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Biologia

Un metodo passo-passo per rilevare gli anticorpi neutralizzanti contro l'AAV utilizzando un test colorimetrico basato su cellule

Published: December 07, 2021
doi:
10.3791/63419
, , , , ,
1Baker Heart and Diabetes Institute, 2Department of Physiology, Anatomy and Microbiology,La Trobe University, 3Florey Institute of Neuroscience and Mental Health,University of Melbourne, 4Department of Physiology, Centre for Muscle Research (CMR),The University of Melbourne, 5Department of Diabetes, Central Clinical School,Monash University, 6Baker Department of Cardiometabolic Health,The University of Melbourne, 7Department of Physiology and Department of Medicine Alfred Hospital,Monash University

Summary

Un protocollo di laboratorio completo e un flusso di lavoro di analisi sono descritti per un test colorimetrico basato su cellule rapido, economico e semplice per rilevare elementi neutralizzanti rispetto ad AAV6.

Abstract

I virus adeno-associati ricombinanti (rAAV) hanno dimostrato di essere un vettore sicuro e di successo per il trasferimento di materiale genetico per il trattamento di varie condizioni di salute sia in laboratorio che in clinica. Tuttavia, gli anticorpi neutralizzanti preesistenti (NAbs) contro i capsidi AAV rappresentano una sfida continua per la somministrazione di successo delle terapie geniche sia in modelli sperimentali su grandi animali che in popolazioni umane. Lo screening preliminare per l’immunità dell’ospite contro l’AAV è necessario per garantire l’efficacia delle terapie geniche basate su AAV sia come strumento di ricerca che come agente terapeutico clinicamente valido. Questo protocollo descrive un test colorimetrico in vitro per rilevare fattori neutralizzanti contro il sierotipo 6 AAV (AAV6). Il test utilizza la reazione tra un AAV che codifica per un gene reporter della fosfatasi alcalina (AP) e il suo substrato NBT / BCIP, che genera una macchia viola quantificabile insolubile sulla combinazione.

In questo protocollo, i campioni di siero sono combinati con un AP che esprime AAV e incubati per consentire il verificarsi di una potenziale attività neutralizzante. La miscela di siero virale viene successivamente aggiunta alle cellule per consentire la trasduzione virale di eventuali AAV che non sono stati neutralizzati. Il substrato NBT/BCIP viene aggiunto e subisce una reazione cromogenica, corrispondente alla trasduzione virale e all’attività neutralizzante. La proporzione di area colorata viene quantificata utilizzando uno strumento software libero per generare titoli neutralizzanti. Questo test mostra una forte correlazione positiva tra colorazione e concentrazione virale. La valutazione di campioni di siero di pecora prima e dopo la somministrazione di un AAV6 ricombinante ha portato ad un drammatico aumento dell’attività neutralizzante (da 125 a >10.000 volte). Il test ha mostrato un’adeguata sensibilità per rilevare l’attività neutralizzante in >1:32.000 diluizioni sieriche. Questo test fornisce un metodo semplice, rapido ed economico per rilevare nAbs contro AAV.

Introduction

I virus adeno-associati (AAV) sono sempre più utilizzati come vettori per la somministrazione di terapie geniche a trattamenti sperimentali per varie condizioni di salute che hanno un impatto sul sistema cardiovascolare, polmonare, circolatorio, oculare e nervoso centrale1,2,3,4,5. La popolarità dei vettori AAV come piattaforma leader nella terapia genica deriva dal loro profilo di sicurezza positivo, dall’espressione transgenica a lungo termine e dai trofismi tessuto-specifici ad ampio raggio1,6. I risultati positivi negli studi sugli animali hanno spianato la strada a oltre cinquanta studi clinici di terapia genica AAV che hanno raggiunto con successo i loro endpoint di efficacia7, nonché al rilascio del primo farmaco per la terapia genica AAV disponibile in commercio approvato dalla Food and Drug Administration degli Stati Uniti8. Dopo i successi iniziali, AAV ha continuato a guadagnare terreno nei settori della ricerca di base e clinica come vettore di scelta ed è attualmente l’unica terapia genica in vivo approvata per uso clinico negli Stati Uniti e in Europa9. Tuttavia, la presenza di anticorpi neutralizzanti preesistenti (NAbs) contro i capsidi vettori AAV rimane un ostacolo sia alla ricerca preclinica che all’efficacia degli studi clinici. I NAb sono presenti sia in popolazioni naïve umane che animali e inibiscono la trasduzione genica a seguito della somministrazione in vivo di un vettore AAV1. La sieropositività AAV è un criterio di esclusione per la maggior parte degli studi di terapia genica e pertanto lo screening preliminare per l’immunità dell’ospite è cruciale sia in laboratorio che in clinica. Stabilire un test in grado di rilevare la presenza di NAbs contro AAV è un passo essenziale nella pipeline di qualsiasi progetto di ricerca basato sulla terapia genica AAV. Questo rapporto si concentra su AAV6 che è stato di interesse per i ricercatori grazie alla sua trasduzione efficiente e selettiva nel muscolo striato (cuore e muscolo scheletrico)1,10,11,12. La terapia genica è considerata una strategia promettente per il targeting del cuore perché è difficile indirizzare specificamente il cuore senza procedure invasive a cuore aperto.

