JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochimica

Förster Resonance Energy Transfer Mapping: een nieuwe methodologie om wereldwijde structurele kenmerken op te helderen

Published: March 16, 2022
doi:
10.3791/63433
, ,
1Molecular Biology and Biochemistry Department,Wesleyan University, 2Molecular Biophysics Program,Wesleyan University

Summary

De studie beschrijft de methodologie van FRET-mapping, inclusief de selectie van etiketteringslocaties, keuze van kleurstoffen, acquisitie en data-analyse. Deze methodologie is effectief bij het bepalen van bindingsplaatsen, conformatieveranderingen en dynamische bewegingen in eiwitsystemen en is het meest nuttig als deze wordt uitgevoerd in combinatie met bestaande 3D-structurele informatie.

Abstract

Förster resonantie energieoverdracht (FRET) is een gevestigde fluorescentie-gebaseerde methode die wordt gebruikt om met succes afstanden in en tussen biomoleculen in vitro en binnen cellen te meten. In FRET heeft de efficiëntie van energieoverdracht, gemeten aan de hand van veranderingen in fluorescentie-intensiteit of levensduur, betrekking op de afstand tussen twee fluorescerende moleculen of labels. Bepaling van dynamica en conformatieveranderingen vanaf de afstanden zijn slechts enkele voorbeelden van toepassingen van deze methode op biologische systemen. Onder bepaalde voorwaarden kan deze methodologie bestaande röntgenkristalstructuren aanvullen en verbeteren door informatie te verstrekken over dynamiek, flexibiliteit en aanpassing aan bindende oppervlakken. We beschrijven het gebruik van FRET en bijbehorende afstandsbepalingen om structurele eigenschappen op te helderen, door de identificatie van een bindingsplaats of de oriëntaties van dimeersubeenheden. Door een verstandige keuze van etiketteringslocaties en vaak het gebruik van meerdere etiketteringsstrategieën, hebben we deze mappingmethoden met succes toegepast om wereldwijde structurele eigenschappen in een eiwit-DNA-complex en het SecA-SecYEG-eiwittranslocatiesysteem te bepalen. In het SecA-SecYEG-systeem hebben we FRET-mappingmethoden gebruikt om de preproteïne-bindingsplaats te identificeren en de lokale conformatie van het gebonden signaalsequentiegebied te bepalen. Deze studie schetst de stappen voor het uitvoeren van FRET-mappingstudies, inclusief identificatie van geschikte etiketteringslocaties, bespreking van mogelijke labels, waaronder niet-inheemse aminozuurresiduen, etiketteringsprocedures, hoe metingen uit te voeren en het interpreteren van de gegevens.

Introduction

Voor eiwitten leidt opheldering van dynamica samen met 3-dimensionale (3D) structurele kennis tot een beter begrip van structuur-functierelaties van biomoleculaire systemen. Structurele methoden, zoals röntgenkristallografie en cryogene elektronenmicroscopie, vangen een statische structuur op en vereisen vaak de bepaling van meerdere structuren om aspecten van biomolecuulbinding en dynamica op te helderen1. In dit artikel wordt een oplossingsgerichte methode besproken voor het in kaart brengen van globale structurele elementen, zoals bindingsplaatsen of bindingsinteracties, die mogelijk meer van voorbijgaande aard zijn en minder gemakkelijk kunnen worden vastgelegd door statische methoden. Sterke kandidaatsystemen voor deze methodologie zijn systemen waarin een 3D-structuur eerder is bepaald door röntgenkristallografie, NMR-spectroscopie of andere structurele methoden. In dit geval maken we gebruik van de röntgenkristalstructuur van het SecA-SecYEG-complex, een centrale speler in de eiwit-algemene secretoire route, om de locatie van een signaalpeptidebindingsplaats in kaart te brengen met behulp van Förster resonantie-energieoverdracht (FRET) voorafgaand aan het transport van het preproteïne over het membraan2. Manipulatie van het biologische systeem door genetische modificaties in combinatie met onze kennis van de 3D-structuur maakte het mogelijk om de conformatie van de signaalsequentie en het vroege volwassen gebied te bepalen onmiddellijk voorafgaand aan het inbrengen in het kanaal 3.

