Summary
هنا ، نقدم بروتوكولا مباشرا لأخذ العينات الجينية غير الغازية لمجموعات الفراشات بناء على المجموعة الميدانية لبقايا البيض. يمكن استخدامه لتأكيد هوية الأنواع وتحديد التباين الجيني. يمكن تكييف هذا البروتوكول بسهولة مع مجموعات أوسع لمشاركة علوم المجتمع.
Abstract
يستمر انخفاض الحشرات العالمية في التسارع. هناك حاجة ماسة إلى أخذ عينات جينية فعالة لتعزيز فهم العديد من الأصناف ومعالجة الفجوات المعرفية القائمة. يمثل هذا البروتوكول طريقة مثبتة لأخذ عينات غير مدمرة من الفراشات النادرة للبنية الجينية للسكان أو تحليلات ترميز الحمض النووي. يستخدم مشيمية بويضات الفراشة المفرغة لإنتاج كمية عالية من الحمض النووي والجودة بما فيه الكفاية لتسلسل الجينات الناجح لتأكيد هوية الأنواع وتحديد التباين الجيني. قد يكون مفيدا بشكل خاص عندما تكون تقنيات أخذ عينات الأنسجة الأخرى غير عملية أو غير متوفرة. في حين تم تطويره لحرشفيات الأجنحة ، إلا أنه يمكن تكييفه بسهولة للاستخدام مع أنواع الحشرات الأخرى. تم تصميمه خصيصا مع سهولة الاستخدام كهدف للمساعدة في تحقيق أقصى قدر من التنفيذ الواسع من قبل الأفراد من مستويات الخبرة والمهارة المختلفة ، مثل علماء المجتمع وممارسي الحفظ والطلاب ، وللاستخدام في مناطق جغرافية واسعة لتسهيل أخذ عينات واسعة من السكان. يمكن أن تساعد البيانات المتولدة في إبلاغ قرارات التصنيف والإدراج ، وإجراءات الحفظ والإدارة ، وتعزيز البحوث البيئية الأساسية.
Introduction
غالبا ما يكون أخذ العينات الجينية الفعالة للسكان من أصناف الحشرات النادرة و / أو المتناقصة و / أو المدرجة أمرا بالغ الأهمية للمساعدة في إبلاغ إجراءات الحفظ والإدارة. تستخدم طرق أخذ عينات الأنسجة القاتلة أو الضارة بشكل روتيني في العديد من التحليلات الجينية. ومع ذلك ، فإن هذه الأساليب غير مرغوب فيها أو غير مسموح بها لأنها قد تسبب ضررا للسكان الضعفاء أو تؤثر سلبا على السلوك واللياقة البدنية. كانت تقنيات أخذ العينات المختلفة غير القاتلة أو غير الباضعة التي تتضمن أنسجة مثل الساقين بالكامل أو قصاصات الهوائي أو الجناح أو اليرقات الخارجية أو الدملمف من الإفرازات الدفاعية وغيرها من المنتجات ، مثل frass ، مناسبة للبحوث الوراثية للحشرات1،2،3،4،5،6،7،8،9 . تختلف الجدوى العامة وقابلية تطبيق تقنيات أخذ عينات الأنسجة المختلفة هذه بشكل كبير بناء على البيولوجيا والبيئة والسلوك والحجم وندرة الكائن البؤري والوضع والأفراد الذين يجمعون المواد. على سبيل المثال ، تتطلب قصاصات الأرجل الكاملة أو الزائدة الدودية التقاطا مؤقتا ومعالجا دقيقا للعديد من الأفراد في مرحلة حياة مناسبة ، عادة من قبل أفراد ذوي خبرة. وبالمثل ، من المحتمل أن تكون مصادر الأنسجة ، مثل اليرقات exuviae أو frass ، عملية فقط إذا كانت الكائنات الحية في الأسر أو محتجزة مؤقتا لفترة كافية.
وبالنسبة لأسئلة البحث التي تطرح على مستوى السكان، مثل تلك المتعلقة بالتمايز التصنيفي المحتمل أو التركيب الجيني، غالبا ما تكون هناك حاجة إلى أخذ العينات على نطاق زمني أو جغرافي أوسع (أي إقليمي أو قاري). نتيجة لذلك ، قد تكون بعض مصادر الأنسجة غير الباضعة غير عملية تماما أو على الأقل غير فعالة لجمع الكمية. بالإضافة إلى ذلك ، قد يكون جمع العينات على هذه المستويات غير عملي من الناحية اللوجستية أو المالية أو محظورا على الباحثين الأفراد أو حتى الفرق الميدانية الأصغر حجما. في حين تم اعتماد المشاركة المباشرة لعلماء المجتمع بشكل متزايد من قبل مجتمع البحث للمساعدة في معالجة العديد من هذه التحديات وتسريع الجمع القائم على البيانات الضخمة ، فقد كان الاعتماد محدودا للدراسات التي تتضمن أخذ عينات غير مدمرة أو غير جراحية أو eDNA10،11،12.