L’attività neutralizzante viene solitamente determinata utilizzando un test di inibizione della trasduzione in vitro o in vivo basato su cellule. In vivo I saggi NAb di solito comportano la somministrazione di siero da un soggetto del test (ad esempio, umano o animale di grandi dimensioni) nei topi, seguito da un AAV con un gene reporter, seguito da test per l’espressione del gene reporter o dell’antigene corrispondente. I saggi in vitro determinano i titoli di NAb incubando siero o plasma da un essere umano o da un grande animale in diluizioni seriali con un AAV ricombinante (rAAV) che esprime un gene reporter. Le cellule sono infettate dalla miscela siero/virus e la misura in cui l’espressione genica reporter è inibita viene valutata rispetto ai controlli. I saggi in vitro sono ampiamente utilizzati per lo screening NAb a causa del loro costo relativamente inferiore, della rapidità nei test e della maggiore capacità di standardizzazione e convalida13,14 rispetto ai saggi in vivo. I saggi in vivo sono spesso segnalati per avere una maggiore sensibilità15,16, ma la stessa affermazione è stata fatta per quanto riguarda i saggi di vitro14,17.

Ad oggi, i saggi NAb in vitro hanno utilizzato principalmente la luminescenza (luciferasi) come gene reporter per rilevare la neutralizzazione. Sebbene un metodo basato sulla luce abbia meriti in molti contesti, un test NAb colorimetrico / cromogenico può essere vantaggioso in alcune circostanze. Saggi colorimetrici per valutare la neutralizzazione sono stati impiegati con successo per altri virus come l’influenza e l’adenovirus18,19. La loro attrattiva deriva dalla loro semplicità, dal costo inferiore e dalla necessità di utilizzare solo apparecchiature e strumenti di laboratorio di uso quotidiano20. I saggi NAb che utilizzano un gene reporter basato sulla luminescenza richiedono costosi kit di substrato, un luminometro e un software corrispondente per l’analisi21. Questo test colorimetrico ha il vantaggio di richiedere solo un microscopio ottico e un substrato molto economico. La segnalazione della sensibilità dei saggi colorimetrici rispetto a quelli luminescenti ha prodotto risultati contrastanti. Uno studio ha suggerito che i saggi ELISA basati sulla luminescenza mostrano una maggiore sensibilità e una riproducibilità comparabile ai saggi colorimetrici22, mentre un altro ha scoperto che i saggi ELISA basati sulla colorimetria conferiscono una maggiore sensibilità23. Qui, viene fornito un protocollo dettagliato per un test NAb in vitro contro AAV che utilizza la reazione cromogenica tra un AAV che codifica per un gene reporter della fosfatasi alcalina (AP) e un substrato nitro blu tetrazolio /5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (NBT / BCIP). Questo protocollo passo-passo è stato sviluppato sulla base di un precedente rapporto che utilizzava un gene reporter hPLAP (fosfatasi alcalina placentare umana) (AAV6-hPLAP) per rilevare l’attività neutralizzante contro AAV24. Questo test è conveniente, efficiente in termini di tempo, facile da configurare e richiede competenze tecniche minime, attrezzature di laboratorio e reagenti. Inoltre, la semplicità di questo test gli conferisce il potenziale per essere ottimizzato per ampie applicazioni su diversi tipi di cellule, tessuti o sierotipi virali.

