Entwicklung von Organoiden aus der Hypophyse der Maus als In-vitro-Modell zur Erforschung der Hypophysenstammzellbiologie
Summary
Die Hypophyse ist der wichtigste Regulator des endokrinen Systems des Körpers. Dieser Artikel beschreibt die Entwicklung von Organoiden aus der Hypophyse der Maus als neuartiges 3D-In-vitro-Modell zur Untersuchung der Stammzellpopulation der Drüse, deren Biologie und Funktion noch wenig verstanden werden.
Abstract
Die Hypophyse ist die endokrine Master-Drüse, die wichtige physiologische Prozesse reguliert, einschließlich Körperwachstum, Stoffwechsel, sexuelle Reifung, Fortpflanzung und Stressreaktion. Vor mehr als einem Jahrzehnt wurden Stammzellen in der Hypophyse identifiziert. Trotz der Anwendung transgener In-vivo-Ansätze bleiben ihr Phänotyp, ihre Biologie und ihre Rolle unklar. Um dieses Rätsel anzugehen, wird ein neues und innovatives Organoid-In-vitro-Modell entwickelt, um die Biologie der Hypophysenstammzellen tief zu entwirren. Organoide stellen 3D-Zellstrukturen dar, die sich unter definierten Kulturbedingungen aus den (epithelialen) Stammzellen eines Gewebes selbst entwickeln und mehrere Merkmale dieser Stammzellen und ihres Gewebes rekapitulieren. Hier wird gezeigt, dass sich aus der Hypophyse gewonnene Organoide der Maus aus den Stammzellen der Drüse entwickeln und ihre in vivo phänotypischen und funktionellen Eigenschaften getreu rekapitulieren. Sie reproduzieren unter anderem den Aktivierungszustand der Stammzellen als in vivo , der als Reaktion auf transgen zugefügte lokale Schäden auftritt. Die Organoide sind langfristig erweiterbar, während sie ihren Stammphänotyp robust beibehalten. Das neue Forschungsmodell ist sehr wertvoll, um den Phänotyp und das Verhalten der Stammzellen während der Schlüsselbedingungen des Hypophysenumbaus zu entschlüsseln, von der neonatalen Reifung bis zum altersbedingten Verblassen und von gesunden bis kranken Drüsen. Hier wird ein detailliertes Protokoll vorgestellt, um aus der Hypophyse gewonnene Organoide der Maus zu etablieren, die ein leistungsfähiges Werkzeug bieten, um in die noch rätselhafte Welt der Hypophysenstammzellen einzutauchen.
Introduction
Die Hypophyse ist eine winzige endokrine Drüse, die sich an der Basis des Gehirns befindet, wo sie mit dem Hypothalamus verbunden ist. Die Drüse integriert periphere und zentrale (hypothalamische) Eingänge, um eine abgestimmte und koordinierte Hormonfreisetzung zu erzeugen, wodurch nachgeschaltete endokrine Zielorgane (wie Nebennieren und Gonaden) reguliert werden, um geeignete Hormone zum richtigen Zeitpunkt zu produzieren. Die Hypophyse ist der Schlüsselregulator des endokrinen Systems und wird daher zu Recht als Masterdrüse1 bezeichnet.
