Desarrollo de organoides a partir de la hipófisis del ratón como modelo in vitro para explorar la biología de las células madre hipofisarias
Summary
La glándula pituitaria es el regulador clave del sistema endocrino del cuerpo. Este artículo describe el desarrollo de organoides a partir de la hipófisis del ratón como un nuevo modelo 3D in vitro para estudiar la población de células madre de la glándula, cuya biología y función siguen siendo poco conocidas.
Abstract
La hipófisis es la glándula endocrina maestra que regula los procesos fisiológicos clave, incluido el crecimiento corporal, el metabolismo, la maduración sexual, la reproducción y la respuesta al estrés. Hace más de una década, se identificaron células madre en la glándula pituitaria. Sin embargo, a pesar de la aplicación de enfoques transgénicos in vivo , su fenotipo, biología y papel siguen sin estar claros. Para abordar este enigma, se desarrolla un nuevo e innovador modelo organoide in vitro para desentrañar profundamente la biología de las células madre hipofisarias. Los organoides representan estructuras celulares 3D que, bajo condiciones de cultivo definidas, se desarrollan a partir de las células madre (epiteliales) de un tejido y recapitulan múltiples características de esas células madre y su tejido. Aquí se muestra que los organoides derivados de la hipófisis del ratón se desarrollan a partir de las células madre de la glándula y recapitulan fielmente sus características fenotípicas y funcionales in vivo . Entre otros, reproducen el estado de activación de las células madre como in vivo que ocurre en respuesta al daño local infligido transgénicamente. Los organoides son expandibles a largo plazo mientras conservan robustamente su fenotipo de tallo. El nuevo modelo de investigación es muy valioso para descifrar el fenotipo y el comportamiento de las células madre durante las condiciones clave de remodelación de la hipófisis, que van desde la maduración neonatal hasta el desvanecimiento asociado al envejecimiento, y desde las glándulas sanas hasta las enfermas. Aquí, se presenta un protocolo detallado para establecer organoides derivados de la hipófisis del ratón, que proporcionan una herramienta poderosa para sumergirse en el pero enigmático mundo de las células madre hipofisarias.
Introduction
La hipófisis es una pequeña glándula endocrina ubicada en la base del cerebro, donde está conectada al hipotálamo. La glándula integra entradas periféricas y centrales (hipotalámicas) para generar una liberación hormonal sintonizada y coordinada, regulando así los órganos endocrinos objetivo aguas abajo (como las glándulas suprarrenales y las gónadas) para producir hormonas apropiadas en el momento adecuado. La hipófisis es el regulador clave del sistema endocrino y, por lo tanto, se denomina legítimamente la glándula maestra1.
La hipófisis del ratón consta de tres lóbulos (Figura 1), es decir, el lóbulo anterior (AL), el lóbulo intermedio (IL) y el lóbulo posterior (PL). El principal AL endocrino contiene cinco tipos de células hormonales, incluidos los somatotropos que producen la hormona del crecimiento (GH); lactotropos generadores de prolactina (PRL); corticótropos que secretan hormona adrenocorticotrópica (ACTH); tirotropos responsables de la producción de hormona estimulante de la tiroides (TSH); y gonadotropos que producen hormona luteinizante (LH) y hormona foliculoestimulante (FSH). El PL consiste en proyecciones axonales del hipotálamo en las que se almacenan las hormonas oxitocina y vasopresina (hormona antidiurética). La IL se encuentra entre el AL y el PL y alberga melanótropos que producen la hormona estimulante de melanocitos (MSH). En la hipófisis humana, la IL retrocede durante el desarrollo, y los melanotropos se propagan dentro de la AL1. Además de las células endocrinas, la glándula pituitaria también contiene un grupo de células madre, esencialmente marcadas por el factor de transcripción SOX2 2,3,4,5,6. Estas células SOX2+ se encuentran en la zona marginal (MZ), el revestimiento epitelial de la hendidura (una luz remanente embrionaria entre la AL y la IL), o se diseminan como grupos a lo largo del parénquima de la AL, proponiendo así dos nichos de células madre en la glándula (Figura 1)2,3,4,5,6.
