ייצור אוטומטי בקנה מידה גדול של כדורי תאי גזע שמקורם בשומן להדפסה ביולוגית תלת-ממדית
Summary
כאן, אנו מתארים את הייצור בקנה מידה גדול של כדוריות סטרומליות/תאי גזע שמקורן בשומן (ASC) באמצעות מערכת פיפטינג אוטומטית כדי לזרוע את תרחיף התא, ובכך להבטיח הומוגניות של גודל וצורת ספרואידים. כדורי ASC אלה יכולים לשמש כאבני בניין לגישות הדפסה ביולוגית תלת-ממדית.
Abstract
תאי גזע סטרומליים/גזעיים שמקורם בשומן (ASCs) הם תת-אוכלוסייה של תאים המצויים בחלק הווסקולרי הסטרומלי של רקמת השומן התת-עורית האנושית המוכרת כמקור קלאסי לתאי סטרומל/גזע מזנכימליים. מחקרים רבים פורסמו עם ASCs עבור גישות מבוססות הנדסת רקמות מבוססות פיגומים, אשר חקרו בעיקר את התנהגותם של תאים אלה לאחר זריעתם על פיגומים ביו-אקטיביים. עם זאת, גישות נטולות פיגומים מתפתחות כדי להנדס רקמות במבחנה וב-in vivo, בעיקר על ידי שימוש בספרואידים, כדי להתגבר על המגבלות של גישות מבוססות פיגומים.
ספרואידים הם מיקרוטיסואים תלת-ממדיים הנוצרים על ידי תהליך ההרכבה העצמית. הם יכולים לחקות טוב יותר את הארכיטקטורה והמיקרו-סביבה של רקמות מקומיות, בעיקר הודות להגדלה של אינטראקציות בין תא לתא ומטריצה מחוץ לתא. לאחרונה, ספרואידים נחקרים בעיקר כמודלים למחלות, מחקרי סינון תרופות ואבני בניין להדפסה ביולוגית תלת-ממדית. עם זאת, עבור גישות הדפסה ביולוגית תלת-ממדית, כדוריואידים רבים, הומוגניים בגודלם ובצורתם, נחוצים לביו-פבריקציה של מודלים מורכבים של רקמות ואיברים. בנוסף, כאשר spheroids מיוצרים באופן אוטומטי, יש סיכוי קטן לזיהום מיקרוביולוגי, הגדלת השכפול של השיטה.
הייצור בקנה מידה גדול של ספרואידים נחשב לצעד החובה הראשון לפיתוח קו ביו-פבריקציה, הממשיך בתהליך ההדפסה הביולוגית התלת-ממדית ומסתיים בהבשלה מלאה של מבנה הרקמה בביוריאקטורים. עם זאת, מספר המחקרים שבחנו את ייצור כדוריות ה-ASC בקנה מידה גדול עדיין נדיר, יחד עם מספר המחקרים שהשתמשו בספרואידים ASC כאבני בניין להדפסה ביולוגית תלת-ממדית. לכן, מאמר זה נועד להראות את הייצור בקנה מידה גדול של כדורי ASC באמצעות טכניקת הידרוג’ל מיקרומולד שאינה דביקה המפזרת כדורי ASC כאבני בניין לגישות הדפסה ביולוגית תלת-ממדית.
Introduction
ספרואידים נחשבים לגישה נטולת פיגומים בהנדסת רקמות. ASCs מסוגלים ליצור ספרואידים על ידי תהליך ההרכבה העצמית. המיקרו-ארכיטקטורה התלת-ממדית של הספרואיד מגדילה את פוטנציאל ההתחדשות של ASCs, כולל יכולת ההתמיינות לשושלות מרובות 1,2,3. קבוצת מחקר זו עובדת עם כדוריות ASC להנדסת סחוס ורקמות עצם 4,5,6. חשוב מכך, ספרואידים נחשבים לאבני בניין בביו-פבריקציה של רקמות ואיברים, בעיקר בשל יכולת ההיתוך שלהם.