Protocol

Tutti gli aspetti della cura e della sperimentazione degli animali sono stati condotti seguendo le linee guida del Florey Institute of Neuroscience and Mental Health e il Codice australiano per la cura e l’uso degli animali a fini scientifici seguendo Reference25. Per lo studio sono state utilizzate pecore Merino di 1,5-3 anni. Una panoramica schematica del protocollo di analisi è fornita nella Figura 1. <i…

Representative Results

Saggio di trasduzione per stabilire il dosaggio virale ottimale per la copertura delle piastreLe cellule HT1080, una linea di cellule di fibrosarcoma ben consolidata, sono state selezionate per questo test. Una concentrazione di 1 x 104 cellule HT1080 / pozzo ha fornito ~ 50% di confluenza cellulare in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Per determinare la concentrazione virale ottimale per il test, un rAAV che codifica per un gene reporter hPLAP (fosfatasi alcalina placentare u…

Discussion

Questo rapporto descrive un saggio colorimetrico che valuta l’entità della neutralizzazione AAV in un dato campione di siero valutando una reazione cromogenica corrispondente al grado di trasduzione virale in vitro. Lo sviluppo del protocollo si è basato sulla nota reazione cromogenica tra l’enzima fosfatasi alcalina e NBT/BCIP, che è stato ampiamente utilizzato come strumento di colorazione per la rilevazione di bersagli proteici in applicazioni come l’immunoistochimica e come strumento reporter per la valut…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo studio è stato finanziato da un National Health and Medical Research Council Project Grant a JRM e CJT (ID 1163732) e in parte dal programma di supporto alle infrastrutture operative del governo vittoriano. SB è supportato da una borsa di studio congiunta Baker Heart and Diabetes Institute-La Trobe University Doctoral. KLW è supportato da The Shine On Foundation e da una Future Leader Fellowship della National Heart Foundation of Australia (ID 102539). JRM è supportato da una borsa di ricerca senior del National Health and Medical Research Council (ID 1078985).

Materials

0.05% Trypsin/EDTA Gibco 25300-054
50 mL conical centrifuge tube Falcon 14-432-22 Or equivalent
75 cm2 square flasks Falcon 353136 Or equivalent
96 well flat bottomed plate Falcon 353072
AAV6-CMV-hPLAP Vector Muscle Research & Therapeutics Lab (University of Melbourne, Australia) AAV6-CMV-hPLAP can be provided upon request.
Aluminium foil
Anti-AAV6 (intact particle) mouse monoclonal antibody, (ADK6) PROGEN 610159 Positive control monoclonal antibody
BCIP/NBT SIGMAFAST B5655
Cell and tissue culture safety cabinet
Electronic Pipette 5 & 10 mL stripette inserts
Fetal Bovine Serum Gibco 10099-141
Haemocytometer
High glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11965118
HT1080 cells ATCC
ImageJ Software Freely available: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Incubator 37 °C, 5% CO2
Light microscope with camera Capable of taking photos with a 4x objective lens
Oven For a 65 °C incubation
Paraformaldehyde MERCK 30525-89-4
Penicillin Streptomycin Gibco 15140-122
Phosphate buffered saline
Pipettes and tips 20 μL, 200 μL & 1 mL single pipettes and tips & 200 μL multichannel pipette
Stericup quick release filter Millipore S2GPU10RE Used for combining media reagents
Trypan blue solution Sigma-Aldrich T8154
VACUETTE TUBE 8 ml CAT Serum Separator Clot Activator Greiner BIO-ONE 455071 Used for serum collection & processing from sheep
Water bath
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Riferimenti

