Utvikling av organoider fra mus hypofyse som in vitro modell for å utforske hypofysen stamcellebiologi
Summary
Hypofysen er nøkkelregulatoren til kroppens endokrine system. Denne artikkelen beskriver utviklingen av organoider fra musen hypofysen som en ny 3D in vitro modell for å studere kjertelens stamcellepopulasjon som biologien og funksjonen forblir dårlig forstått.
Abstract
Hypofysen er den viktigste endokrine kjertelen som regulerer viktige fysiologiske prosesser, inkludert kroppsvekst, metabolisme, kjønnsmodning, reproduksjon og stressrespons. For mer enn et tiår siden ble stamceller identifisert i hypofysen. Til tross for anvendelsen av transgene in vivo-tilnærminger , forblir deres fenotype, biologi og rolle uklar. For å takle denne gåten utvikles en ny og innovativ organoid in vitro-modell for å dypt avdekke hypofyse stamcellebiologi. Organoider representerer 3D-cellestrukturer som under definerte kulturforhold utvikler seg selv fra vevets (epiteliale) stamceller og rekapitulerer flere kjennetegn på disse stamcellene og deres vev. Det er vist her at mus hypofyse-avledede organoider utvikler seg fra kjertelens stamceller og trofast rekapitulere sine in vivo fenotypiske og funksjonelle egenskaper. Blant annet reproduserer de stamcellens aktiveringstilstand som in vivo som oppstår som svar på transgenisk påført lokal skade. Organoidene er langsiktige utvidbare, samtidig som de beholder sin stemness fenotype på en robust måte. Den nye forskningsmodellen er svært verdifull for å dechiffrere stamcellenes fenotype og oppførsel under viktige forhold for hypofyseoppussing, alt fra neonatal modning til aldringsrelatert falming, og fra sunne til syke kjertler. Her presenteres en detaljert protokoll for å etablere mus hypofyse-avledede organoider, som gir et kraftig verktøy for å dykke inn i den ennå gåtefulle verden av hypofyse stamceller.
Introduction
Hypofysen er en liten endokrine kjertel som ligger ved foten av hjernen, hvor den er koblet til hypothalamus. Kjertelen integrerer perifere og sentrale (hypothalamus) innganger for å generere en innstilt og koordinert hormonfrigjøring, og regulerer dermed nedstrøms mål endokrine organer (som binyrene og gonadene) for å produsere passende hormoner til rett tid. Hypofysen er nøkkelregulatoren til det endokrine systemet og kalles derfor med rette masterkjertelen1.
Mus hypofysen består av tre lober (figur 1), det vil si fremre lobe (AL), mellomloben (IL) og bakre lobe (PL). Den store endokrine AL inneholder fem hormonelle celletyper, inkludert somatotroper som produserer veksthormon (GH); laktotroper som genererer prolaktin (PRL); kortikotroper som skiller ut adrenocorticotropisk hormon (ACTH); thyrotropes ansvarlig for skjoldbruskstimulerende hormon (TSH) produksjon; og gonadotroper som gjør luteiniserende hormon (LH) og follikkelstimulerende hormon (FSH). PL består av axonale projeksjoner fra hypothalamus der hormonene oksytocin og vasopressin (antidiuretisk hormon) lagres. IL ligger mellom AL og PL og huser melanotroper som produserer melanocyttstimulerende hormon (MSH). I den menneskelige hypofysen går IL tilbake under utvikling, og melanotroper spres innenfor AL1. I tillegg til de endokrine cellene inneholder hypofysen også et basseng med stamceller, i hovedsak preget av transkripsjonsfaktoren SOX2 2,3,4,5,6. Disse SOX2+ cellene ligger i marginalsonen (MZ), epitelforingen av kløften (en embryonal rest lumen mellom AL og IL), eller spres som klynger gjennom parenchyma av AL, og foreslår dermed to stamcellenisjer i kjertelen (figur 1)2,3,4,5,6.