FRET omvat de stralingsloze overdracht van energie van het ene molecuul (donor) naar het andere (acceptor) op een afstandsafhankelijke manier die door de ruimte is 4,5. De efficiëntie van deze overdracht wordt bewaakt door een afname van de donor of een toename van de fluorescentie-intensiteit van de acceptor. De efficiëntie van energieoverdracht kan worden omschreven als

E = R06/(R06 + R6)

waarbij de R0-waarde de afstand is waarop de overdracht 50% efficiënt is6. De techniek is eerder beschreven als een moleculaire liniaal en is effectief in het bepalen van afstanden in het bereik van 2,5-12 nm, afhankelijk van de identiteit van de donor-acceptorkleurstoffen 4,7,8,9. De fluorescentie-intensiteiten en levensduur van de donor met of zonder acceptor maken het mogelijk om de overdrachtsefficiënties en bijgevolg de afstanden 5,8 te bepalen. Vanwege de beschikbaarheid van de technologie, de gevoeligheid van de methode en het gebruiksgemak, heeft FRET ook een brede toepassing gevonden op gebieden als fluorescentiespectroscopie met één molecuul en confocale microscopie6. De komst van fluorescerende eiwitten zoals groen fluorescerend eiwit heeft de waarneming van intracellulaire dynamica en live-cell imaging relatief gemakkelijk gemaakt10,11. Veel FRET-toepassingen zoals deze worden in dit virtuele nummer in detail besproken.

In deze studie richten we ons vooral op het gebruik van FRET-metingen om afstandswaarden te genereren om structurele details te bepalen. Voorheen werden FRET-metingen effectief gebruikt om de conformatie van DNA-moleculen te bepalen wanneer ze gebonden zijn aan eiwit 12,13,14, de interne dynamiek van eiwitten en eiwitbindingsinteracties 15,16,17. De voordelen van deze methode liggen in de mogelijkheid om flexibele en dynamische structurele elementen te bepalen in een oplossing met relatief lage hoeveelheden materiaal. Het is veelzeggend dat deze methode bijzonder effectief is wanneer deze wordt gebruikt in combinatie met bestaande structurele informatie en niet kan worden gebruikt als een middel voor 3D-structuurbepaling. De methode biedt het beste inzicht en de verfijning van de structuur als het werk voortbouwt op bestaande structurele informatie, vaak gekoppeld aan computationele simulatie18,19. Hier wordt het gebruik van afstanden verkregen uit steady-state en time-resolved FRET-metingen beschreven om een bindingsplaats, waarvan de locatie niet bekend was, op een bestaande kristallografische structuur van het SecA-SecYEG-complex, belangrijke eiwitten in de algemene secretoire route 3 in kaart tebrengen.

De algemene secretoire route, een sterk geconserveerd systeem van prokaryoten tot eukaryoten tot archaea, bemiddelt het transport van eiwitten over of in het membraan naar hun functionele locatie in de cel. Voor Gram-negatieve bacteriën, zoals E. coli, het organisme dat in onze studie wordt gebruikt, worden eiwitten ingebracht in of getransloceerd over het binnenmembraan naar het periplasma. Het bacteriële SecY-kanaalcomplex (de translocon genoemd) coördineert met andere eiwitten om het nieuw gesynthetiseerde eiwit te transloceren, dat naar de juiste locatie in de cel wordt geleid via een signaalsequentie die zich meestal bevindt op de N-terminus20,21. Voor eiwitten gebonden aan het periplasma, associeert het ATPase SecA-eiwit zich met de uitgangstunnel van het ribosoom en met het preproteïne nadat ongeveer 100 residuen zijn vertaald22. Samen met het SecB-chaperonne-eiwit houdt het het preproteïne in een ongevouwen toestand. SecA bindt aan de SecYEG-translocon en vergemakkelijkt door vele cycli van ATP-hydrolyse het eiwittransport over het membraan23,24.