للمساعدة في التغلب على بعض هذه القيود المحتملة ، أثبتنا أن المشيماء من بويضات الفراشة المفرغة يمكن أن ينتج كمية وجودة عالية بما يكفي من الحمض النووي لتسلسل الجينات الناجح لتأكيد هوية الأنواع وتحديد التباين الجيني. اختبرنا بعد ذلك بروتوكولات جمع مختلفة باستخدام هذه التقنية13. وكان هذا العمل الرائد بمثابة أساس لمزيد من التنقيح المنهجي. تصف هذه الورقة بالتفصيل بروتوكول الجمع الميداني المنقح والمباشر والشامل الذي تم طرحه لعلماء المجتمع وغيرهم من الموظفين غير الخبراء. هذا البروتوكول هو جزء من تحليل الهيكل السكاني على نطاق واسع لفراشة العفريت المتجمدة (Callophrys irus) للمساعدة في إبلاغ إجراءات الحفظ المستقبلية وتحديد فيدرالي لاحتمال إدراجها بموجب قانون الأنواع المهددة بالانقراض في الولايات المتحدة. على الرغم من أنه من المحتمل أن يكون أكثر كثافة في العمل من بعض الطرق غير الباضعة ، إلا أن الافتقار إلى الاتصال الضروري بالكائن الحي وسهولة الاستخدام يجعله نموذجا قابلا للتطبيق يمكن تطبيقه على برامج البحوث الجينية السكانية الأخرى التي تستهدف مجموعة مختارة من الحشرات الشائعة وتلك التي تهتم بالحفظ ، والتي تترك بقايا البيض وراءها من الحوريات أو اليرقات التي فقست مؤخرا. تم تطوير لغة البروتوكول المقدمة هنا خصيصا للفراشات في عائلة Lycaenidae وللاستخدام من قبل غير الخبراء المعرفين هنا على أنهم علماء المجتمع أو أفراد آخرون (على سبيل المثال ، علماء الأحياء في الوكالة ، والمتدربون) من ذوي الخبرة المحدودة في علم الحشرات.
Protocol
1. توزيع الإمدادات على علماء المجتمع
- راجع بعناية واجمع القائمة الكاملة للمستلزمات المتعلقة بالمجموعة اللازمة من خلال الرجوع إلى جدول المواد الكامل.
- إذا كان جمع العينات سيتم في مواقع متعددة و / أو من قبل أفراد / فرق متعددة ، فقم بجمع وتنظيم جميع الإمدادات اللازمة في وحدات منفصلة قابلة للنشر (الشكل 1 والشكل 2).
- نقل الإمدادات (الوحدات القابلة للنشر) إلى علماء المجتمع أو غيرهم من الموظفين المسؤولين عن الجمع الميداني.
- إذا لم يكن الموظفون محليين ، فقم بتعبئة الإمدادات بعناية (كل وحدة قابلة للنشر) في صندوق شحن منفصل من الورق المقوى مع ملصق شحن كامل وشحنة.
ملاحظة: الشحن المعجل غير مطلوب في هذه المرحلة.
2. إعداد مجموعة علماء المجتمع
- عند استلام مستلزمات التجميع ، بما في ذلك صندوق معالجة التجميع ، راجع بعناية قائمة التوريد المصفحة وقم بإجراء جرد كامل. قم بإخطار قائد المشروع في حالة فقدان أي إمدادات.
- قم بملء أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل مسبقا ب 180 ميكرولتر من محلول التحلل ، وقم بتطبيق الملصقات بملصق معرف فريد مطبوع مسبقا على كل أنبوب طرد مركزي دقيق ، وضع جميع الأنابيب في صندوق تخزين أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 64 بئرا. قم بتأمين الغطاء بإحكام بعد التحميل.
ملاحظة: في حالة عدم توفر طابعات الملصقات ، ضع أرقام معرفات فريدة على جانب وغطاء كل قارورة باستخدام علامة مقاومة للإيثانول. - تأكد من أن جميع المعدات الرقمية (مثل الهاتف الذكي أو الكاميرا) مشحونة بالكامل ، وأن أي بطاريات احتياطية معبأة.
- املأ جزئيا مبردا صغيرا بالثلج للتخزين الميداني والنقل المحلي للعينات التي تم جمعها.
- قم بتعبئة جميع مستلزمات التجميع في صندوق معالجة التجميع أو حاوية قوية ومقاومة للعوامل الجوية مماثلة للنقل الآمن والتخزين الموحد.
- مراجعة بروتوكول جمع العينات الجينية غير المدمرة بالتفصيل قبل التوجه إلى الميدان.
ملاحظة: استخدم البروتوكول الرقائقي والمكثف والمصور للحصول على إرشادات إضافية في هذا المجال (الشكل التكميلي S1 والشكل التكميلي S2).
3. جمع العينات في الميدان
- عند الوصول إلى الموقع الميداني ، استخدم قلم رصاص أو قلم مناسب لجميع الأحوال الجوية لتسجيل الوقت من اليوم والتاريخ والاسم العام للممتلكات (على سبيل المثال ، غابة Apalachicola الوطنية) ، واسم أو وصف موقع موقع ميداني محدد ، وقراءة GPS إذا كانت متوفرة ، والاسم الكامل وأدوار جميع الأشخاص الحاضرين.
- حدد موقع موطن مناسب مع وجود أنواع نباتية مضيفة لليرقات خاصة بالفراشة المستهدفة.