Gitt hypofysens uunnværlige natur, er funksjonsfeil i kjertelen forbundet med alvorlig sykelighet. Hyperpituitarisme (preget av over-sekresjon av ett eller flere hormoner) og hypopituitarisme (defekt eller manglende produksjon av ett eller flere hormoner) kan være forårsaket av hypofysen nevroendokrine svulster (PitNETs; f.eks. ACTH-produserende svulster som fører til Cushings sykdom) eller ved genetiske defekter (f.eks. GH-mangel som resulterer i dvergisme)7. I tillegg hypofysekirurgi (f.eks. for å fjerne svulster), infeksjoner (f.eks. hypothalamus-hypofyse tuberkulose, eller infeksjoner etter bakteriell meningitt eller encefalitt), Sheehans syndrom (nekrose på grunn av utilstrekkelig blodstrøm på grunn av kraftig blodtap ved fødsel), hypofyse apoplexy og traumatisk hjerneskade er andre viktige årsaker til hypofyse hypofuktighet8 . Det har vist seg at musen hypofysen har regenerativ kapasitet, å kunne reparere lokal skade introdusert ved transgen ablasjon av endokrine celler 9,10. SOX2+-stamcellene reagerer akutt på den påførte skaden som viser en aktivert fenotype, preget av forbedret spredning (som resulterer i stamcelleutvidelse) og økt uttrykk for stamcellerelaterte faktorer og veier (f.eks. Videre begynner stamcellene å uttrykke det ablerte hormonet, noe som til slutt resulterer i betydelig restaurering av den utarmede cellepopulasjonen i løpet av følgende (5 til 6) måneder 9,10. Også under neonatal modningsfasen av kjertelen (de første 3 ukene etter fødselen) blomstrer hypofysen stamceller i en aktivert tilstand 6,11,12,13, mens organismal aldring er forbundet med redusert in situ stamcellefunksjonalitet, på grunn av et økende inflammatorisk (mikro-) miljø ved aldring (eller ‘inflammaging’)10,14 . I tillegg er tumorigenesis i kjertelen også forbundet med stamcelleaktivering 7,15. Selv om stamcelleaktivering har blitt påvist i flere situasjoner med hypofyseoppussing (gjennomgått i 7,16), er underliggende mekanismer fortsatt uklare. Siden in vivo-tilnærminger (for eksempel avstamningssporing hos transgene mus) ikke har gitt et klart eller omfattende bilde av hypofyse stamceller, er utviklingen av pålitelige in vitro-modeller for å utforske stamcellebiologi i normal og syk hypofyse viktig. Standard in vitrokultur av primære hypofyse stamceller forblir utilstrekkelig på grunn av svært begrenset vekstkapasitet og ikke-fysiologiske (2D) forhold med raskt tap av fenotype (for en mer detaljert oversikt, se16). 3D-sfærekulturer (pituispheres) er etablert fra hypofyse stamceller som identifisert av sidepopulasjon og SOX2 + fenotype 2,3,4. Pituisfærene vokser clonally fra stamcellene, uttrykker stemnessmarkører og viser differensieringskapasitet i de endokrine celletypene. Imidlertid utvides de ikke betydelig mens de bare viser begrenset passasje (2-3 passasjer)3,4. Sfærelignende strukturer ble også hentet fra ikke-dissosierte hypofyse stamcelleklynger når de ble dyrket i 50% fortynnet Matrigel i 1 uke, men utvidelsesmuligheter ble ikke vist17. Pituisphere-tilnærmingen brukes for det meste som et avlesningsverktøy for stamcellenumre, men ytterligere applikasjoner er begrenset av dårligere utvidelseskapasitet16.
For å adressere og overvinne disse manglene har en ny 3D-modell nylig blitt etablert, det vil si organoider, fra den store endokrine AL av mus som inneholder MZ og parenchymale stamceller. Det har vist seg at organoidene faktisk er avledet fra hypofysens stamceller og trofast rekapitulerer deres fenotype18. Videre er organoidene langsiktige utvidbare, samtidig som de opprettholder sin stemness natur på en robust måte. Derfor gir de en pålitelig metode for å utvide primære hypofyse stamceller for dyp utforskning. Slik utforskning kan ikke oppnås med det begrensede antallet stamceller som kan isoleres fra en hypofyse, som heller ikke kan utvides under 2D-forhold16. Det har vist seg at organoidene er verdifulle og pålitelige verktøy for å avdekke nye hypofyse stamcellefunksjoner (oversettbar til in vivo)14,18. Viktigst, den organoide modellen speiler trofast hypofysen stamcelleaktiveringsstatus som oppstår under lokal vevsskade og neonatal modning, som viser forbedret formasjonseffektivitet og replikerer oppregulerte molekylære veier14,18. Derfor er den hypofyse-avledede organoidmodellen en innovativ og kraftig forskningsmodell for hypofyse stamcellebiologi samt et stamcelleaktiveringsavlesningsverktøy.