Die Hypophyse der Maus besteht aus drei Lappen (Abbildung 1), d. h. dem Vorderlappen (AL), dem Zwischenlappen (IL) und dem hinteren Lappen (PL). Die große endokrine AL enthält fünf hormonelle Zelltypen, einschließlich Somatotropen, die Wachstumshormon (GH) produzieren; Lactotrope, die Prolaktin erzeugen (PRL); Kortikotrope, die das adrenocorticotrope Hormon (ACTH) absondern; Thyreotrope, die für die Produktion von Schilddrüsen-stimulierenden Hormonen (TSH) verantwortlich sind; und Gonadotrope, die luteinisierendes Hormon (LH) und follikelstimulierendes Hormon (FSH) bilden. Die PL besteht aus axonalen Projektionen aus dem Hypothalamus, in denen die Hormone Oxytocin und Vasopressin (antidiuretisches Hormon) gespeichert sind. Das IL befindet sich zwischen dem AL und dem PL und beherbergt Melanotrope, die Melanozyten-stimulierendes Hormon (MSH) produzieren. In der menschlichen Hypophyse bildet sich die IL während der Entwicklung zurück, und Melanotrope werden innerhalb der AL1 verteilt. Neben den endokrinen Zellen enthält die Hypophyse auch einen Pool von Stammzellen, die im Wesentlichen durch den Transkriptionsfaktor SOX2 2,3,4,5,6 gekennzeichnet sind. Diese SOX2+-Zellen befinden sich in der Randzone (MZ), der Epithelauskleidung der Spalte (ein embryonales Restlumen zwischen AL und IL), oder sind als Cluster über das Parenchym des AL verteilt, wodurch zwei Stammzellnischen in der Drüse vorgeschlagen werden (Abbildung 1) 2,3,4,5,6.
Angesichts der unverzichtbaren Natur der Hypophyse ist eine Fehlfunktion der Drüse mit einer schweren Morbidität verbunden. Hyperpituitarismus (gekennzeichnet durch Übersekretion eines oder mehrerer Hormone) und Hypopituitarismus (fehlerhafte oder fehlende Produktion eines oder mehrerer Hormone) können durch neuroendokrine Hypophysentumoren (PitNETs; z. B. ACTH-produzierende Tumoren, die zur Morbus Cushing führen) oder durch genetische Defekte (z. B. GH-Mangel, der zu Zwergwuchs führt) verursacht werden7. Darüber hinaus sind Hypophysenchirurgie (z. B. zur Entfernung von Tumoren), Infektionen (z. B. Hypothalamus-Hypophysen-Tuberkulose oder Infektionen nach bakterieller Meningitis oder Enzephalitis), Sheehan-Syndrom (Nekrose aufgrund unzureichender Durchblutung aufgrund von starkem Blutverlust bei der Geburt), Hypophysenapoplexie und traumatische Hirnverletzung weitere wichtige Ursachen für die Hypophysenunterfunktion8 . Es wurde gezeigt, dass die Hypophyse der Maus die Regenerationsfähigkeit besitzt und in der Lage ist, lokale Schäden zu reparieren, die durch transgene Ablation endokriner Zellen verursacht werden 9,10. Die SOX2+-Stammzellen reagieren akut auf die zugefügte Verletzung und zeigen einen aktivierten Phänotyp, der durch eine erhöhte Proliferation (was zu einer Stammzellexpansion führt) und eine erhöhte Expression von stammesbedingten Faktoren und Signalwegen (z. B. WNT / NOTCH) gekennzeichnet ist. Darüber hinaus beginnen die Stammzellen, das abgetragene Hormon zu exprimieren, was schließlich zu einer erheblichen Wiederherstellung der erschöpften Zellpopulation über die folgenden (5 bis 6) Monate 9,10 führt. Auch während der neonatalen Reifungsphase der Drüse (die ersten 3 Wochen nach der Geburt) gedeihen die Hypophysenstammzellen in einem aktivierten Zustand 