Dada la naturaleza indispensable de la hipófisis, el mal funcionamiento de la glándula se asocia con una morbilidad grave. El hiperpituitarismo (caracterizado por la secreción excesiva de una o más hormonas) y el hipopituitarismo (producción defectuosa o faltante de una o más hormonas) pueden ser causados por tumores neuroendocrinos hipofisarios (PitNET; por ejemplo, tumores productores de ACTH que conducen a la enfermedad de Cushing) o por defectos genéticos (por ejemplo, deficiencia de GH que resulta en enanismo)7. Además, la cirugía hipofisaria (por ejemplo, para extirpar tumores), infecciones (por ejemplo, tuberculosis hipotalámico-hipofisaria o infecciones posteriores a meningitis bacteriana o encefalitis), síndrome de Sheehan (necrosis debido a un flujo sanguíneo insuficiente debido a una gran pérdida de sangre al nacer), apoplejía hipofisaria y lesión cerebral traumática son otras causas importantes de hipofunción hipofisaria8 . Se ha demostrado que la hipófisis del ratón posee la capacidad regenerativa, siendo capaz de reparar el daño local introducido por la ablación transgénica de células endocrinas 9,10. Las células madre SOX2+ reaccionan agudamente a la lesión infligida mostrando un fenotipo activado, marcado por una mayor proliferación (lo que resulta en la expansión de las células madre) y una mayor expresión de factores y vías relacionados con la madre (por ejemplo, WNT / NOTCH). Además, las células madre comienzan a expresar la hormona ablacionada, lo que finalmente resulta en una restauración sustancial de la población celular agotada durante los siguientes (5 a 6) meses 9,10. Además, durante la fase de maduración neonatal de la glándula (las primeras 3 semanas después del nacimiento), las células madre hipofisarias prosperan en un estado activado 6,11,12,13, mientras que el envejecimiento del organismo se asocia con una disminución de la funcionalidad de las células madre in situ, debido a un entorno inflamatorio (micro) creciente en el envejecimiento (o ‘inflamación’)10,14 . Además, la tumorigénesis en la glándula también se asocia con la activación de células madre 7,15. Aunque la activación de células madre se ha detectado en varias situaciones de remodelación hipofisaria (revisado en 7,16), los mecanismos subyacentes siguen sin estar claros. Dado que los enfoques in vivo (como el rastreo de linaje en ratones transgénicos) no han proporcionado una imagen clara o completa de las células madre hipofisarias, el desarrollo de modelos in vitro confiables para explorar la biología de las células madre en la hipófisis normal y enferma es esencial. El cultivo in vitro estándar de células madre hipofisarias primarias sigue siendo inadecuado debido a la capacidad de crecimiento muy limitada y las condiciones no fisiológicas (2D) con una rápida pérdida del fenotipo (para una visión general más detallada, ver16). Se han establecido cultivos de esferas 3D (pituisferas) a partir de células madre hipofisarias identificadas por población lateral y fenotipoSOX2+ 2,3,4. Las pituiesferas crecen clonalmente a partir de las células madre, expresan marcadores de tallo y muestran capacidad de diferenciación en los tipos de células endocrinas. Sin embargo, no se expanden considerablemente mientras muestran solo una pasadibilidad limitada (2-3 pasajes)3,4. También se obtuvieron estructuras en forma de esfera a partir de grupos de células madre hipofisarias no disociadas cuando se cultivaron en Matrigel diluido al 50% durante 1 semana, pero no se mostró capacidad de expansión17. El enfoque de la pituisfera se utiliza principalmente como una herramienta de lectura para el número de células madre, pero las aplicaciones adicionales están limitadas por una capacidad de expansión inferior16.
Para abordar y superar estas deficiencias, recientemente se ha establecido un nuevo modelo 3D, es decir, organoides, a partir de la principal AL endocrina de ratones que contienen la MZ y las células madre parenquimatosas. Se ha demostrado que los organoides se derivan de las células madre de la hipófisis y recapitulan fielmente su fenotipo18. Además, los organoides son expandibles a largo plazo, mientras que mantienen robustamente su naturaleza de tallo. Por lo tanto, proporcionan un método confiable para expandir las células madre hipofisarias primarias para una exploración profunda. Tal exploración no es alcanzable con el número limitado de células madre que se pueden aislar de una hipófisis, que tampoco son expandibles en condiciones 2D16. Se ha demostrado que los organoides son herramientas valiosas y fiables para descubrir nuevas características de las células madre hipofisarias (traducibles a in vivo)14,18. Es importante destacar que el modelo organoide refleja fielmente el estado de activación de las células madre hipofisarias como ocurre durante el daño tisular local y la maduración neonatal, mostrando una mayor eficiencia de formación y replicando las vías moleculares reguladas al alza14,18. Por lo tanto, el modelo organoide derivado de la hipófisis es un modelo de investigación de biología de células madre hipofisarias innovador y poderoso, así como una herramienta de lectura de activación de células madre.