ملاحظة: توخ الحذر لتجنب أو تقليل التأثير على الموائل الحساسة ومجموعات النباتات والحياة البرية. بالإضافة إلى ذلك ، تأكد من تأمين جميع أذونات و / أو تصاريح مالك الأرض المناسبة قبل الوصول إلى الموقع وأحداث جمع العينات. - باستخدام الهاتف الذكي أو الكاميرا ، التقط صورا مفصلة لجميع المواقع الميدانية ومواقع جمع العينات والنباتات المضيفة وأي معلومات أخرى قد تكون ذات صلة بالمشروع. استخدم الهواتف الذكية أو الكاميرات الأخرى التي تسجل إحداثيات GPS.
ملاحظة: يجب تمكين وضع العلامات الجغرافية للصور على جميع الهواتف الذكية. - ابحث بشكل شامل في جميع أجزاء النبات المضيف لليرقات ، مثل الأوراق أو براعم الزهور أو الزهور أو الفاكهة النامية ، والمعروفة بأنها يتم اختيارها بواسطة فراشات الإناث البالغة (وضع البيض) للبيض المفرغ. بالنسبة لمعظم Lycaenidae ، ابحث عن بيض أبيض فقس مع وجود ثقب مميز في المركز يشبه الكعك الذي خرجت منه يرقة حديث الولادة (الشكل 3). ابحث عن البيض غير المفقس الذي يكون لونه أغمق إلى حد ما ، وغالبا ما يكون أخضر أو مزرقا ، وسيكون سليما تماما بدون ثقب في المنتصف (الشكل 4). استخدم عدسة يدوية أو أي جهاز مكبرة آخر لفحص كل بيضة عن كثب.
- بمجرد تحديد موقع البيضة المفرغة ، ضع قفازات النتريل على كلتا يديه.
- باستخدام ملقط نظيف ومعقم ومدبب ، أمسك البيضة المفرغة واسحبها برفق من النبات المضيف وضعها مباشرة في أنبوب طرد مركزي دقيق المسمى مملوء مسبقا بمخزن تحلل مأخوذ من صندوق التخزين المكون من 64 بئرا.
ملاحظة: بعض مواد ترحيل النبات المضيف (قطرها أصغر من 15 مم) مقبولة وطبيعية أثناء التجميع. - اجمع ما لا يقل عن 5 عينات لكل رقعة / موقع نبات مضيف (تحتوي كل منها على 1-20 بيضة مفرغة) ، بهدف الحصول على إجمالي >50 بيضة في الموقع إذا كان ذلك متاحا.
ملاحظة: سيساعد ذلك في ضمان جمع بعض الأنسجة على الأقل في كل عينة من النباتات / الرقعة وزيادة فرص اكتشاف الحمض النووي (الملاحظة الشخصية). - بعد كل جمع للبيض ، قم بتنظيف أطراف الملقط بعناية عن طريق غمسها في قنينة من الإيثانول بنسبة 95٪ أو عن طريق غمر 95٪ من الإيثانول من زجاجة ضغط أو باستخدام مناديل كحولية.
ملاحظة: سيساعد ذلك في تقليل ترحيل الأنسجة بين أحداث أخذ العينات. - إذا كان ذلك متاحا ، اجمع عدة بيضات مفرغة (1-20 بيضة) من نباتات متعددة في نفس رقعة المضيف في أنبوب طرد مركزي دقيق واحد وأغلق الغطاء بإحكام. بالنسبة لأنواع الفراشات التي تستخدم أنواعا عشبية أو خشبية مضيفة أكبر ، اجمع بيضا متعددا من مواقع مختلفة على نفس النبات إذا كانت بقع المضيف محدودة.
ملاحظة: تكون النباتات في نفس رقعة المضيف إذا لامست أوراقها بعضها البعض. إذا كان هناك فصل مادي ملحوظ بين النباتات أو البقع ، فيجب اعتبار ذلك عينة مختلفة. في حالة جمع نوع آخر من الأنسجة ، مثل اليرقات الخارجية أو ساق واحدة ، ضع ساقا واحدة فقط أو شظية ساق أو إفرازات يرقية في أنبوب طرد مركزي دقيق (عينة واحدة لكل فرد). - تأكد من أن جميع المواد التي تم جمعها مغمورة بالكامل في مخزن التحلل داخل كل أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل. اضغط على الجزء السفلي من الأنبوب المعني على سطح صلب لإعادة غمر أي عينات إذا لزم الأمر.
- امسح الملقط حتى يجف بمناديل معملية نظيفة يمكن التخلص منها.
ملاحظة: التنظيف الدقيق للملقط ضروري لتجنب التلوث المتبادل بين العينات. - عند جمع عينة جديدة ، تخلص من قفازات النتريل المستخدمة واستبدلها بزوج نظيف.
- في دفتر ملاحظات ميداني مقاوم للعوامل الجوية ، استخدم قلم رصاص أو قلما مناسبا لجميع الأحوال الجوية لتسجيل ملصق الهوية الفريد المخصص من أنبوب الطرد المركزي الدقيق جنبا إلى جنب مع نوع العينة (على سبيل المثال ، البيض ، اليرقات exuviae ، أو الساق) ، والعدد التقريبي للبيض المفرخ ، ومعلومات المجموعة مثل اسم (أسماء) المجمع ، والتاريخ ، والموقع ، وأنواع النباتات المضيفة ، وأي ملاحظات إضافية (الشكل 2).
