Förster Resonance Energy Transfer Mapping: En ny metode for å belyse globale strukturelle egenskaper

Summary

Studien beskriver metodikken for FRET-kartlegging, inkludert valg av merkingssteder, valg av fargestoffer, innsamling og dataanalyse. Denne metoden er effektiv til å bestemme bindingssteder, konformasjonsendringer og dynamiske bevegelser i proteinsystemer og er mest nyttig hvis den utføres i forbindelse med eksisterende 3-D strukturell informasjon.

Abstract

Förster resonance energy transfer (FRET) er en etablert fluorescensbasert metode som brukes til å måle avstander i og mellom biomolekyler in vitro så vel som i celler. I FRET er effektiviteten av energioverføring, målt ved endringer i fluorescensintensitet eller levetid, relatert til avstanden mellom to fluorescerende molekyler eller etiketter. Bestemmelse av dynamikk og konformasjonsendringer fra avstandene er bare noen eksempler på anvendelser av denne metoden til biologiske systemer. Under visse forhold kan denne metoden legge til og forbedre eksisterende røntgenkrystallstrukturer ved å gi informasjon om dynamikk, fleksibilitet og tilpasning til bindingsflater. Vi beskriver bruken av FRET og tilhørende avstandsbestemmelser for å belyse strukturelle egenskaper, gjennom identifisering av bindingssted eller orientering av dimerunderenheter. Gjennom fornuftig valg av merkingssteder, og ofte bruk av flere merkingsstrategier, har vi med hell brukt disse kartleggingsmetodene for å bestemme globale strukturelle egenskaper i et protein-DNA-kompleks og SecA-SecYEG-proteintranslokasjonssystemet. I SecA-SecYEG-systemet har vi brukt FRET-kartleggingsmetoder for å identifisere preproteinbindingsstedet og bestemme den lokale konformasjonen av det bundne signalsekvensområdet. Denne studien skisserer trinnene for å utføre FRET-kartleggingsstudier, inkludert identifisering av passende merkingssteder, diskusjon av mulige etiketter, inkludert ikke-innfødte aminosyrerester, merkingsprosedyrer, hvordan man utfører målinger og tolkning av dataene.

Introduction

For proteiner fører belysning av dynamikk sammen med 3-dimensjonal (3-D) strukturell kunnskap til en forbedret forståelse av struktur-funksjonsforhold i biomolekylære systemer. Strukturelle metoder, som røntgenkrystallografi og kryogen elektronmikroskopi, fanger opp en statisk struktur og krever ofte bestemmelse av flere strukturer for å belyse aspekter ved biomolekylbinding og dynamikk¹. Denne artikkelen diskuterer en løsningsbasert metode for å kartlegge globale strukturelle elementer, for eksempel bindingssteder eller bindingsinteraksjoner, som potensielt er mer forbigående og mindre enkle å fange opp med statiske metoder. Sterke kandidatsystemer for denne metoden er de der en 3-D-struktur tidligere har blitt bestemt ved røntgenkrystallografi, NMR-spektroskopi eller andre strukturelle metoder. I dette tilfellet utnytter vi røntgenkrystallstrukturen til SecA-SecYEG-komplekset, en sentral aktør i proteinets generelle sekretoriske vei, for å kartlegge plasseringen av et signalpeptidbindingssted ved hjelp av Förster resonansenergioverføring (FRET) før transport av preproteinet over membranen². Manipulering av det biologiske systemet gjennom genetiske modifikasjoner kombinert med vår kunnskap om 3-D-strukturen muliggjorde bestemmelse av konformasjonen av signalsekvensen og tidlig moden region umiddelbart før innsetting i kanal ³.