  1. Bass-Stringer, S., et al. Adeno-associated virus gene therapy: Translational progress and future prospects in the treatment of heart failure. Heart, Lung and Circulation. 27 (11), 1285-1300 (2018).
  2. Casey, G. A., Papp, K. M., MacDonald, I. M. Ocular gene therapy with adeno-associated virus vectors: current outlook for patients and researchers. Journal of Ophthalmic and Vision Research. 15 (3), 396-399 (2020).
  3. Lykken, E. A., Shyng, C., Edwards, R. J., Rozenberg, A., Gray, S. J. Recent progress and considerations for AAV gene therapies targeting the central nervous system. Journal of Neurodevelopmental Disorders. 10 (1), 16 (2018).
  4. Guggino, W. B., Cebotaru, L. Adeno-Associated Virus (AAV) gene therapy for cystic fibrosis: Current barriers and recent developments. Expert Opinion on Biological Therapy. 17 (10), 1265-1273 (2017).
  5. Perrin, G. Q., Herzog, R. W., Markusic, D. M. Update on clinical gene therapy for hemophilia. Blood. 133 (5), 407-414 (2019).
  6. Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
  7. Kuzmin, D. A., et al. The clinical landscape for AAV gene therapies. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (3), 173-174 (2021).
  8. Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: A randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. Lancet. 390 (10097), 849-860 (2017).
  9. Weber, T. Anti-AAV Antibodies in AAV gene therapy: Current challenges and possible solutions. Frontiers in Immunology. 12, 658399 (2021).
  10. Weeks, K. L., et al. Phosphoinositide 3-kinase p110alpha is a master regulator of exercise-induced cardioprotection and PI3K gene therapy rescues cardiac dysfunction. Circulation: Heart Failure. 5 (4), 523-534 (2012).
  11. Gregorevic, P., et al. Systemic delivery of genes to striated muscles using adeno-associated viral vectors. Nature Medicine. 10 (8), 828-834 (2004).
  12. Bernardo, B. C., et al. Gene delivery of medium chain acyl-coenzyme A dehydrogenase induces physiological cardiac hypertrophy and protects against pathological remodelling. Clinical Science (London). 132 (3), 381-397 (2018).
  13. Meliani, A., et al. Determination of anti-adeno-associated virus vector neutralizing antibody titer with an in vitro reporter system. Human Gene Therapy Methods. 26 (2), 45-53 (2015).
  14. Falese, L., et al. Strategy to detect pre-existing immunity to AAV gene therapy. Gene Therapy. 24 (12), 768-778 (2017).
  15. Wang, D., et al. Adeno-Associated virus neutralizing antibodies in large animals and their impact on brain intraparenchymal gene transfer. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 11, 65-72 (2018).
  16. Wang, M., et al. Prediction of adeno-associated virus neutralizing antibody activity for clinical application. Gene Therapy. 22 (12), 984-992 (2015).
  17. Kruzik, A., et al. Detection of biologically relevant low-titer neutralizing antibodies against adeno-associated virus require sensitive in vitro assays. Human Gene Therapy Methods. 30 (2), 35-43 (2019).
  18. Lehtoranta, L., Villberg, A., Santanen, R., Ziegler, T. A novel, colorimetric neutralization assay for measuring antibodies to influenza viruses. Journal of Virological Methods. 159 (2), 271-276 (2009).
  19. Johnston, P. B., Grayston, J. T., Loosli, C. G. Adenovirus neutralizing antibody determination by colorimetric assay. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 94 (2), 338-343 (1957).
  20. Xiaoli Zhu, T. G. . Nano-Inspired Biosensors for Protein Assay with Clinical Applications. , 237-264 (2019).
  21. Jungmann, A., Muller, O., Rapti, K. Cell-based measurement of neutralizing antibodies against adeno-associated virus (AAV). Methods in Molecular Biology. 1521, 109-126 (2017).
  22. Samineni, S., et al. Optimization, comparison, and application of colorimetric vs. chemiluminescence based indirect sandwich ELISA for measurement of human IL-23. Journal of Immunoassay and Immunochemistry. 27 (2), 183-193 (2006).
  23. Siddiqui, J., Remick, D. G. Improved sensitivity of colorimetric compared to chemiluminescence ELISAs for cytokine assays. Journal of Immunoassay and Immunochemistry. 24 (3), 273-283 (2003).
  24. Arnett, A. L., Garikipati, D., Wang, Z., Tapscott, S., Chamberlain, J. S. Immune responses to rAAV6: The Influence of canine parvovirus vaccination and neonatal administration of viral vector. Frontiers in Microbiology. 2, 220 (2011).
  25. Australian code for the care and use of animals for scientific purposes. National Health and Medical Research Council Available from: https://www.nhmrc.gov.au/about-us/publications/australian-code-care-and-use-animals-scientific-purposes (2013)
  26. Coecke, S., et al. Guidance on good cell culture practice. A report of the second ECVAM task force on good cell culture practice. Alternatives to Laboratory Animals. 33 (3), 261-287 (2005).
  27. Journal of Visualized Experiments. General Laboratory Techniques. Journal of Visualized Experiments Database. , (2018).