- ضع أنبوب الطرد المركزي الدقيق المغلق مع عينة حطام البيض مرة أخرى في صندوق تخزين أجهزة الطرد المركزي الدقيقة المكون من 64 بئرا.
- حافظ على صندوق تخزين أجهزة الطرد المركزي الدقيقة المكون من 64 بئرا في مبرد به ثلج أثناء وجودك في الميدان.
- الحفاظ على جميع مستلزمات التجميع الأخرى في صندوق معالجة التجميع أثناء وجودك في الميدان للتخزين والنقل الآمن والموحد بين المواقع.
4. عند اكتمال الجمع الميداني
- تأكد من أن جميع أنابيب الطرد المركزي الدقيقة التي تحتوي على عينات موجودة في صندوق تخزين أجهزة الطرد المركزي الدقيقة المكون من 64 بئرا في مبرد به ثلج للنقل.
- ضع جميع مستلزمات التجميع الميدانية مرة أخرى في صندوق معالجة المجموعة.
- انقل جميع العينات مرة أخرى إلى المكتب أو المختبر وتحقق جيدا من كل أنبوب طرد مركزي دقيق للتأكد من أن جميع مواد العينة مغمورة بالكامل في مخزن التحلل.
- ضع صندوق تخزين أجهزة الطرد المركزي الدقيقة المكون من 64 بئرا مع عينات في الفريزر حتى الشحن أو المعالجة.
ملاحظة: متوسط المجمد التجاري -18 درجة مئوية مقبول للتخزين على المدى القصير. - قم بتقييم جميع المستلزمات بعناية في صندوق أدوات التجميع واستبدل أي منها حسب الحاجة.
ملاحظة: هذا مهم بشكل خاص إذا تم جدولة أحداث جمع ميداني متعددة. - قم بتخزين صندوق معالجة المجموعة في مكان آمن حتى حدث الجمع الميداني التالي.
- قم بتنزيل جميع الصور الرقمية وتأكد من نسخها احتياطيا بشكل آمن على خادم أو نظام تخزين قائم على السحابة.
- قم بمسح أو تصوير صفحات الطقس الأصلية أو صفحات دفتر الملاحظات الميدانية أو أوراق البيانات الميدانية التي تحتوي على بيانات المجموعة حتى يمكن إدخال جميع المعلومات في جدول بيانات أو قاعدة بيانات مشروع.
5. تقديم العينات والبيانات
- قم بإزالة جميع صناديق تخزين أجهزة الطرد المركزي الدقيقة ذات 64 بئرا مع عينات من الفريزر.
- قم بتعبئة صناديق تخزين أجهزة الطرد المركزي الدقيقة المكونة من 64 بئرا بعناية مع عينات ودفتر الملاحظات الميداني أو أوراق البيانات الميدانية في صندوق شحن قياسي ، وأرفق ملصق الشحن المقدم برقم حساب المرسل الأصلي ، وأرسله عبر التسليم السريع المضمون من قبل الناقل ، بين عشية وضحاها ، في اليوم التالي إلى مدير المشروع.
- أرسل رقم تتبع الحزمة بالبريد الإلكتروني ونسخة من صفحات دفتر الملاحظات الممسوحة ضوئيا أو أوراق البيانات الميدانية إلى مدير المشروع.
6. استخراج الحمض النووي
- بمجرد استلام صناديق تخزين أجهزة الطرد المركزي الدقيقة المكونة من 64 بئرا ، قم بتخزينها في -20 درجة مئوية للحفاظ على الحمض النووي في العينات حتى تصبح جاهزة لاستخراج الحمض النووي.
- في المختبر ، استخرج الحمض النووي عن طريق طحن أنسجة الحشرات المخزنة في محلول التحلل بعد الذوبان من -20 درجة مئوية. أضف 20 ميكرولتر من Proteinase K واترك العينة تنقع طوال الليل عند 56 درجة مئوية في حاضنة ساخنة لمدة لا تزيد عن 24 ساعة.
- أضف مخازن التنظيف والغسيل المناسبة ، وفقا لتوصية الشركة المصنعةالمحددة 13.
- انقل العينة المعلقة في المخزن المؤقت إلى عمود دوران متصل بقارورة تجميع سعة 2 مل.
- قم بالدوران لأسفل عند 6,021 × جم لمدة 60 ثانية باستخدام جهاز طرد مركزي. أضف مخازن الغسيل المناسبة وقم بتدويرها بشكل مناسب.
- حرر الحمض النووي المرتبط باستخدام المخزن المؤقت المراوغ (30 ميكرولتر) وقم بتدوير العينة في أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 مل. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
ملاحظة: انتقل إلى التسلسل إذا تجاوز تركيز الحمض النووي 0.010 نانوغرام / مل. انظر الشكل 5 لمعرفة تركيز الحمض النووي حسب نوع الأنسجة.
7. تحليل بيانات تسلسل الحمض النووي
- اقتطاع أو تحرير المكالمات الأساسية منخفضة الجودة في التسلسلات الناتجة.
- تسلسل الاستعلام مقابل قواعد البيانات العامة لتأكيد تحديد الأنواع.
- محاذاة التسلسلات مع بعضها البعض لمقارنة الاختلافات بين الأفراد.