השימוש בספרואידים להיווצרות רקמות תלוי בשלוש נקודות עיקריות: (1) פיתוח שיטות רובוטיות סטנדרטיות ומדרגיות לביו-פבריקציה שלהם7, (2) פנוטיפ שיטתי של כדוריותרקמה 8, (3) פיתוח שיטות להרכבה של רקמות תלת-ממדיות9. ניתן ליצור ספרואידים אלה עם סוגי תאים שונים ולהתקבל בשיטות שונות, כולל טיפה תלויה, צבירה מחדש, מיקרופלואידיקה ומיקרומולדס 8,9,10. לכל אחת מהשיטות הללו יש יתרונות וחסרונות הקשורים להומוגניות של גודל וצורת הספרואידים, התאוששות הספרואידים לאחר היווצרותם, מספר הספרואידים המיוצרים, אוטומציה של תהליכים, עוצמת עבודה ועלויות11.
בשיטת המיקרומולד, התאים מחולקים ומופקדים בתחתית המיקרומולד בגלל כוח הכבידה. ההידרוג’ל שאינו דבק אינו מאפשר לתאים להיצמד לתחתית, ואינטראקציות בין תאים לתא מובילות להיווצרות של ספרואיד יחיד לכל מיתון 8,12. שיטת ביו-פבריקציה זו מייצרת ספרואידים בגודל הומוגני ומבוקר, ניתנת לרובוטיזציה לייצור בקנה מידה גדול בצורה חסכונית בזמן עם מאמץ מינימלי, ויש לה גורמים טובים של עלות-תועלת קריטית בתכנון של ביו-פבריקציה של ספרואידרקמה 7,8. ניתן ליישם שיטה זו כדי ליצור ספרואידים של כל שושלת תאים כדי להכין סוג רקמה חדש עם מאפיינים צפויים, אופטימליים וניתנים לשליטה8.
Biofabrication מוגדר כ”ייצור אוטומטי של מוצרים פונקציונליים ביולוגית עם ארגון מבני …”13. לכן, הייצור האוטומטי של ספרואידים נחשב לצעד החובה הראשון לפיתוח קו ביו-פבריקציה, הממשיך בתהליך ההדפסה הביולוגית התלת-ממדית ומסתיים בהבשלה מלאה של הרקמה המודפסת ביולוגית על ידי היתוך ספרואידים. במחקר זה, כדי לשפר את יכולת ההרחבה של ביו-פבריקציה של ASC spheroid, אנו משתמשים במערכת צינורות אוטומטית כדי לזרוע את תרחיף התא, ובכך להבטיח את ההומוגניות של גודל וצורת הספרואידים. מאמר זה מראה כי ניתן היה לייצר מספר רב (אלפי) של ספרואידים הדרושים לגישות הדפסה ביולוגית תלת-ממדית כדי ליצור ביו-פבריקט של מודלים מורכבים יותר של רקמות.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמר זה מציג את הדור בקנה מידה גדול של כדורי ASC באמצעות מערכת פיפטה אוטומטית. השלב הקריטי של הפרוטוקול הוא להגדיר במדויק את התוכנה כדי להבטיח את הנפח הנכון של מתלה התא, המהירות והמרחק לצינורות. הפרמטרים המתוארים בפרוטוקול נקבעו לאחר מספר ניסויים כדי לייעל את חלוקת ההשעיה של תאי ASC לבארות של…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים למכון הלאומי למטרולוגיה, איכות וטכנולוגיה (INMETRO, RJ, ברזיל) על השימוש במתקנים שלהם. מחקר זה נתמך בחלקו על ידי קרן קרלוס צ’אגאס פילו לתמיכה מחקרית במדינת ריו דה ז’ניירו (Faperj) (קוד מימון: E26/202.682/2018 ו- E-26/010.001771/2019, המועצה הלאומית לפיתוח מדעי וטכנולוגי (CNPq) (קוד מימון: 307460/2019-3), והמשרד למחקר ימי (ONR) (קוד מימון: N62909-21-1-2091). עבודה זו נתמכה באופן חלקי על ידי המרכז הלאומי למדע וטכנולוגיה בנושא רפואה רגנרטיבית-INCT Regenera (http://www.inctregenera.org.br/).