  28. AAV-HT1080 Cells. Stratagene Available from: https://www.chem-agilent.com/pdf/strata/240109.pdf (2003)
  29. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111 (3), 1-3 (2015).
  30. Bieber, S., et al. Extracorporeal delivery of rAAV with metabolic exchange and oxygenation. Scientific Reports. 3, 1538 (2013).
  31. Winbanks, C. E., Beyer, C., Qian, H., Gregorevic, P. Transduction of skeletal muscles with common reporter genes can promote muscle fiber degeneration and inflammation. PLoS One. 7 (12), 51627 (2012).
  32. Thomas, C. J., et al. Evidence that the MEK/ERK but not the PI3K/Akt pathway is required for protection from myocardial ischemia-reperfusion injury by 3′,4′-dihydroxyflavonol. European Journal of Pharmacology. 758, 53-59 (2015).
  33. Barger, A., et al. Use of alkaline phosphatase staining to differentiate canine osteosarcoma from other vimentin-positive tumors. Veterinary Pathology. 42 (2), 161-165 (2005).
  34. Gregorevic, P., et al. Evaluation of vascular delivery methodologies to enhance rAAV6-mediated gene transfer to canine striated musculature. Molecular Therapy. 17 (8), 1427-1433 (2009).
  35. Sharma, A., Ghosh, A., Hansen, E. T., Newman, J. M., Mohan, R. R. Transduction efficiency of AAV 2/6, 2/8 and 2/9 vectors for delivering genes in human corneal fibroblasts. Brain Research Bulletin. 81 (2-3), 273-278 (2010).
  36. Smejkal, G. B., Kaul, C. A. Stability of nitroblue tetrazolium-based alkaline phosphatase substrates. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 49 (9), 1189-1190 (2001).
  37. Falese, L., et al. Strategy to detect pre-existing immunity to AAV gene therapy. Gene Therapy. 24 (12), 768-778 (2017).
  38. Orlowski, A., et al. Successful transduction with AAV Vectors after selective depletion of anti-aav antibodies by immunoadsorption. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 16, 192-203 (2020).
  39. Goossens, K., et al. Differential microRNA expression analysis in blastocysts by whole mount in situ hybridization and reverse transcription quantitative polymerase chain reaction on laser capture microdissection samples. Analytical Biochemistry. 423 (1), 93-101 (2012).
  40. Entrican, G., Wattegedera, S. R., Griffiths, D. J. Exploiting ovine immunology to improve the relevance of biomedical models. Molecular Immunology. 66 (1), 68-77 (2015).
  41. Walters, E. M., Prather, R. S. Advancing swine models for human health and diseases. Molecular Medicine. 110 (3), 212-215 (2013).
  42. Rapti, K., et al. Neutralizing antibodies against AAV serotypes 1, 2, 6, and 9 in sera of commonly used animal models. Molecular Therapy. 20 (1), 73-83 (2012).
  43. Tellez, J., et al. Characterization of naturally-occurring humoral immunity to AAV in sheep. PLoS One. 8 (9), 75142 (2013).
  44. Gupta, S., et al. Recommendations for the validation of cell-based assays used for the detection of neutralizing antibody immune responses elicited against biological therapeutics. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 55 (5), 878-888 (2011).
  45. Gupta, S., et al. Recommendations for the design, optimization, and qualification of cell-based assays used for the detection of neutralizing antibody responses elicited to biological therapeutics. Journal of Immunological Methods. 321 (1-2), 1-18 (2007).
  46. Shankar, G., et al. Recommendations for the validation of immunoassays used for detection of host antibodies against biotechnology products. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 48 (5), 1267-1281 (2008).
  47. U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration. Center for Drug Evaluation and Research (CDER). Immunogenicity Testing of Therapeutic Protein Products — Developing and Validating Assays for Anti-Drug Antibody Detection. U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration. , (2019).
  48. Baatartsogt, N., et al. A sensitive and reproducible cell-based assay via secNanoLuc to detect neutralizing antibody against adeno-associated virus vector capsid. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 22, 162-171 (2021).
  49. Watano, R., Ohmori, T., Hishikawa, S., Sakata, A., Mizukami, H. Utility of micro mini pigs for evaluating liver-mediated gene expression in the presence of neutralizing antibody against vector capsid. Gene Therapy. 27 (9), 427-434 (2020).
  50. Majowicz, A., et al. Therapeutic hFIX activity achieved after single AAV5-hFIX treatment in Hemophilia B patients and NHPs with pre-existing anti-AAV5 NABs. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 14, 27-36 (2019).

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Bass-Stringer, S., Thomas, C. J., May, C. N., Gregorevic, P., Weeks, K. L., McMullen, J. R. A Step-By-Step Method to Detect Neutralizing Antibodies Against AAV using a Colorimetric Cell-Based Assay. J. Vis. Exp. (178), e63419, doi:10.3791/63419 (2021).
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