SecA is een multi-domein eiwit dat bestaat in cytosolische en membraangebonden vormen. SecA, een homodimeer eiwit in het cytosol, bestaat uit een preproteïnebindend of cross-linking domein25, twee nucleotidebindende domeinen, een spiraalvormig vleugeldomein, een spiraalvormig steigerdomein en de twee helixvingers (THF)26,27,28,29 (figuur 1). In eerdere kristallografische studies van het SecA-SecYEG-complex suggereerde de locatie van de THF dat het actief betrokken was bij eiwittranslocatie en daaropvolgende cross-linking experimenten met het signaalpeptide stelden de betekenis van dit gebied in eiwittranslocatie verder vast30,31. Eerdere studies, met behulp van de FRET-mappingmethodologie, toonden aan dat exogene signaalpeptiden binden aan dit gebied van SecA 2,32. Om de conformatie en locatie van de signaalsequentie en het vroegrijpe gebied van het preproteïne volledig te begrijpen voorafgaand aan het inbrengen in het SecYEG-kanaal, werd een eiwitchimaera gemaakt waarin de signaalsequentie en residuen van het vroegrijpe gebied via een Ser-Gly-linker aan SecA werden bevestigd (figuur 1). Met behulp van dit biologisch levensvatbare construct werd verder aangetoond dat de signaalsequentie en het vroeg volwassen gebied van het preproteïne op een parallelle manier binden aan de THF2. Vervolgens werd de FRET-mappingmethodologie gebruikt om de conformatie en locatie van de signaalsequentie en het vroege volwassen gebied in aanwezigheid van SecYEG op te helderen, zoals hieronder beschreven3.

Kennis van de 3D-structuur van het SecA-SecYEG-complex 33,34,35 en de mogelijke locatie van de bindingsplaats stelde ons in staat om oordeelkundig donor-acceptorlabels te plaatsen op locaties waar de kruising van individuele FRET-afstanden de bindingslocatie identificeert. Deze FRET-mappingmetingen onthulden dat de signaalsequentie en het vroege volwassen gebied van het preproteïne een haarspeld vormen met de punt aan de monding van het SecYEG-kanaal, wat aantoont dat de haarspeldstructuur wordt gesjabloond voorafgaand aan het inbrengen van het kanaal.

Protocol

1. Selectie van etiketteringssites Identificeer ten minste drie potentiële etiketteringsplaatsen om de vermeende bindingsplaats op de bestaande eiwitstructuren te trianguleren. In dit geval werden SecA, SecYEG en preproteïne aan SecA bevestigd door genetische fusie geïdentificeerd2. Kies labelplaatsen binnen 25-75 Å van de vermeende bindingsplaats en in relatief statische gebieden van het eiwit bepaalt de afstand het specifieke FRET-kleurstofpaar dat moet wor…

Representative Results

Deze studie richtte zich op het bepalen van de locatie van de preproteïnebindingsplaats op SecA voorafgaand aan het inbrengen van het preproteïne in het SecYEG-kanaal. Om de bindingsplaats in kaart te brengen, werden FRET-experimenten uitgevoerd tussen verschillende regio’s van het preproteïne en drie verschillende locaties op de SecA- en SecYEG-eiwitten (figuur 1A-D). Uit de verkregen afstanden en driedimensionale structuren van SecA, SecYEG en het prepr…

Discussion

Door het gebruik van de FRET-mappingmethodologie identificeerden we de signaalsequentiebindingsplaats op het SecA-eiwit. Belangrijk is dat de aanwezigheid van een 3D-kristalstructuur van het complex onze studie aanzienlijk vergemakkelijkte. De kracht van deze mappingmethodologie ligt in de mogelijkheid om een bestaande structuur te gebruiken om locaties voor labeling te identificeren. Deze methodologie kan niet worden gebruikt om een 3D-structuur te bepalen; bepaling van structurele elementen56, v…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health grant R15GM135904 (toegekend aan IM) en National Institutes of Health Grant GM110552 (toegekend aan DBO).