Este protocolo describe en detalle el establecimiento de organoides derivados de la hipófisis del ratón. Con este objetivo, la AL se aísla y se disocia en células individuales, que están incrustadas en Matrigel que imita la matriz extracelular (en adelante, ECM). El ensamblaje célula-ECM se cultiva en un medio definido, que contiene esencialmente factores de crecimiento de células madre y reguladores embrionarios hipofisarios (también denominado “medio organoide hipofisario” (PitOM)18; Tabla 1). Una vez que los organoides están completamente desarrollados (después de 10-14 días), pueden expandirse aún más a través del pasaje secuencial y someterse a una extensa exploración aguas abajo (por ejemplo, inmunofluorescencia, RT-qPCR y transcriptómica a granel o de una sola célula; Figura 1). A largo plazo, se espera que los organoides de células madre hipofisarias allanen el camino hacia los enfoques de reparación de tejidos y la medicina regenerativa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los organoides derivados de AL, como se describe aquí, representan un poderoso modelo de investigación para estudiar las células madre hipofisarias in vitro. En la actualidad, este enfoque organoide es la única herramienta disponible para crecer y expandir de manera confiable y robusta las células madre hipofisarias primarias. Anteriormente se ha notificado un modelo organoide hipofisario derivado de células madre embrionarias (ESC) o células madre pluripotentes inducidas (iPSC), que recapitula estrecham…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Fondo de Investigación de Ku Leuven y el Fondo para la Investigación Científica (FWO) – Flandes. E.L. (11A3320N) y C.N. (1S14218N) están respaldados por una beca de doctorado de la FWO / FWO-SB.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 48-well plates, TC treated, individually wrapped | Costar | 734-1607 | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Advanced DMEM | Gibco | 12491023 | |
| Albumin Bovine (cell culture grade) | Serva | 47330 | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Gibco | 12587010 | |
| Base moulds | VWR | 720-1918 | |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | |
| Cassettes, Q Path Microtwin | VWR | 720-2191 | |
| Cell strainer, 40 µm mesh, disposable | Falcon | 352340 | |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| D-glucose | Merck | 108342 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DMEM, powder, high glucose | Gibco | 52100039 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | |
| Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| Epredia HistoStar Embedding Workstation, 220 to 240Vac | Thermo Fisher Scientific | 12587976 | |
| Ethanol Absolute 99.8+% | Thermo Fisher Scientific | 10342652 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15630056 | |
| InSolution Y-27632 | Sigma-Aldrich | 688001 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-Free | Corning | 15505739 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | |
| Nunc Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes | Thermo Fisher Scientific | 375353 | |
| Paraformaldehyde for synthesis (PFA) | Merck | 818715 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Phenol red | Merck | 107241 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Merck | 104936 | |
| Recombinant Human EGF Protein, CF | R&D systems | 236-EG | |
| Recombinant Human FGF basic/FGF2/bFGF (157 aa) Protein | R&D systems | 234-FSE | |
| Recombinant Human FGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| Recombinant Human IGF-1 | Peprotech | 100-11 | |
| Recombinant Human IL-6 | Peprotech | 200-06 | |
| Recombinant Human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
| Recombinant Human R-Spondin-1 | Peprotech | 120-38 | |
| Recombinant Human/Murine FGF-8b | Peprotech | 100-25 | |
| Recombinant Mouse Sonic Hedgehog/Shh (C25II) N-Terminus | R&D systems | 464-SH | |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | BDH | 102415K | |
| Sodium di-Hydrogen Phosphate 1-hydrate | PanReac-AppliChem | A1047 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| Sodium-Pyruvate (C3H3NaO3) | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Stericup-GP, 0.22 µm | Millipore | SCGPU02RE | |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 0.22 μm | Millipore | SCGP00525 | |
| Sterile water | Fresenius | B230531 | |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Syringe, with BD Microlance needle with intradermal bevel, 26G | BD Plastipak | BDAM303176 | |
| Thermo Scientific Excelsior ES Tissue Processor | Thermo Scientific | 12505356 | |
| Titriplex III | Merck | 108418 | |
| TrypL Express Enzyme (1X), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12605028 | |
| Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma-Aldrich | T9003 | |
| Trypsin solution 2.5 % | Thermo Fisher Scientific | 15090046 |
Riferimenti
- Melmed, S. . The pituitary. 3rd ed. , 1 (2011).
- Chen, J., et al. The adult pituitary contains a cell population displaying stem/progenitor cell and early-embryonic characteristics. Endocrinology. 146 (9), 3985-3998 (2005).
- Chen, J., et al. Pituitary progenitor cells tracked down by side population dissection. Stem Cells. 27 (5), 1182-1195 (2009).
- Fauquier, T., Rizzoti, K., Dattani, M., Lovell-Badge, R., Robinson, I. C. A. F. SOX2-expressing progenitor cells generate all of the major cell types in the adult mouse pituitary gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (8), 2907-2912 (2008).