Representative Results
تم إرسال مواد لجمع ما يصل إلى 563 عينة إلى ثمانية علماء في مجال الحفظ والمجتمع من تسع ولايات عبر نطاق الأنواع في شرق أمريكا الشمالية. تم إرسال المواد على مدار ثلاثة أشهر خلال عام 2021 قبل أوقات الذروة المحلية للطيران. حتى الآن ، تلقينا ما مجموعه 160 عينة من أنسجة C. irus التي تم جمعها (الجدول 1). تم استخراج الحمض النووي الجينومي باتباع بروتوكول لهذا النوع من العينات المفصل بواسطة Storer et al.14. من بين هذه العينات ال 160 ، تم استخراج الحمض النووي بنجاح من 88 بمتوسط تركيز 1.67 نانوغرام / ميكرولتر (SE ± 2.98) ، وكان أعلى عائد للحمض النووي 26.8 نانوغرام / ميكرولتر. تم تحديد التركيزات باستخدام مجموعة مقايسة عالية الحساسية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة مع 2 ميكرولتر من المستخلص.
في حين أن العدد الإجمالي للعينات المستلمة أقل بكثير من العدد الإجمالي الإجمالي للمواد المنشورة للجمع ، فإن هذا في الغالب قطعة أثرية لتوفير وفرة مفرطة من مواد الجمع للجامع الأساسي أو قائد الفريق لتمكينهم من الحصول على أقصى قدر من المرونة لتضمين مواقع جمع متعددة و / أو علماء المجتمع المشاركين إذا رغبت في ذلك. علاوة على ذلك ، فإن C. iris هي فئة نادرة ومتراجعة تمثلها مجموعات محدودة وغالبا ما تكون صغيرة نسبيا في جميع أنحاء نطاقها الموجود. على الرغم من هذا القيد ، فإن العدد الإجمالي لعينات الأنسجة المستلمة كبير ، خاصة مقارنة بما يمكن توقعه مع أخذ عينات أكثر تقليدية من الفراشات البالغة الفردية.
الشكل 1: وحدات فردية قابلة للنشر من جميع الإمدادات الضرورية تنتظر شحنها إلى علماء المجتمع أو غيرهم من الموظفين المسؤولين عن الجمع الميداني. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: وحدة فردية قابلة للنشر بما في ذلك جميع الإمدادات ، وصندوق معالجة جمع البلاستيك الشفاف ، وملصق الناقل السريع المكتمل في انتظار الشحن إلى علماء المجتمع أو غيرهم من الموظفين المسؤولين عن الجمع الميداني. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: صورة لبيضة فراشة قزم بلورية متجمدة (Callophrys irus) على الترمس البري (Lupinus perennis) تظهر ثقبا مميزا في المركز الذي خرجت منه يرقة حديث الولادة. لاحظ أن اللون الكلي للبيضة المفرغة أبيض. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: صورة لفراشة قزم بلوري غير مفقس (Callophrys irus) بيض على الترمس البري (Lupinus perennis). لاحظ أن البيض غير المفقس يفتقر إلى ثقب مركزي ملحوظ وأن لونه العام أخضر مزرق. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5: تركيز الحمض النووي حسب نوع الأنسجة. تمثل خطوط منتصف المربع الوسيط ، ويمتد كل مربع إلى معدل الذكاء ، وتبلغ شعيرات الصندوق 1.5 × معدل الذكاء ، مع أي نقاط خارجية تكون متطرفة. تحتوي العينات التي تحتوي على كيس بيضة واحدة على علبة بيضة واحدة فقط ، والعينات التي تحتوي على حالات بيض متعددة تحتوي على حالتين على الأقل ، مع عدد الحالات التي تتراوح من 2 إلى 20 (المتوسط = 5.3) لكل عينة. اختصار: IQR = النطاق الربيعي. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
| حالة | حالة البيض | حالات البيض | فراس | ساق | ذوبان | المجموع الكلي |
| أركانساس | 2 | 2 | ||||
| فلوريدا | 3 | 10 | 7 | 22 | 42 | |
| ميشيغان | ||||||
| نيوهامبشر | 24 | 6 | 15 | 45 | ||
| نيويورك | 30 | 30 | ||||
| أوهايو | ||||||
| ويسكونسن | 9 | 5 | 5 | 19 | ||
| أوكلاهوما | 16 | 6 | 22 | |||
| المجموع الكلي | 36 | 21 | 16 | 65 | 22 | 160 |
الجدول 1: عدد ونوع مواد الأنسجة التي تم جمعها حسب الولاية.