6,11,12,13, während das Altern des Organismus mit einer verminderten In-situ-Stammzellfunktionalität verbunden ist, aufgrund einer zunehmenden entzündlichen (Mikro-) Umgebung beim Altern (oder “entzündlich”)10,14 . Darüber hinaus ist die Tumorgenese in der Drüse auch mit der Stammzellaktivierung assoziiert 7,15. Obwohl die Stammzellaktivierung in mehreren Situationen des Hypophysenumbaus nachgewiesen wurde (überprüft in 7,16), bleiben die zugrunde liegenden Mechanismen unklar. Da In-vivo-Ansätze (wie die Linienverfolgung bei transgenen Mäusen) kein klares oder umfassendes Bild von Hypophysenstammzellen geliefert haben, ist die Entwicklung zuverlässiger In-vitro-Modelle zur Erforschung der Stammzellbiologie in normaler und kranker Hypophyse unerlässlich. Die Standard-In-vitro-Kultur primärer Hypophysenstammzellen ist aufgrund der sehr begrenzten Wachstumskapazität und der nicht-physiologischen (2D) Bedingungen mit schnellem Verlust des Phänotyps nach wie vor unzureichend (für einen detaillierteren Überblick siehe16). 3D-Kugelkulturen (Pituisphären) wurden aus Hypophysenstammzellen etabliert, die durch die Nebenpopulation und den SOX2+-Phänotyp 2,3,4 identifiziert wurden. Die Pituisphären wachsen klonal aus den Stammzellen, exprimieren Stammheitsmarker und zeigen Differenzierungsfähigkeit in die endokrinen Zelltypen. Sie dehnen sich jedoch nicht wesentlich aus, während sie nur eine begrenzte Durchlässigkeit aufweisen (2-3 Passagen)3,4. Kugelartige Strukturen wurden auch aus nicht dissoziierten Hypophysenstammzellclustern erhalten, wenn sie 1 Woche lang in 50% verdünntem Matrigel kultiviert wurden, aber die Erweiterbarkeit wurde nicht gezeigt17. Der Pituisphere-Ansatz wird hauptsächlich als Auslesewerkzeug für Stammzellzahlen verwendet, aber weitere Anwendungen sind durch eine geringere Expansionskapazitätbegrenzt 16.
Um diese Mängel zu beheben und zu überwinden, wurde kürzlich ein neues 3D-Modell entwickelt, d.h. Organoide, ausgehend von der großen endokrinen AL von Mäusen, die die MZ- und parenchymalen Stammzellen enthalten. Es hat sich gezeigt, dass die Organoide tatsächlich aus den Stammzellen der Hypophyse gewonnen werden und ihren Phänotyp18 originalgetreu rekapitulieren. Darüber hinaus sind die Organoide langfristig expandierbar, während sie ihre Stammnatur robust beibehalten. Daher bieten sie eine zuverlässige Methode, um primäre Hypophysenstammzellen für eine tiefgreifende Exploration zu erweitern. Eine solche Exploration ist mit der begrenzten Anzahl von Stammzellen, die aus einer Hypophyse isoliert werden können, die auch unter 2D-Bedingungen nicht erweiterbar sind, nicht erreichbar16. Es hat sich gezeigt, dass die Organoide wertvolle und zuverlässige Werkzeuge sind, um neue Merkmale von Hypophysenstammzellen (übersetzbar in vivo) aufzudecken14,18. Wichtig ist, dass das Organoidmodell den Aktivierungsstatus der Hypophysenstammzellen während lokaler Gewebeschäden und neonataler Reifung getreu widerspiegelt, eine verbesserte Bildungseffizienz zeigt und hochregulierte molekulare Wege repliziert14,18. Daher ist das aus der Hypophyse abgeleitete Organoidmodell ein innovatives und leistungsfähiges Forschungsmodell für die Hypophysenstammzellbiologie sowie ein Werkzeug zum Auslesen der Stammzellaktivierung.