FRET innebærer strålingsfri overføring av energi fra ett molekyl (donor) til et annet (akseptor) på en avstandsavhengig måte som er gjennom rom ^4,5. Effektiviteten av denne overføringen overvåkes enten gjennom en reduksjon i donor eller en økning i akseptorfluorescensintensitet. Effektiviteten av energioverføring kan beskrives som

E = R₀⁶/(R₀⁶ + R⁶)

der R_0-verdien er avstanden der overføringen er 50% effektiv⁶. Teknikken har tidligere blitt beskrevet som en molekylær linjal og er effektiv til å bestemme avstander i området 2,5-12 nm, avhengig av identiteten til donor-akseptorfargene 4,7,8,9. Donorfluorescensintensiteter og levetider med eller uten akseptor tillater bestemmelse av overføringseffektivitet og følgelig avstander ^5,8. På grunn av tilgjengeligheten av teknologien, metodens følsomhet og brukervennlighet har FRET også funnet bred anvendelse på områder som enkeltmolekylfluorescensspektroskopi og konfokalmikroskopi⁶. Ankomsten av fluorescerende proteiner som grønt fluorescerende protein har gjort observasjonen av intracellulær dynamikk og levende cellebilder relativt^{lettvint 10,11}. Mange FRET-applikasjoner som disse diskuteres i detalj i dette virtuelle problemet.

I denne studien fokuserer vi spesielt på bruk av FRET-målinger for å gi avstandsverdier for å bestemme strukturelle detaljer. Tidligere har FRET-målinger blitt effektivt brukt til å bestemme konformasjonen av DNA-molekyler når de er bundet til protein 12,13,14, den indre dynamikken til proteiner og proteinbindende interaksjoner 15,16,17. Fordelene med denne metoden ligger i evnen til å bestemme fleksible og dynamiske strukturelle elementer i en løsning med relativt lave mengder materiale. Det er viktig å merke seg at denne metoden er spesielt effektiv når den brukes sammen med eksisterende strukturell informasjon og ikke kan brukes som et middel til 3-D strukturbestemmelse. Metoden gir best innsikt og raffinement av struktur hvis arbeidet bygger på eksisterende strukturell informasjon ofte kombinert med beregningssimulering^18,19. Her beskrives bruk av avstander oppnådd fra steady-state og tidsoppløste FRET-målinger for å kartlegge et bindingssted, hvis plassering ikke var kjent, på en eksisterende krystallografisk struktur av SecA-SecYEG-komplekset, store proteiner i den generelle sekretoriske banen³.

Den generelle sekretoriske banen, et svært konservert system fra prokaryoter til eukaryoter til archaea, formidler transport av proteiner enten over eller inn i membranen til deres arbeidssted i cellen. For gramnegative bakterier, som E. coli, organismen som ble brukt i vår studie, blir proteiner satt inn i eller translokert over den indre membranen til periplasma. Det bakterielle SecY-kanalkomplekset (kalt transloconet) koordinerer med andre proteiner for å translokere det nylig syntetiserte proteinet, som er rettet mot sin korrekte plassering i cellen gjennom en signalsekvens som vanligvis ligger ved N-terminalen^20,21. For proteiner bundet til periplasma assosierer ATPase SecA-proteinet med utgangstunnelen til ribosomet, og med preproteinet etter at ca. 100 rester er oversatt²². Sammen med SecB chaperone-proteinet opprettholder det preproteinet i en utfoldet tilstand. SecA binder seg til SecYEG-transloconet, og gjennom mange sykluser av ATP-hydrolyse letter proteintransport over membranen^23,24.

SecA er et multi-domene protein som finnes i cytosoliske og membranbundne former. Et homodimert protein i cytosolen, SecA, består av et preproteinbindende eller tverrbindende domene²⁵, to nukleotidbindende domener, et spiralformet vingedomene, et spiralformet stillasdomene og de to helixfingeren (THF)26,27,28,29 (figur 1). I tidligere krystallografiske studier av SecA-SecYEG-komplekset antydet plasseringen av THF at den var aktivt involvert i proteintranslokasjon og påfølgende tverrbindingseksperimenter med signalpeptidet etablerte videre betydningen av denne regionen i proteintranslokasjon^30,31. Tidligere studier, ved hjelp av FRET-kartleggingsmetodikken, viste at eksogene signalpeptider binder seg til denne regionen av SecA ^2,32. For fullt ut å forstå konformasjonen og plasseringen av signalsekvensen og den tidlig modne regionen av preproteinet før innsetting i SecYEG-kanalen, ble det opprettet en proteinkimera der signalsekvensen og restene av den tidlige modne regionen ble festet til SecA gjennom en Ser-Gly-linker (figur 1). Ved hjelp av denne biologisk levedyktige konstruksjonen ble det videre demonstrert at signalsekvensen og den tidlig modne regionen av preproteinet binder seg til THF på en parallell måte². Deretter ble FRET-kartleggingsmetoden brukt til å belyse konformasjonen og plasseringen av signalsekvensen og tidlig moden region i nærvær av SecYEG som beskrevet nedenfor³.