الشكل التكميلي S1: الصفحة الأولى من بروتوكول على الوجهين ، مغلف ، مكثف ، ومصور للاستخدام في هذا المجال. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي S2. الصفحة الخلفية لبروتوكول ذو وجهين ، مغلف ، مكثف ، مصور للاستخدام في هذا المجال. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Discussion
يصف هذا البروتوكول طريقة ميدانية لأخذ عينات غير مدمرة من الفراشات النادرة للبنية الوراثية للسكان أو تحليلات ترميز الحمض النووي. تم تصميم الفوائد الإجمالية لهذا البروتوكول خصيصا للمساعدة في تحقيق أقصى قدر من التنفيذ الواسع من قبل الأفراد من ذوي الخبرة ومستويات المهارة المختلفة مثل علماء المجتمع وممارسي الحفظ والطلاب. وتشمل هذه التكاليف الإجمالية المنخفضة نسبيا ، واللوازم والمعدات التي يسهل الحصول عليها ، وطريقة مباشرة ويمكن الوصول إليها دون العديد من الخطوات المعقدة للغاية ، وسهولة النشر على منطقة جغرافية واسعة. بالإضافة إلى ذلك ، يستهدف المواد العضوية المتبقية التي تلغي الحاجة إلى التقاط أو معالجة مؤقتا ، وفي هذه العملية ، يحتمل أن تضر الكائنات الحية للحصول على عينات جينية. علاوة على ذلك ، فإنه يمدد الفترة المحتملة المتاحة لجمع العينات إلى ما بعد الفينولوجيا التقليدية أو عمر مرحلة حياة معينة ، مما يعزز المرونة وفرصة الجمع الشاملة للمساعدة في زيادة أعداد العينات.
في حين أن التصنيف المحوري لهذا الجهد كان فراشة العفريت المتجمدة ، وهي متخصصة في الموائل على نطاق واسع ولكنها آخذة في الانخفاض ، يمكن تطبيق هذا البروتوكول على نطاق أوسع على العديد من الحشرات الأخرى ، بما في ذلك تلك التي تهم الحفظ. وبالمثل، في حين أن البروتوكول يستهدف جمع البيض المفرخ كمصدر للمواد الوراثية، فإنه يمكن تكييفه بسهولة مع عينات أخرى يحتمل أن تكون أكثر تقليدية (على سبيل المثال، الساقين، وشظايا الجناح، ومشابك الهوائيات) أو حتى الكائنات الحية بأكملها. ومع ذلك ، فإن هذا الجانب هو أيضا قيد محتمل للبروتوكول. على الرغم من أن الغالبية العظمى من الخطوات مصممة لتكون بسيطة نسبيا وسريعة الإنجاز ، إلا أن البحث الشامل عن بقع من النباتات المضيفة لليرقات بحثا عن بيض الفقس ، والذي يبلغ قطره عادة <1.0 مم ، يتطلب وقتا طويلا وعمالة كثيفة. ومع ذلك ، فإن نشاط أخذ العينات المكثف هذا مثالي بشكل خاص لشبكة أكبر من المشاركين مثل علماء المجتمع.
وكما هو الحال مع المشاريع الميدانية الأخرى، فإن الإعداد الدقيق أمر ضروري. ويشمل ذلك إجراء جرد كامل للإمدادات اللازمة لضمان عدم فقدان أي مواد ، واكتمال أي أعمال تحضير مطلوبة ، وتنظيمها جيدا وتعبئتها بشكل آمن وجاهزة للنشر الميداني. بالإضافة إلى ذلك ، يجب على جميع الموظفين الميدانيين ، وخاصة أولئك الذين يقومون بجمع الأنسجة ، مراجعة بروتوكول الجمع بالتفصيل قبل أي حدث جمع ومعالجة أي أسئلة للأفراد الذين يشرفون على المشروع. بمجرد الوصول إلى الميدان ، يتطلب جزء جمع العينات من البروتوكول اهتماما دقيقا بالتفاصيل. يتضمن ذلك تحديد موقع أي بويضات وفحصها بعناية للتأكد من أنها تفقس وبالتالي مناسبة للتجميع ، وتنظيف الملقط تماما ، واستبدال القفازات للمساعدة في تقليل ترحيل الأنسجة بين أحداث أخذ العينات ، وضمان غمر عينات الأنسجة بالكامل في محلول التحلل داخل كل أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل. أخيرا ، يعد تسجيل البيانات الدقيقة والمفصلة أمرا ضروريا ، والذي يتضمن ربط ملصق الهوية الفريد المخصص من أنبوب الطرد المركزي الدقيق جنبا إلى جنب مع العينة المحددة المأخوذة وجميع معلومات الجمع الأخرى ذات الصلة. في حين أن هذه الخطوة روتينية في البحث العلمي ، إلا أنها غالبا ما تحتاج إلى توضيح شامل وتعزيزها لجمهور العلوم المجتمعية.
هنا ، نوضح إمكانية الاستفادة من علماء المجتمع لجمع العينات غير القاتلة من الأنواع الصغيرة والنادرة والمهددة. ومع ذلك ، هناك بعض القيود المحتملة التي يجب وضعها في الاعتبار عند تحليل أي بيانات جينية ناتجة. على سبيل المثال ، في حين أن تجميع العينات من رقعة واحدة يزيد من فرص استعادة ما يكفي من الحمض النووي للكشف ، فإنه من المحتمل أيضا أن يؤدي إلى تغاير الزيجوت. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأن البروتوكول يتضمن جمع المشيمة من البويضات المفرغة ، يمكن أخذ عينات فقط من الفراشات الإناث ، التي تمثل الحمض النووي الأبوي ، داخل مجموعة سكانية. ومع ذلك ، نظرا لعدم توفر بيانات وراثية سابقة على مستوى السكان ل C. irus ، فإن الأفكار الناتجة المكتسبة يمكن أن تفيد فقط الحفاظ على الأنواع وإدارتها. على سبيل المثال ، في حين أن تصميم دراسة شامل ومفصل واختيار علامة دقيق سيكون مطلوبا لتقييم هيكل السكان بشكل كاف ، يمكن استخدام بروتوكول أخذ العينات المبين هنا واستخدام الترميز الشريطي للحمض النووي للوحدة الفرعية 1 (CO1) للسيتوكروم ج أوكسيديز للكشف عن حدوث أصناف نادرة أو معرضة للخطر. مناقشة إضافية حول فائدة وتطبيق تسلسل الحمض النووي من أخذ العينات غير القاتلة الموصوفة هنا مفصلة بواسطة Storer et. al.14.
