología de la Provincia de Guangdong (Grant Nos. 2019B090905003 y 2019A0102006), por el Departamento de Ciencia y Tecnología en Guangzhou (Grant No. 202102020110), por el Programa de Ciencia y Tecnología de Shenzhen (Subvención No. KQTD20180411143628272 a Sh.L.).
Materials
| 701 N 10 µL Syr (26s/51/2) | Hamilton | PN:80300 | Injection |
| Incubator | Ningbo Jiangnan Instrument Factory | RXZ-380A-LED | For cockroaches hatching and feeding |
| Micro-injection pump | Alcott Biotechnology | ALC-IP600 | Injection |
| pTOPO-Blunt Cloning Kit | Aidlab Biotechnology | CV16 | For Gene clonging |
| quantitative Real-Time PCR Systems | Bio-Rad | CFX Connect | For qRT-PCR analysis |
| T7 RiboMAX Express RNAi System | Promega | P1700 | For dsRNA synthesis, which contains Rnase A Solution (4 μg/μL), Sodium Acetate, 3.0M (pH 5.2), Enzyme Mix, T7 Express, Nuclease-Free water, Express T7 2x Buffer, RQ1 RNase-Free DNase |
| Thermal Cyclers | Bio-Rad | S1000 | For DNA amplification |
Riferimenti
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