Kunnskap om 3D-strukturen til SecA-SecYEG-komplekset 33,34,35 og den mulige plasseringen av bindingsstedet tillot oss å plassere donor-akseptoretiketter på steder der skjæringspunktet mellom individuelle FRET-avstander identifiserer bindingsstedets plassering. Disse FRET-kartleggingsmålingene viste at signalsekvensen og den tidlige modne regionen av preproteinet danner en hårnål med spissen plassert ved munningen av SecYEG-kanalen, noe som viser at hårnålstrukturen er mal før kanalinnsetting.

Protocol

1. Valg av merkesteder Identifiser minst tre potensielle merkingssteder for å triangulere det antatte bindingsstedet på eksisterende proteinstrukturer. I dette tilfellet ble SecA, SecYEG og preprotein festet til SecA gjennom genetisk fusjon identifisert2. Velg merkesteder innen 25-75 Å fra det antatte bindingsstedet og i relativt statiske områder av proteinet, vil avstanden bestemme det spesifikke FRET-fargestoffparet som skal brukes36…

Representative Results

Denne studien fokuserte på å bestemme plasseringen av preproteinbindingsstedet på SecA før innsetting av preproteinet i SecYEG-kanalen. For å kartlegge bindingsstedet ble det utført FRET-eksperimenter mellom forskjellige regioner av preproteinet og tre forskjellige steder på SecA- og SecYEG-proteinene (figur 1A-D). Fra avstandene som er oppnådd og tredimensjonale strukturer av SecA, SecYEG og preproteinet, ble plasseringen av preproteinbindingsstedet…

Discussion

Gjennom bruk av FRET-kartleggingsmetodikken identifiserte vi signalsekvensbindingsstedet på SecA-proteinet. Det er viktig at tilstedeværelsen av en 3-D krystallstruktur av komplekset i stor grad lettet vår studie. Styrken til denne kartleggingsmetodikken ligger i evnen til å bruke en eksisterende struktur for å identifisere steder for merking. Denne metoden kan ikke brukes til å bestemme en 3D-struktur; Imidlertid er bestemmelse av strukturelle elementer⁵⁶, forfining av en eksisterende struk…

Materials

490 nm LED laser	Horiba	1684-LED
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide//DIBO Alkyne	Life Technologies	A20347
Agar	Difco	DF0812
Alexa Fluor 488 C5 Maleimide/DIBO Alkyne	Life Technologies	A10254
Alexa Fluor 488 DIBO Alkyne	Life Technologies	S10904
Alexa Fluor 647 DIBO Alkyne	Life Technologies	S10906
Amicon Ultra­4 Centrifugal filter (50kDa MWCO)	Sigma	UFC805008
Dodecylmaltoside (DDM)	Anatrace	D310
E. coli alkaline phosphatase signal peptide SP22	Biomolecules Midwest	N/A	Synthesized custom item
extended signal peptide SP41	Biomolecules Midwest	N/A	Synthesized custom item
FluorEssence	Horiba	version 2.4	spectral acquisition program for Fluoromax4 spectrofluorometer
Fluoromax 4 spectrofluorometer	Horiba	N/A
GlobalsWE	Laboratory for Fluorescence Dynamics, University of California, Irvine		spectral analysis program for time-resolved decays
H­4­Azido­Phe­OH	BACHEM	4020250.0001
LB (Miller) Broth	Fisher Scientific	BP9723
Ludox HS-40 colloidal silica (40 wt.% suspension in H2O)	Sigma-Aldrich	420816	dilution is needed to make a proper scattering solution
PTI Felix GX	Horiba	version 4.1.0.4096	spectral acquisition program for PTI Time Master Instrument
PTI Time Master Instrument	Horiba	NA
Pymol Molecular Graphics Program	Schrodinger	version 2.4
Water bath	Thermo Scientific	NESLAB RTE 10