بالإضافة إلى الهدف الأساسي المتمثل في جمع العينات للتحليل الجيني ، يؤكد البروتوكول أيضا على أن المشاركين يلتقطون صورا رقمية مفصلة لجميع المواقع الميدانية ، ومواقع الجمع ، والنباتات المضيفة لليرقات الموجودة ، وأي عناصر أخرى من الموائل المحيطة قد تكون ذات صلة. تساعد هذه الوثائق في توفير تقييم عام للموائل مفيد لتوضيح ظروف الموقع الحالية مثل فينولوجيا النبات وكثافة موارد المضيف وتاريخ الإدارة (على سبيل المثال ، الحريق الموصوف حديثا). وهذه المعلومات مفيدة بوجه خاص للمشاريع التي تؤخذ فيها عينات ميدانية على مدى فترة زمنية أوسع للتمكين من إجراء مقارنات بيئية أكثر تفصيلا.
أخيرا ، مع استمرار تسارع انخفاض الحشرات العالمية ، هناك حاجة ماسة إلى جهود موسعة لتقييم الأنواع ورصدها15,16. إن استخدام المشاركة التشاركية على نطاق أوسع من علماء المجتمع والطلاب (على سبيل المثال ، المتدربين والزملاء في خدمة الأسماك والحياة البرية الأمريكية) وممارسي الحفظ يوفر خيارات قابلة للتطبيق بشكل متزايد لجمع البيانات على نطاق واسع من أنواع عديدة ، بما في ذلك عينات الحمض النووي. وفقا لذلك ، فإن البيانات الناتجة عن هذا البروتوكول لها العديد من الاستخدامات الممكنة. وتشمل هذه المساعدة في إبلاغ إجراءات الحفظ (على سبيل المثال ، التخطيط والاستعادة والإدارة) ، وقرارات الإدراج أو تقييمات حالة الأنواع ، والبحوث البيئية والسكانية والتصنيفية.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
Acknowledgments
يود المؤلفون أن يشكروا ديفيد كوثريل ، وأماندا ديلون ، وستيف فولر ، ونيل جيفورد ، وهايدي هولمان ، ودين جو ، وسالي جو ، ودانيال كينيدي ، وجينيفيف كوزاك ، وريبيكا لونجينيكر ، ومورين ماكلونج ، ومات موران ، وروبن نيفر ، وبريندا سميث ، وهانتر تروبريدج ، وجيسوب ويشلت للمساعدة في جوانب مختلفة من المشروع ، بما في ذلك الخدمات اللوجستية والتنسيق والتصاريح و / أو جمع العينات. تم تمويل هذا البحث من خلال منحة من خدمة الأسماك والحياة البرية الأمريكية (رقم تعريف الجائزة الفيدرالية F20AC00356) التي يديرها معهد إدارة الحياة البرية (منحة SA 2021-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 quart Igloo Playmate Cooler | Amazon | NA | portable cooler Amount per deployable unit: 1 cooler |
| 250 DNeasy Mini Spin Columns, Proteinase K, Buffers, Collection Tubes (2 mL) | Qiagen | 69506 | Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit Amount per deployable unit: NA |
| Andwin Scientific Supplier Diversity Partner LAB MARKERS BLACK | FisherSci | NC9280166 | ethanol proof lab marker Amount per deployable unit: 2 markers |
| Cardboard shipping box | shipping box Amount per deployable unit: as needed |
||
| Eisco Polyethylene Wash Bottles, LDPE | FisherSci | S14091 | lab grade spray or squirt bottle (for ethanol or alcohol) Amount per deployable unit: 1 bottle |
| FedEx U.S. express airbill | FedEx | NA | shipping return label Amount per deployable unit: 2 labels |
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | FisherSci | NC9386261 | sterile 1.5 mL microcentrifuge tubes Amount per deployable unit: 128 tubes |
| Forceps, #4a, very fine yet extra strong tips (33 mm), 4-3/8" (111 mm) long | Bioquip | 4523 | straight tip forceps Amount per deployable unit: 2 straight forceps |
| Forceps, #7, curved tips (13 mm), very fine points, 4-1/2" (114 mm) long | Bioquip | 4527 | curved tip forceps Amount per deployable unit: 2 curved forceps |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply | FisherSci | 06-666A | kimwipes (or other sterile wipe) Amount per deployable unit: 1 box |
| Laminated Illustrated field collection protocol | NA | NA | abbreviated protocol Amount per deployable unit: 1 protocol |
| Laminated list of materials | NA | NA | supply list Amount per deployable unit: 1 list |
| Lily Sugar 'N Cream The Original Solid Yarn, 2.5 oz, Medium 4 Gauge, 100% Cotton - Hot Pink - Machine Wash & Dry | Amazon | NA | pink yarn (to secure to forceps for visibility) Amount per deployable unit: 2 yards |
| Loupe by Bausch & Lomb, 10x Coddington Magnifier | Amazon | NA | hand lens Amount per deployable unit: 2 hand lenses |
| MyGift Clear Plastic 2-Tier Trays Craft Supply Storage Box/First Aid Carrying Case w/Top Handle & Latch Lock | Amazon | NA | supply storage box Amount per deployable unit: 1 box |
| Nitrile, Disposable Gloves, L, Powder-Free, 2.8 mil Palm Thickness | Grainger | 60NU14 | nitrile lab gloves (large) Amount per deployable unit: 1 box |
