Undersøgelsen beskriver metoden til FRET-kortlægning, herunder valg af mærkningssteder, valg af farvestoffer, erhvervelse og dataanalyse. Denne metode er effektiv til bestemmelse af bindingssteder, konformationsændringer og dynamiske bevægelser i proteinsystemer og er mest nyttig, hvis den udføres sammen med eksisterende 3D-strukturelle oplysninger.
Förster resonans energioverførsel (FRET) er en etableret fluorescensbaseret metode, der anvendes til succesfuldt at måle afstande i og mellem biomolekyler in vitro såvel som i celler. I FRET vedrører effektiviteten af energioverførsel, målt ved ændringer i fluorescensintensitet eller levetid, afstanden mellem to fluorescerende molekyler eller etiketter. Bestemmelse af dynamik og konformationsændringer fra afstandene er blot nogle eksempler på anvendelser af denne metode til biologiske systemer. Under visse omstændigheder kan denne metode tilføje til og forbedre eksisterende røntgenkrystalstrukturer ved at give information om dynamik, fleksibilitet og tilpasning til bindende overflader. Vi beskriver brugen af FRET og tilhørende afstandsbestemmelse til at belyse strukturelle egenskaber gennem identifikation af et bindingssted eller orienteringen af dimerunderenheder. Gennem velovervejet valg af mærkningssteder og ofte anvendelse af flere mærkningsstrategier har vi med succes anvendt disse kortlægningsmetoder til at bestemme globale strukturelle egenskaber i et protein-DNA-kompleks og SecA-SecYEG-proteintranslokationssystemet. I SecA-SecYEG-systemet har vi brugt FRET-kortlægningsmetoder til at identificere præproteinbindingsstedet og bestemme den lokale konformation af det bundne signalsekvensområde. Denne undersøgelse skitserer trinene til udførelse af FRET-kortlægningsundersøgelser, herunder identifikation af passende mærkningssteder, diskussion af mulige etiketter, herunder ikke-indfødte aminosyrerester, mærkningsprocedurer, hvordan man udfører målinger og fortolkning af dataene.
For proteiner fører belysning af dynamik sammen med 3-dimensionel (3-D) strukturel viden til en forbedret forståelse af struktur-funktionsforhold mellem biomolekylære systemer. Strukturelle metoder, såsom røntgenkrystallografi og kryogen elektronmikroskopi, fanger en statisk struktur og kræver ofte bestemmelse af flere strukturer for at belyse aspekter af biomolekylebinding og dynamik1. Denne artikel diskuterer en løsningsbaseret metode til kortlægning af globale strukturelle elementer, såsom bindingssteder eller bindingsinteraktioner, der potentielt er mere forbigående og mindre lette at fange ved statiske metoder. Stærke kandidatsystemer til denne metode er dem, hvor en 3D-struktur tidligere er blevet bestemt ved røntgenkrystallografi, NMR-spektroskopi eller andre strukturelle metoder. I dette tilfælde udnytter vi røntgenkrystalstrukturen i SecA-SecYEG-komplekset, en central aktør i proteinets generelle sekretoriske vej, til at kortlægge placeringen af et signalpeptidbindingssted ved hjælp af Förster resonansenergioverførsel (FRET) inden transport af præproteinet over membranen2. Manipulation af det biologiske system gennem genetiske modifikationer kombineret med vores viden om 3D-strukturen muliggjorde bestemmelsen af konformationen af signalsekvensen og det tidlige modne område umiddelbart før indsættelse i kanal 3.
FRET involverer strålingsfri overførsel af energi fra et molekyle (donor) til et andet (acceptor) på en afstandsafhængig måde, der er gennem rum 4,5. Effektiviteten af denne overførsel overvåges gennem enten et fald i donor eller en stigning i acceptorfluorescensintensitet. Effektiviteten af energioverførsel kan beskrives som
E = R06/(R06 + R6)
hvor R0-værdien er den afstand, hvor overførslen er 50% effektiv6. Teknikken er tidligere blevet beskrevet som en molekylær lineal og er effektiv til at bestemme afstande i området 2,5-12 nm, afhængigt af identiteten af donoracceptorfarvestofferne 4,7,8,9. Donorfluorescensensensiteterne og levetiderne med eller uden acceptor gør det muligt at bestemme overførselseffektiviteten og dermed afstande 5,8. På grund af teknologiens tilgængelighed, metodens følsomhed og brugervenlighed har FRET også fundet bred anvendelse på områder som enkeltmolekyle fluorescensspektroskopi og konfokal mikroskopi6. Fremkomsten af fluorescerende proteiner såsom grønt fluorescerende protein har gjort observationen af intracellulær dynamik og levende celledannelse relativt letkøbt10,11. Mange FRET-applikationer som disse diskuteres detaljeret i dette virtuelle nummer.