Materials

490 nm LED laser Horiba 1684-LED
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide//DIBO Alkyne Life Technologies A20347
Agar Difco DF0812
Alexa Fluor 488 C5 Maleimide/DIBO Alkyne Life Technologies A10254
Alexa Fluor 488 DIBO Alkyne Life Technologies S10904
Alexa Fluor 647 DIBO Alkyne Life Technologies S10906
Amicon Ultra­4 Centrifugal filter (50kDa MWCO) Sigma UFC805008
Dodecylmaltoside (DDM) Anatrace D310
E. coli alkaline phosphatase signal peptide SP22 Biomolecules Midwest N/A Synthesized custom item
extended signal peptide SP41 Biomolecules Midwest N/A Synthesized custom item
FluorEssence Horiba version 2.4 spectral acquisition program for Fluoromax4 spectrofluorometer
Fluoromax 4 spectrofluorometer Horiba N/A
GlobalsWE Laboratory for Fluorescence Dynamics, University of California, Irvine spectral analysis program for time-resolved decays
H­4­Azido­Phe­OH BACHEM 4020250.0001
LB (Miller) Broth Fisher Scientific BP9723
Ludox HS-40 colloidal silica (40 wt.% suspension in H2O) Sigma-Aldrich 420816 dilution is needed to make a proper scattering solution
PTI Felix GX Horiba version 4.1.0.4096 spectral acquisition program for PTI Time Master Instrument
PTI Time Master Instrument Horiba NA
Pymol Molecular Graphics Program Schrodinger version 2.4
Water bath Thermo Scientific NESLAB RTE 10
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Thompson, M. C., Yeates, T. O., Rodriguez, J. A. Advances in methods for atomic resolution macromolecular structure determination. F1000Research. 9, (2020).
  2. Zhang, Q., Li, Y., Olson, R., Mukerji, I., Oliver, D. Conserved SecA signal peptide-binding site revealed by engineered protein chimeras and Forester resonance energy transfer. Biochimica. 55 (9), 1291-1300 (2016).
  3. Zhang, Q., et al. Alignment of the protein substrate hairpin along the SecA two-helix finger primes protein transport in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (35), 9343-9348 (2017).
  4. Stryer, L. Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. Annual Review of Biochemistry. 47, 819-846 (1978).
  5. Lakowicz, J. R. . Principles of Fluorescence Spectroscopy. , (2006).
  6. Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. FRET as a biomolecular research tool – understanding its potential while avoiding pitfalls. Nature Methods. 16 (9), 815-829 (2019).
  7. Magde, D., Wong, R., Seybold, P. G. Fluorescence quantum yields and their relation to lifetimes of rhodamine 6G and fluorescein in nine solvents: improved absolute standards for quantum yields. Photochemistry and Photobiology. 75 (4), 327-334 (2002).
  8. Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids. Methods in Enzymology. 211, 353-388 (1992).
  9. . R0 Values from Some Alexa Fluor Dyes – Table 1.6 Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/molecular-probes-the-handbook/tables/r0-values-for-some-alexa-fluor-dyes.html (2021)
  10. Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs. Sensors. 16 (9), 1488 (2016).
  11. Day, R. N., Davidson, M. W. Fluorescent proteins for FRET microscopy: monitoring protein interactions in living cells. BioEssays : News and Reviews in Molecular, Cellular, and Developmental Biology. 34 (5), 341-350 (2012).
  12. Lee, S. J., Syed, S., Ha, T. Single-Molecule FRET Analysis of Replicative Helicases. Methods in Molecular Biology. 1805, 233-250 (2018).
  13. Uhm, H., Hohng, S. Single-Molecule FRET Assay for Studying Cotranscriptional RNA Folding. Methods in Molecular Biology. 2106, 271-282 (2020).
  14. Globyte, V., Joo, C. Single-molecule FRET studies of Cas9 endonuclease. Methods in Enzymology. 616, 313-335 (2019).
  15. Qiao, Y., Luo, Y., Long, N., Xing, Y., Tu, J. Single-Molecular Förster Resonance Energy Transfer Measurement on Structures and Interactions of Biomolecules. Micromachines. 12 (5), 492 (2021).
  16. Catipovic, M. A., Bauer, B. W., Loparo, J. J., Rapoport, T. A. Protein translocation by the SecA ATPase occurs by a power-stroke mechanism. The EMBO Journal. 38 (9), 101140 (2019).