| Nitrile, Disposable Gloves, M, Powder-Free, 2.8 mil Palm Thickness | Grainger | 60NU13 | nitrile lab gloves (medium) Amount per deployable unit: 1 box |
| Qiagen, Inc. BUFFER ATL (200 ML) | Qiagen | 19076 | Qiagen ATL lysis buffer Amount per deployable unit: 180 µl/tube; 128 tubes |
| Rite In The Rain Weatherproof Side Spiral Notebook, Yellow Cover, Universal Page Pattern (No. 373-MX), 11 x 8.75 x 0.5 | Amazon | NA | weatherproof field notebook Amount per deployable unit: 1 notebook |
| Showgard Professional Stamp Tongs 6" 904 Round Tip Tweezers | Amazon | NA | 6" spade tip forceps Amount per deployable unit: 2 long spade forceps |
| Texwipe PolySat Pre-Wetted Wipers | FisherSci | 18-366-231 | alcohol wipes Amount per deployable unit: 100 wipes |
| Thermo Scientific CryoBoxes | FisherSci | 12-565-227 | 64 well microcentrifuge tubes collection/storage boxes Amount per deployable unit: 2 boxes |
| packing material Amount per deployable unit: as needed |
References
- Donald, H. M., Wood, C. W., Benowitz, K. M., Johnson, R. A., Drodie, E. D. Nondestructive sampling of insect DNA from defensive secretion. Molecular Ecology Resources. 12 (5), 856-860 (2012).
- Feinstein, J. DNA sequence from butterfly frass and exuviae. Conservation Genetics. 5 (1), 103-104 (2004).
- Hamm, C. A., Aggarwal, D., Landis, D. A. Evaluating the impact of non-lethal DNA sampling on two butterflies, Vanessa cardui and Satyrodes Eurydice. Journal of Insect Conservation. 14, 11-18 (2010).
- Holehouse, K. A., Hammond, R. L., Bourke, A. F. G. Non-lethal sampling of DNA from bumblebees for conservation genetics. Insectes Sociaux. 50 (3), 277-285 (2003).
- Lushai, G., et al. Application of molecular techniques to non-lethal tissue samples of endangered butterfly population (Parnassius apollo L.) in Norway for conservation management. Biological Conservation. 94 (1), 43-50 (2000).
- Monroe, E. M., Lynch, C., Soluk, D. A., Britten, H. B. Nonlethal tissue sampling techniques and microsatellite markers used for first report of genetic diversity in two populations of the endangered Somatochlora hineana (Odonata: Corduliidae). Annals of the Entomological Society of America. 103 (6), 1012-1017 (2010).
- Oi, C. A., López-Uribe, M. M., Cervini, M., Del Lama, M. A. Non-lethal method of DNA sampling in euglossine bees supported by mark-recapture experiments and microsatellite genotyping. Journal of Insect Conservation. 17 (5), 1071-1079 (2013).
- Scriven, J. J., Woodall, L. C., Goulson, D. Nondestructive DNA sampling from bumblebee feces. Molecular Ecology Resources. 13 (2), 225-229 (2013).
- Watts, P. C., Thompson, D. J., Daguet, C., Kemp, S. J. Exuviae as a reliable source of DNA for population-genetic analysis of odonates. Odonatologica. 34 (2), 183-187 (2005).
- Andrews, K., et al. All hands on deck: local ecological knowledge and expert volunteers contribute to the first delisting of a marine fish species under the Endangered Species Act. Citizen Science: Theory and Practice. 4 (1), 37 (2019).
- Buxton, A., Groombridge, J., Griffiths, G. Comparison of two citizen scientist methods for collecting pond water samples for environmental DNA studies. Citizen Science: Theory and Practice. 3 (2), 2 (2018).
- Granroth-Wilding, H., et al. Non-invasive genetic monitoring involving citizen science enables reconstruction of current pack dynamics in a re-establishing wolf population. BMC Ecology. 17 (1), 44 (2017).
- Qiagen, DNeasy Blood & Tissue Kit Quick Start Protocol. , Available from: https://www.qiagen.com/us/resources/download.aspx?id=63e22fd7-6eed-4bcb-8097-7ec77bcd4de6&lang=en (2016).
- Storer, C., Daniels, J., Xiao, L., Rossetti, K. Using noninvasive genetic sampling to survey rare butterfly populations. Insects. 10 (10), 311 (2019).
- Wagner, D. L., et al. Insect decline in the Anthropocene: Death by a thousand cuts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (2), 20239891 (2021).
- Montgomery, G. A., et al. Is the insect apocalypse upon us? How to find out. Biological Conservation. 241, 108327 (2020).
