Lo studio descrive in dettaglio la metodologia della mappatura FRET, compresa la selezione dei siti di etichettatura, la scelta dei coloranti, l'acquisizione e l'analisi dei dati. Questa metodologia è efficace nel determinare i siti di legame, i cambiamenti conformazionali e i movimenti dinamici nei sistemi proteici ed è più utile se eseguita in combinazione con le informazioni strutturali 3D esistenti.
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Articolo metodologico
Förster Resonance Energy Transfer Mapping: una nuova metodologia per chiarire le caratteristiche strutturali globali
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) è un metodo consolidato basato sulla fluorescenza utilizzato per misurare con successo le distanze all'interno e tra le biomolecole in vitro e all'interno delle cellule. In FRET, l'efficienza del trasferimento di energia, misurata dalle variazioni dell'intensità di fluorescenza o della durata, si riferisce alla distanza tra due molecole o etichette fluorescenti. Determinazione della dinamica e cambiamenti conformazionali dalle distanze sono solo alcuni esempi di applicazioni di questo metodo ai sistemi biologici. In determinate condizioni, questa metodologia può aggiungere e migliorare le strutture cristalline a raggi X esistenti fornendo informazioni riguardanti la dinamica, la flessibilità e l'adattamento alle superfici di legame. Descriviamo l'uso di FRET e le determinazioni della distanza associate per chiarire le proprietà strutturali, attraverso l'identificazione di un sito di legame o gli orientamenti delle subunità dimeri. Attraverso una scelta giudiziosa dei siti di etichettatura e spesso l'impiego di più strategie di etichettatura, abbiamo applicato con successo questi metodi di mappatura per determinare le proprietà strutturali globali in un complesso proteina-DNA e il sistema di traslocazione proteica SecA-SecYEG. Nel sistema SecA-SecYEG, abbiamo utilizzato metodi di mappatura FRET per identificare il sito di legame preproteico e determinare la conformazione locale della regione della sequenza del segnale legato. Questo studio delinea i passaggi per l'esecuzione di studi di mappatura FRET, tra cui l'identificazione di siti di etichettatura appropriati, la discussione di possibili etichette tra cui residui di amminoacidi non nativi, procedure di etichettatura, come eseguire misurazioni e interpretare i dati.
Introduzione
Per le proteine, la delucidazione della dinamica insieme alla conoscenza strutturale tridimensionale (3-D) porta a una migliore comprensione delle relazioni struttura-funzione dei sistemi biomolecolari. I metodi strutturali, come la cristallografia a raggi X e la microscopia elettronica criogenica, catturano una struttura statica e spesso richiedono la determinazione di più strutture per chiarire gli aspetti del legame e della dinamica delle biomolecole1. In questo articolo viene descritto un metodo basato su soluzione per la mappatura di elementi strutturali globali, ad esempio siti di associazione o interazioni di associazione, potenzialmente....
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Protocollo
1. Selezione dei siti di etichettatura
- Identificare almeno tre potenziali siti di etichettatura per triangolare il presunto sito di legame sulle strutture proteiche esistenti. In questo caso, SecA, SecYEG e preproteina attaccate alla SecA attraverso la fusione genetica sono state identificate2.
- Scegliere i siti di etichettatura entro 25-75 Å dal sito di legame putativo e nelle regioni relativamente statiche della proteina, la distanza determinerà la coppia di coloranti FRET specifica da utilizzare36. Individuare i siti di etichettatura in regioni proteiche che sono relativamente distint....
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Risultati
Questo studio si è concentrato sulla determinazione della posizione del sito di legame preproteico su SecA prima dell'inserimento della preproteina nel canale SecYEG. Per mappare il sito di legame, sono stati eseguiti esperimenti FRET tra diverse regioni della preproteina e tre posizioni distinte sulle proteine SecA e SecYEG (Figura 1A-D). Dalle distanze ottenute e dalle strutture tridimensionali di SecA, SecYEG e della preproteina, è stata prevista la posiz.......
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Discussione
Attraverso l'uso della metodologia di mappatura FRET, abbiamo identificato il sito di legame della sequenza di segnale sulla proteina SecA. È importante sottolineare che la presenza di una struttura cristallina 3D del complesso ha notevolmente facilitato il nostro studio. La forza di questa metodologia di mappatura risiede nella capacità di utilizzare una struttura esistente per identificare le posizioni per l'etichettatura. Questa metodologia non può essere utilizzata per determinare una struttura 3D; tuttavia, la deter.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione R15GM135904 del National Institutes of Health (assegnata all'IM) e dalla sovvenzione GM110552 del National Institutes of Health (assegnata al DBO).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 490 nm LED laser | Horiba | 1684-LED | |
| Alexa Fluor 647 C2 Maleimide//DIBO Alkyne | Life Technologies | A20347 | |
| Agar | Difco | DF0812 | |
| Alexa Fluor 488 C5 Maleimide/DIBO Alkyne | Life Technologies | A10254 | |
| Alexa Fluor 488 DIBO Alkyne | Life Technologies | S10904 | |
| Alexa Fluor 647 DIBO Alkyne | Life Technologies | S10906 | |
| Amicon Ultra 4 Filtro centrifugo (50kDa MWCO) | Sigma | UFC805008 | |
| Dodecilmaltoside (DDM) | Anatrace | D310 | |
| E. coli peptide del segnale della fosfatasi alcalina SP22 | Biomolecole Midwest | N/A | Sintetizzato oggetto personalizzato |
| peptide del segnale esteso SP41 | Biomolecole Midwest | N/A | Sintetizzato oggetto personalizzato |
| FluorEssence | Horiba | versione 2.4 | per spettrofluorimetro Fluoromax4 |
| Spettrofluorimetro Fluoromax 4 | Horiba | N/A | |
| GlobalsWE | Laboratory for Fluorescence Dynamics, University of California, Irvine | programma di analisi spettrale per decadimenti risolti nel tempo | |
| H 4&timido; Azido&timido; Phe OH | BACHEM | 4020250.0001 | |
| LB (Miller) Brodo | Fisher Scientific | BP9723 | |
| Ludox HS-40 silice colloidale (40% in peso di sospensione in H2O) | Sigma-Aldrich | 420816 | diluizione è necessaria per creare una soluzione di diffusione adeguata |
| PTI Felix GX | Horiba | versione 4.1.0.4096 | programma di acquisizione spettrale per PTI Time Master Instrument |
| PTI Time Master Strumento | Horiba | NA | |
| Pymol Programma di Grafica Molecolare | Schrödinger | versione 2.4 | |
| Bagno d'acqua | Thermo Scientific | NESLAB RTE 10 |
Riferimenti
- Thompson, M. C., Yeates, T. O., Rodriguez, J. A. Advances in methods for atomic resolution macromolecular structure determination. F1000Research. 9, (2020).
- Zhang, Q., Li, Y., Olson, R., Mukerji, I., Oliver, D. Cons....
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Ristampe e permessi