  17. Seinen, A. B., Spakman, D., van Oijen, A. M., Driessen, A. J. M. Cellular dynamics of the SecA ATPase at the single molecule level. Scientific Reports. 11 (1), 1433 (2021).
  18. Dimura, M., et al. Quantitative FRET studies and integrative modeling unravel the structure and dynamics of biomolecular systems. Current Opinion in Structural Biology. 40, 163-185 (2016).
  19. Kalinin, S., et al. A toolkit and benchmark study for FRET-restrained high-precision structural modeling. Nature Methods. 9 (12), 1218-1225 (2012).
  20. Paetzel, M. Structure and mechanism of Escherichia coli type I signal peptidase. Biochimica et Biophysica Acta. 1843 (8), 1497-1508 (2014).
  21. Ng, D., Brown, J., Walter, P. Signal sequences specify the targeting route to the endoplasmic reticulum membrane. The Journal of Cell Biology. 134 (2), 269-278 (1996).
  22. Huber, D., et al. SecA Cotranslationally Interacts with Nascent Substrate Proteins In Vivo. Journal of Bacteriology. 199 (2), 00622 (2017).
  23. Lill, R., et al. SecA protein hydrolyzes ATP and is an essential component of the protein translocation ATPase of Escherichia coli. The EMBO Journal. 8 (3), 961-966 (1989).
  24. Lill, R., Dowhan, W., Wickner, W. The ATPase activity of SecA is regulated by acidic phospholipids, SecY, and the leader and mature domains of precursor proteins. Cell. 60 (2), 271-280 (1990).
  25. Kimura, E., Akita, M., Matsuyama, S., Mizushima, S. Determination of a region of SecA that interacts with presecretory proteins in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 266 (10), 6600-6606 (1991).
  26. Hunt, J. F., et al. Nucleotide control of interdomain interactions in the conformational reaction cycle of SecA. Science. 297 (5589), 2018-2026 (2002).
  27. Sharma, V., et al. Crystal structure of Mycobacterium tuberculosis SecA, a preprotein tranlsocating ATPase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2243-2248 (2003).
  28. Vassylyev, D., et al. Crystal structure of the translocation ATPase SecA from Thermus thermophilus reveals a parallel, head-to-head dimer. Journal of Molecular Biology. 364 (3), 248-258 (2006).
  29. Zimmer, J., Li, W., Rapoport, T. A. A novel dimer interface and conformational changes revealed by an X-ray structure of B. subtilis SecA. Journal of Molecular Biology. 364 (3), 259-265 (2006).
  30. Zimmer, J., Rapoport, T. A. Conformational flexibility and peptide interaction of the translocation ATPase SecA. Journal of Molecular Biology. 394 (4), 606-612 (2009).
  31. Bauer, B. W., Rapoport, T. A. Mapping polypeptide interactions of the SecA ATPase during translocation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (49), 20800-20805 (2009).
  32. Auclair, S., et al. Mapping of the signal peptide-binding domain of Escherichia coli SecA using Förster resonance energy transfer. Biochimica. 49 (4), 782-792 (2010).
  33. Zimmer, J., Nam, Y., Rapoport, T. A. Structure of a complex of the ATPase SecA and the protein-translocation channel. Nature. 455 (7215), 936-943 (2008).
  34. Li, L., et al. Crystal structure of a substrate-engaged SecY protein-translocation channel. Nature. 531 (7594), 395-399 (2016).
  35. Ma, C., et al. Structure of the substrate-engaged SecA-SecY protein translocation machine. Nature Communications. 10 (1), 2872 (2019).
  36. Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nature Methods. 16 (4), 277-278 (2019).
  37. Jilaveanu, L. B., Oliver, D. In vivo membrane topology of Escherichia coli SecA ATPase reveals extensive periplasmic exposure of multiple functionally important domains clustering on one face of SecA. The Journal of Biological Chemistry. 282 (7), 4661-4668 (2007).
  38. Ramamurthy, V., Oliver, D. Topology of the integral-membrane form of Escherichiacoli SecA protein. The Journal of Biological Chemistry. 272 (37), 23239-23246 (1997).
  39. Chin, J., et al. Addition of p-Azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).