- Rizzoti, K., Akiyama, H., Lovell-Badge, R. Mobilized adult pituitary stem cells contribute to endocrine regeneration in response to physiological demand. Cell Stem Cell. 13 (4), 419-432 (2013).
- Andoniadou, C. L., et al. Sox2+ stem/progenitor cells in the adult mouse pituitary support organ homeostasis and have tumor-inducing potential. Cell Stem Cell. 13 (4), 433-445 (2013).
- Nys, C., Vankelecom, H. Pituitary disease and recovery: How are stem cells involved. Molecular and Cellular Endocrinology. 525 (4), 111176 (2021).
- Schneider, H. J., Aimaretti, G., Kreitschmann-Andermahr, I., Stalla, G. K., Ghigo, E. Hypopituitarism. Lancet. 369 (9571), 1461-1470 (2007).
- Fu, Q., et al. The adult pituitary shows stem/progenitor cell activation in response to injury and is capable of regeneration. Endocrinology. 153 (7), 3224-3235 (2012).
- Willems, C., et al. Regeneration in the pituitary after cell-ablation injury: time-related aspects and molecular analysis. Endocrinology. 157 (2), 705-721 (2016).
- Gremeaux, L., Fu, Q., Chen, J., Vankelecom, H. Activated phenotype of the pituitary stem/progenitor cell compartment during the early-postnatal maturation phase of the gland. Stem Cells and Development. 21 (5), 801-813 (2012).
- Zhu, X., Tollkuhn, J., Taylor, H., Rosenfeld, M. G. Notch-dependent pituitary SOX2+ stem cells exhibit a timed functional extinction in regulation of the postnatal gland. Stem Cell Reports. 5 (6), 1196-1209 (2015).
- Russell, J. P., et al. Pituitary stem cells produce paracrine WNT signals to control the expansion of their descendant progenitor cells. eLife. 10 (1), 59142 (2021).
- Vennekens, A., et al. Interleukin-6 is an activator of pituitary stem cells upon local damage, a competence quenched in the aging gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (25), 2100052118 (2021).
- Mertens, F., et al. Pituitary tumors contain a side population with tumor stem cell-associated characteristics. Endocrine-Related Cancer. 22 (4), 481-504 (2015).
- Laporte, E., Vennekens, A., Vankelecom, H. Pituitary remodeling throughout life: are resident stem cells involved. Frontiers in Endocrinology. 11 (1), 604519 (2021).
- Yoshida, S., et al. Isolation of adult pituitary stem/progenitor cell clusters located in the parenchyma of the rat anterior lobe. Stem Cell Research. 17 (2), 318-329 (2016).
- Cox, B., et al. Organoids from pituitary as novel research model to study pituitary stem cell biology. Journal of Endocrinology. 240 (2), 287-308 (2019).
- Denef, C., Hautekeete, E., De Wolf, A., Vanderschueren, B. Pituitary basophils from immature male and female rats: distribution of gonadotrophs and thyrotrophs as studied by unit gravity sedimentation. Endocrinology. 130 (3), 724-735 (1978).
- Vander Schueren, B., Denef, C., Cassiman, J. J. Ultrastructural and functional characteristics of rat pituitary cell aggregates. Endocrinology. 110 (2), 513-523 (1982).
- Claes, C., et al. Human stem cell-derived monocytes and microglia-like cells reveal impaired amyloid plaque clearance upon heterozygous or homozygous loss of TREM2. Alzheimer’s and Dementia. 15 (3), 453-464 (2019).
- Trompeter, H. -. I., et al. MicroRNAs miR-26a, miR-26b, and miR-29b accelerate osteogenic differentiation of unrestricted somatic stem cells from human cord blood. BMC Genomics. 14, 111 (2013).
- Suga, H., et al. Self-formation of functional adenohypophysis in three-dimensional culture. Nature. 480 (7375), 57-62 (2011).
- Matsumoto, R., et al. Congenital pituitary hypoplasia model demonstrates hypothalamic OTX2 regulation of pituitary progenitor cells. Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 641-654 (2019).
- Kanie, K., et al. Pathogenesis of anti-PIT-1 antibody syndrome: PIT-1 presentation by HLA class I on anterior pituitary cells. Journal of the Endocrine Society. 3 (11), 1969-1978 (2019).
- Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Yan, H. H. N., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
- Nolan, L. A., Kavanagh, E., Lightman, S. L., Levy, A. Anterior pituitary cell population control: basal cell turnover and the effects of adrenalectomy and dexamethasone treatment. Journal of Neuroendocrinology. 10 (3), 207-215 (1998).