Dieses Protokoll beschreibt detailliert die Etablierung von aus der Hypophyse stammenden Organoiden der Maus. Zu diesem Zweck wird die AL isoliert und in einzelne Zellen dissoziiert, die in das extrazelluläre Matrix-nachahmende Matrigel (im Folgenden als ECM bezeichnet) eingebettet sind. Die Zell-ECM-Anordnung wird dann in einem definierten Medium kultiviert, das im Wesentlichen Stammzellwachstumsfaktoren und Hypophysen-Embryonalregulatoren enthält (im Folgenden als “Hypophysen-Organoid-Medium” (PitOM)18 bezeichnet; Tabelle 1). Sobald die Organoide vollständig entwickelt sind (nach 10-14 Tagen), können sie durch sequentielles Passieren weiter expandiert und einer umfangreichen nachgelagerten Exploration unterzogen werden (z. B. Immunfluoreszenz, RT-qPCR und Bulk- oder Einzelzelltranskriptomik; Abbildung 1). Längerfristig wird erwartet, dass die Hypophysenstammzell-Organoide den Weg für Gewebereparaturansätze und regenerative Medizin ebnen werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die von AL abgeleiteten Organoide, wie hier beschrieben, stellen ein leistungsfähiges Forschungsmodell zur Untersuchung von Hypophysenstammzellen in vitro dar. Derzeit ist dieser Organoidansatz das einzige verfügbare Werkzeug, um primäre Hypophysenstammzellen zuverlässig und robust zu züchten und zu erweitern. Ein Hypophysen-Organoid-Modell, das aus embryonalen Stammzellen (ESC) oder induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) abgeleitet wurde, wurde bereits berichtet, das die hypophysäre embryonale Orga…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des KU Leuven Research Fund und des Fund for Scientific Research (FWO) – Flandern unterstützt. E.L. (11A3320N) und C.N. (1S14218N) werden durch ein Ph.D. Fellowship der FWO/FWO-SB unterstützt.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 48-well plates, TC treated, individually wrapped | Costar | 734-1607 | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Advanced DMEM | Gibco | 12491023 | |
| Albumin Bovine (cell culture grade) | Serva | 47330 | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Gibco | 12587010 | |
| Base moulds | VWR | 720-1918 | |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | |
| Cassettes, Q Path Microtwin | VWR | 720-2191 | |
| Cell strainer, 40 µm mesh, disposable | Falcon | 352340 | |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| D-glucose | Merck | 108342 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DMEM, powder, high glucose | Gibco | 52100039 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | |
| Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| Epredia HistoStar Embedding Workstation, 220 to 240Vac | Thermo Fisher Scientific | 12587976 | |
| Ethanol Absolute 99.8+% | Thermo Fisher Scientific | 10342652 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15630056 | |
| InSolution Y-27632 | Sigma-Aldrich | 688001 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-Free | Corning | 15505739 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | |
| Nunc Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes | Thermo Fisher Scientific | 375353 | |
| Paraformaldehyde for synthesis (PFA) | Merck | 818715 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Phenol red | Merck | 107241 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Merck | 104936 | |
| Recombinant Human EGF Protein, CF | R&D systems | 236-EG | |
| Recombinant Human FGF basic/FGF2/bFGF (157 aa) Protein | R&D systems | 234-FSE | |
| Recombinant Human FGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| Recombinant Human IGF-1 | Peprotech | 100-11 | |
| Recombinant Human IL-6 | Peprotech | 200-06 | |
| Recombinant Human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
| Recombinant Human R-Spondin-1 | Peprotech | 120-38 | |
| Recombinant Human/Murine FGF-8b | Peprotech | 100-25 | |
| Recombinant Mouse Sonic Hedgehog/Shh (C25II) N-Terminus | R&D systems | 464-SH | |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | BDH | 102415K | |
| Sodium di-Hydrogen Phosphate 1-hydrate | PanReac-AppliChem | A1047 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| Sodium-Pyruvate (C3H3NaO3) | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Stericup-GP, 0.22 µm | Millipore | SCGPU02RE | |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 0.22 μm | Millipore | SCGP00525 | |
| Sterile water | Fresenius | B230531 | |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Syringe, with BD Microlance needle with intradermal bevel, 26G | BD Plastipak | BDAM303176 | |
| Thermo Scientific Excelsior ES Tissue Processor | Thermo Scientific | 12505356 | |
| Titriplex III | Merck | 108418 | |
| TrypL Express Enzyme (1X), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12605028 | |
| Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma-Aldrich | T9003 | |
| Trypsin solution 2.5 % | Thermo Fisher Scientific | 15090046 |
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