  40. Deiters, A., et al. Adding amino acids with novel reactivity to the genetic code of Saccharomyces cerevisiae. Journal of the American Chemical Society. 125 (39), 11782-11783 (2003).
  41. Lanzetta, P. A., Alvarez, L. J., Reinach, P. S., Candia, O. A. An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate. Analytical Biochemistry. 100 (1), 95-97 (1979).
  42. Mitchell, C., Oliver, D. B. Two distinct ATP-binding domains are needed to promote protein export by Escherichia coli SecA ATPase. Molecular Microbiology. 10 (3), 483-497 (1993).
  43. Thiol-reactive Probe Labeling Protocol. Thermo Fischer Scientific Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/labeling-chemistry-protocols/thiol-reactive-probe-labeling-protocol.html (2021)
  44. Click Chemistry – Section 3.1. Thermo Fischer Scientific Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/molecular-probes-the-handbook/reagents-for-modifying-groups-other-than-thiols-or-amines/click-chemistry.html (2021)
  45. Correction Factor. AAT Bioquest Available from: https://www.aatbio.com/resources/correction-factor/ (2019)
  46. Calculate dye:protein (F/P) molar ratios. Thermo Fischer Scientific Available from: https://tools.thermofischer.com/content/sfs/brochures/TR0031-Calc-FP-rations.pdf (2011)
  47. A Guide to Recording Fluorescence Quantum Yields. Horiba Scientific Available from: https://static.horiba.com/fileadmin/Horiba/Application/Materials/Material_Research/Quantum_Dots/quantumyieldstrad.pdf (2011)
  48. Ivanov, V., Li, M., Mizuuchi, K. Impact of emission anisotropy on fluorescence stectroscopy and FRET distance measurements. Biophysical Journal. 97 (3), 922-929 (2009).
  49. Auclair, S., Oliver, D., Mukerji, I. Defining the solution state dimer structure of Escherichia coli SecA using Forster resonance energy transfer. Biochimica. 52 (14), 2388-2401 (2013).
  50. . The PyMOL Molecular Graphics System, Version 2.4 Available from: https://pymol.org/2/ (2021)
  51. Musial-Siwek, M., Rusch, S. L., Kendall, D. A. Selective photoaffinity labeling identifies the signal peptide binding domain on SecA. Journal of Molecular Biology. 365 (3), 637-648 (2007).
  52. Miller, A., Wang, L., Kendall, D. A. Synthetic signal peptides specifically recognize SecA and stimulate ATPase activity in the absence of preprotein. The Journal of Biological Chemistry. 273 (19), 11409-11412 (1998).
  53. Gelis, I., et al. Structural basis for signal-sequence recognition by the translocase motor SecA as determined by NMR. Cell. 131 (4), 756-769 (2007).
  54. Erlandson, K. J., et al. A role for the two-helix finger of the SecA ATPase in protein translocation. Nature. 455 (7215), 984-988 (2008).
  55. Das, S., Oliver, D. Mapping of the SecA-SecY and SecA-SecG interfaces by site-directed in vivo photocross-linking. The Journal of Biological Chemistry. 286 (14), 12371-12380 (2011).
  56. Wheatley, E. G., Pieniazek, S. N., Vitoc, I., Mukerji, I., Beveridge, D. L. Molecular Dynamics Structure Prediction of a Novel Protein-DNA Complex: Two HU Proteins with a DNA Four-way Junction. Innovations in Biomolecular Modeling and Simulations: Volume 2. , 111-128 (2012).
  57. Vitoc, C. I., Mukerji, I. HU binding to a DNA four-way junction probed by Förster resonance energy transfer. Biochimica. 50 (9), 1432-1441 (2011).
  58. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature Protocols. 2 (8), 1849-1861 (2007).

Tags

Keywords Extracted From The Given Text: FRET MappingLigand Binding SitesSubunit OrientationConformational ChangesDynamic MotionsBiomolecular SystemLabeling SitesR0 ValuesDonor DyeAcceptor DyeSpectrofluorometerEmission ScanExcitation Wavelength
check_url/it/63433?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Northrop, J., Oliver, D. B., Mukerji, I. Förster Resonance Energy Transfer Mapping: A New Methodology to Elucidate Global Structural Features. J. Vis. Exp. (181), e63433, doi:10.3791/63433 (2022).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image