Denne protokollen beskriver i detalj etableringen av mus hypofyse-avledede organoider. Til dette målet er AL isolert og dissosiert i enkeltceller, som er innebygd i ekstracellulær matrise-etterligning Matrigel (heretter referert til som ECM). Celle-ECM-samlingen dyrkes deretter i et definert medium, som i hovedsak inneholder stamcellevekstfaktorer og hypofysære embryonale regulatorer (videre referert til som ‘hypofysen organoid medium’ (PitOM)18; Tabell 1). Når organoidene er fullt utviklet (etter 10-14 dager), kan de utvides ytterligere gjennom sekvensiell passivisering og utsettes for omfattende nedstrømsutforskning (f.eks. immunfluorescens, RT-qPCR og bulk- eller encellet transkripsjonsomikk; Figur 1). På lengre sikt forventes det at hypofysens stamcelleorganoider vil bane vei for vevsreparasjonsmetoder og regenerativ medisin.
Protocol
Representative Results
Discussion
De AL-avledede organoidene, som beskrevet her, representerer en kraftig forskningsmodell for å studere hypofyse stamceller in vitro. For tiden er denne organoid tilnærmingen det eneste tilgjengelige verktøyet for pålitelig og robust å vokse og utvide primære hypofyse stamceller. En hypofyse organoid modell avledet fra embryonale stamceller (ESC) eller induserte pluripotente stamceller (iPSC) har blitt rapportert tidligere, som nøye recapitulates hypofyse embryonal organogenese23; …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra KU Leuven Research Fund og Fund for Scientific Research (FWO) – Flandern. E.L. (11A3320N) og C.N. (1S14218N) støttes av et ph.d.-stipend fra FWO/FWO-SB.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 48-well plates, TC treated, individually wrapped | Costar | 734-1607 | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Advanced DMEM | Gibco | 12491023 | |
| Albumin Bovine (cell culture grade) | Serva | 47330 | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Gibco | 12587010 | |
| Base moulds | VWR | 720-1918 | |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | |
| Cassettes, Q Path Microtwin | VWR | 720-2191 | |
| Cell strainer, 40 µm mesh, disposable | Falcon | 352340 | |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| D-glucose | Merck | 108342 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DMEM, powder, high glucose | Gibco | 52100039 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | |
| Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| Epredia HistoStar Embedding Workstation, 220 to 240Vac | Thermo Fisher Scientific | 12587976 | |
| Ethanol Absolute 99.8+% | Thermo Fisher Scientific | 10342652 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15630056 | |
| InSolution Y-27632 | Sigma-Aldrich | 688001 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-Free | Corning | 15505739 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | |
| Nunc Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes | Thermo Fisher Scientific | 375353 | |
| Paraformaldehyde for synthesis (PFA) | Merck | 818715 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Phenol red | Merck | 107241 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Merck | 104936 | |
| Recombinant Human EGF Protein, CF | R&D systems | 236-EG | |
| Recombinant Human FGF basic/FGF2/bFGF (157 aa) Protein | R&D systems | 234-FSE | |
| Recombinant Human FGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| Recombinant Human IGF-1 | Peprotech | 100-11 | |
| Recombinant Human IL-6 | Peprotech | 200-06 | |
| Recombinant Human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
| Recombinant Human R-Spondin-1 | Peprotech | 120-38 | |
| Recombinant Human/Murine FGF-8b | Peprotech | 100-25 | |
| Recombinant Mouse Sonic Hedgehog/Shh (C25II) N-Terminus | R&D systems | 464-SH | |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | BDH | 102415K | |
| Sodium di-Hydrogen Phosphate 1-hydrate | PanReac-AppliChem | A1047 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| Sodium-Pyruvate (C3H3NaO3) | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Stericup-GP, 0.22 µm | Millipore | SCGPU02RE | |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 0.22 μm | Millipore | SCGP00525 | |
| Sterile water | Fresenius | B230531 | |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Syringe, with BD Microlance needle with intradermal bevel, 26G | BD Plastipak | BDAM303176 | |
| Thermo Scientific Excelsior ES Tissue Processor | Thermo Scientific | 12505356 | |
| Titriplex III | Merck | 108418 | |
| TrypL Express Enzyme (1X), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12605028 | |
| Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma-Aldrich | T9003 | |
| Trypsin solution 2.5 % | Thermo Fisher Scientific | 15090046 |
Riferimenti
- Melmed, S. . The pituitary. 3rd ed. , 1 (2011).
- Chen, J., et al. The adult pituitary contains a cell population displaying stem/progenitor cell and early-embryonic characteristics. Endocrinology. 146 (9), 3985-3998 (2005).
- Chen, J., et al. Pituitary progenitor cells tracked down by side population dissection. Stem Cells. 27 (5), 1182-1195 (2009).
- Fauquier, T., Rizzoti, K., Dattani, M., Lovell-Badge, R., Robinson, I. C. A. F. SOX2-expressing progenitor cells generate all of the major cell types in the adult mouse pituitary gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (8), 2907-2912 (2008).