Materials
| 12-well plastic plate | Corning | 3512 | |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | CLS430828 | |
| EpMotion 5070 | Eppendorf | 5070000282 | |
| epT.I.P.S. Motion | Eppendorf | 30015231 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Invitrogen | 15576028 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10082147 | |
| Low Glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM LOW) | Gibco | 31600034 | |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids – 16 x 16 array | Sigma | Z764000 | |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids – 9 x 9 array | Sigma | Z764019 | |
| phosphate saline buffer (PBS) | Sigma | 806552 | |
| sodium chloride (NaCl) | Sigma | S8776 | |
| tissue culture flask | Corning | 430720U | |
| trypan | Lonza | 17-942E | |
| trypsin | Gibco | 27250018 | |
| ultrapure agarose | Invitrogen | 16500100 |
Riferimenti
- Gentile, C. Filling the gaps between the in vivo and in vitro microenvironment: Engineering of spheroids for stem cell technology. Current Stem Cell Research & Therapy. 11 (8), 652-665 (2016).
- Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (31), 13724-13729 (2010).
- Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue Engineering Part C: Methods. 16 (4), 735-749 (2009).
- Cortês, I., et al. A scaffold- and serum-free method to mimic human stable cartilage validated by secretome. Tissue Engineering: Part A. 27 (5-6), 311-327 (2021).
- Kronemberger, G. S., et al. Scaffold- and serum-free hypertrophic cartilage tissue engineering as an alternative approach for bone repair. Artificial Organs. 44 (7), 288-299 (2020).
- Kronemberger, G. S., et al. The hypertrophic cartilage induction influences the building-block capacity of human adipose stem/stromal cell spheroids for biofabrication. Artificial Organs. 45 (10), 1208-1218 (2021).
- Mehesz, A. N., et al. Scalable robotic biofabrication of tissue spheroids. Biofabrication. 3 (2), 025002 (2011).
- Koudan, E. V., et al. The scalable standardized biofabrication of tissue spheroids from different cell types using nonadhesive technology. 3D Printing and Additive Manufacturing. 4 (1), 53-60 (2017).
- Parfenov, V. A., et al. label-free and nozzle-free biofabrication technology using magnetic levitational assembly. Biofabrication. 10 (3), 034104 (2018).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Life is 3D: Boosting spheroid function for tissue engineering. Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).
- Gutzweiler, L., et al. Large scale production and controlled deposition of single HUVEC spheroids for bioprinting applications. Biofabrication. 9 (2), 025027 (2017).
- Lin, H., Li, Q., Lei, Y. Three-dimensional tissues using human pluripotent stem cell spheroids as biofabrication building blocks. Biofabrication. 9 (2), 025007 (2017).
- Groll, J., et al. Biofabrication: reappraising the definition of an evolving field. Biofabrication. 8 (1), 013001 (2016).
- Baptista, L. S., et al. An alternative method for the isolation of mesenchymal stromal cells derived from lipoaspirate samples. Cytotherapy. 11 (6), 706-715 (2009).
- Conway, M. K., et al. Scalable 96-well plate based iPSC culture and production using a robotic liquid handling system. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (99), e52755 (2015).
- Moutsatsou, P., et al. Automation in cell and gene therapy manufacturing: from past to future. Biotechnology Letters. 41 (11), 1245-1253 (2019).
- Doulgkeroglou, M. -. K., et al. Automation, monitoring, and standardization of cell product manufacturing. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 811 (2020).
- Bhise, N. S., et al. A liver-on-a-chip platform with bioprinted hepatic spheroids. Biofabrication. 8 (1), 014101 (2016).
- Daly, A. C., Kelly, D. J. Biofabrication of spatially organised tissues by directing the growth of cellular spheroids within 3D printed polymeric microchambers. Biomaterials. 197, 194-206 (2019).
- Lopa, S., et al. Microfluidic biofabrication of 3D multicellular spheroids by modulation of non-geometrical parameters. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 366 (2020).
- Meseguer-Ripolles, J., Kasarinaite, A., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. Protocol for automated production of human stem cell derived liver spheres. STAR Protocols. 2 (2), 100502 (2021).
- Lee, G. -. H., Suh, Y., Park, J. Y. A paired bead and magnet array for molding microwells with variable concave geometries. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55548 (2018).
- Becerra, D., Wu, T., Jeffs, S., Ott, H. C. High-throughput culture method of induced pluripotent stem cell-derived alveolar epithelial cells. Tissue Engineering Part C – Methods. 27 (12), 639-648 (2021).
- Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. Organ printing: from bioprinter to organ biofabrication line. Current Opinion Biotechnology. 22 (5), 667-673 (2011).
- De Moor, L., et al. High-throughput fabrication of vascularized spheroids for bioprinting. Biofabrication. 10 (3), 035009 (2018).