- Rizzoti, K., Akiyama, H., Lovell-Badge, R. Mobilized adult pituitary stem cells contribute to endocrine regeneration in response to physiological demand. Cell Stem Cell. 13 (4), 419-432 (2013).
- Andoniadou, C. L., et al. Sox2+ stem/progenitor cells in the adult mouse pituitary support organ homeostasis and have tumor-inducing potential. Cell Stem Cell. 13 (4), 433-445 (2013).
- Nys, C., Vankelecom, H. Pituitary disease and recovery: How are stem cells involved. Molecular and Cellular Endocrinology. 525 (4), 111176 (2021).
- Schneider, H. J., Aimaretti, G., Kreitschmann-Andermahr, I., Stalla, G. K., Ghigo, E. Hypopituitarism. Lancet. 369 (9571), 1461-1470 (2007).
- Fu, Q., et al. The adult pituitary shows stem/progenitor cell activation in response to injury and is capable of regeneration. Endocrinology. 153 (7), 3224-3235 (2012).
- Willems, C., et al. Regeneration in the pituitary after cell-ablation injury: time-related aspects and molecular analysis. Endocrinology. 157 (2), 705-721 (2016).
- Gremeaux, L., Fu, Q., Chen, J., Vankelecom, H. Activated phenotype of the pituitary stem/progenitor cell compartment during the early-postnatal maturation phase of the gland. Stem Cells and Development. 21 (5), 801-813 (2012).
- Zhu, X., Tollkuhn, J., Taylor, H., Rosenfeld, M. G. Notch-dependent pituitary SOX2+ stem cells exhibit a timed functional extinction in regulation of the postnatal gland. Stem Cell Reports. 5 (6), 1196-1209 (2015).
- Russell, J. P., et al. Pituitary stem cells produce paracrine WNT signals to control the expansion of their descendant progenitor cells. eLife. 10 (1), 59142 (2021).
- Vennekens, A., et al. Interleukin-6 is an activator of pituitary stem cells upon local damage, a competence quenched in the aging gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (25), 2100052118 (2021).
- Mertens, F., et al. Pituitary tumors contain a side population with tumor stem cell-associated characteristics. Endocrine-Related Cancer. 22 (4), 481-504 (2015).
- Laporte, E., Vennekens, A., Vankelecom, H. Pituitary remodeling throughout life: are resident stem cells involved. Frontiers in Endocrinology. 11 (1), 604519 (2021).
- Yoshida, S., et al. Isolation of adult pituitary stem/progenitor cell clusters located in the parenchyma of the rat anterior lobe. Stem Cell Research. 17 (2), 318-329 (2016).
- Cox, B., et al. Organoids from pituitary as novel research model to study pituitary stem cell biology. Journal of Endocrinology. 240 (2), 287-308 (2019).
- Denef, C., Hautekeete, E., De Wolf, A., Vanderschueren, B. Pituitary basophils from immature male and female rats: distribution of gonadotrophs and thyrotrophs as studied by unit gravity sedimentation. Endocrinology. 130 (3), 724-735 (1978).
- Vander Schueren, B., Denef, C., Cassiman, J. J. Ultrastructural and functional characteristics of rat pituitary cell aggregates. Endocrinology. 110 (2), 513-523 (1982).
- Claes, C., et al. Human stem cell-derived monocytes and microglia-like cells reveal impaired amyloid plaque clearance upon heterozygous or homozygous loss of TREM2. Alzheimer’s and Dementia. 15 (3), 453-464 (2019).
- Trompeter, H. -. I., et al. MicroRNAs miR-26a, miR-26b, and miR-29b accelerate osteogenic differentiation of unrestricted somatic stem cells from human cord blood. BMC Genomics. 14, 111 (2013).
- Suga, H., et al. Self-formation of functional adenohypophysis in three-dimensional culture. Nature. 480 (7375), 57-62 (2011).
- Matsumoto, R., et al. Congenital pituitary hypoplasia model demonstrates hypothalamic OTX2 regulation of pituitary progenitor cells. Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 641-654 (2019).
- Kanie, K., et al. Pathogenesis of anti-PIT-1 antibody syndrome: PIT-1 presentation by HLA class I on anterior pituitary cells. Journal of the Endocrine Society. 3 (11), 1969-1978 (2019).
- Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Yan, H. H. N., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
- Nolan, L. A., Kavanagh, E., Lightman, S. L., Levy, A. Anterior pituitary cell population control: basal cell turnover and the effects of adrenalectomy and dexamethasone treatment. Journal of Neuroendocrinology. 10 (3), 207-215 (1998).