I denne undersøgelse fokuserer vi især på brugen af FRET-målinger til at give afstandsværdier til bestemmelse af strukturelle detaljer. Tidligere er FRET-målinger blevet anvendt effektivt til at bestemme konformationen af DNA-molekyler, når de er bundet til protein 12,13,14, proteiners indre dynamik og proteinbindingsinteraktioner 15,16,17. Fordelene ved denne metode ligger i evnen til at bestemme fleksible og dynamiske strukturelle elementer i en løsning med relativt lave mængder materiale. Det er vigtigt, at denne metode er særlig effektiv, når den anvendes sammen med eksisterende strukturelle oplysninger og ikke kan bruges som et middel til bestemmelse af 3D-struktur. Metoden giver den bedste indsigt og forfinelse af struktur, hvis arbejdet bygger på eksisterende strukturelle oplysninger ofte kombineret med beregningssimulering18,19. Her beskrives brugen af afstande opnået fra steady-state og tidsopløste FRET-målinger til at kortlægge et bindingssted, hvis placering ikke var kendt, på en eksisterende krystallografisk struktur af SecA-SecYEG-komplekset, større proteiner i den generelle sekretoriske vej3.
Den generelle sekretoriske vej, et stærkt bevaret system fra prokaryoter til eukaryoter til arkæer, formidler transporten af proteiner enten over eller ind i membranen til deres funktionelle placering i cellen. For gramnegative bakterier, såsom E. coli, den organisme, der anvendes i vores undersøgelse, indsættes proteiner i eller translokeres over den indre membran til periplasmen. Det bakterielle SecY-kanalkompleks (kaldet translocon) koordinerer med andre proteiner for at translokere det nyligt syntetiserede protein, som er rettet mod dets korrekte placering i cellen gennem en signalsekvens, der typisk er placeret ved N-terminalen20,21. For proteiner bundet til periplasmen associeres ATPase SecA-proteinet med ribosomets udgangstunnel og med præproteinet, efter at ca. 100 rester er blevet oversat22. Sammen med SecB chaperone-proteinet opretholder det præproteinet i en udfoldet tilstand. SecA binder sig til SecYEG-translocon og letter gennem mange cyklusser af ATP-hydrolyse proteintransport over membranen23,24.
SecA er et multidomæneprotein, der findes i cytosoliske og membranbundne former. Et homodimerisk protein i cytosolen, SecA består af et præproteinbindende eller tværbindende domæne25, to nukleotidbindende domæner, et spiralformet vingedomæne, et spiralformet stilladsdomæne og to helixfinger (THF)26,27,28,29 (figur 1). I tidligere krystallografiske undersøgelser af SecA-SecYEG-komplekset antydede placeringen af THF, at det var aktivt involveret i proteintranslokation, og efterfølgende tværbindingseksperimenter med signalpeptidet fastslog yderligere betydningen af denne region i proteintranslokation30,31. Tidligere undersøgelser ved hjælp af FRET-kortlægningsmetoden viste, at eksogene signalpeptider binder til denne region af SecA 2,32. For fuldt ud at forstå konformationen og placeringen af signalsekvensen og den tidlige modne region af præproteinet inden indsættelse i SecYEG-kanalen blev der oprettet en proteinkimera, hvor signalsekvensen og resterne fra det tidlige modne område blev fastgjort til SecA gennem en Ser-Gly-linker (figur 1). Ved hjælp af denne biologisk levedygtige konstruktion blev det yderligere demonstreret, at signalsekvensen og den tidlige modne region af præproteinet binder til THF på en parallel måde2. Efterfølgende blev FRET-kortlægningsmetoden brugt til at belyse konformationen og placeringen af signalsekvensen og det tidlige modne område i nærværelse af SecYEG som beskrevet nedenfor3.
Kendskab til 3D-strukturen i SecA-SecYEG-komplekset 33,34,35 og den mulige placering af bindingsstedet gjorde det muligt for os med omtanke at placere donor-acceptor-etiketter på steder, hvor skæringspunktet mellem individuelle FRET-afstande identificerer bindingsstedets placering. Disse FRET-kortlægningsmålinger afslørede, at signalsekvensen og det tidlige modne område af præproteinet danner en hårnål med spidsen placeret ved mundingen af SecYEG-kanalen, hvilket viser, at hårnålstrukturen er skabeloniseret før kanalindsættelse.
Ved hjælp af FRET-kortlægningsmetoden identificerede vi signalsekvensbindingsstedet på SecA-proteinet. Det er vigtigt, at tilstedeværelsen af en 3-D krystalstruktur af komplekset i høj grad lettede vores undersøgelse. Styrken ved denne kortlægningsmetode ligger i evnen til at bruge en eksisterende struktur til at identificere steder til mærkning. Denne metode kan ikke bruges til at bestemme en 3D-struktur; bestemmelse af strukturelle elementer56, forfining af en eksisterende struktur<sup c…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health grant R15GM135904 (tildelt IM) og National Institutes of Health Grant GM110552 (tildelt DBO).
490 nm LED laser | Horiba | 1684-LED | |
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide//DIBO Alkyne | Life Technologies | A20347 | |
Agar | Difco | DF0812 | |
Alexa Fluor 488 C5 Maleimide/DIBO Alkyne | Life Technologies | A10254 | |
Alexa Fluor 488 DIBO Alkyne | Life Technologies | S10904 | |
Alexa Fluor 647 DIBO Alkyne | Life Technologies | S10906 | |
Amicon Ultra4 Centrifugal filter (50kDa MWCO) | Sigma | UFC805008 | |
Dodecylmaltoside (DDM) | Anatrace | D310 | |
E. coli alkaline phosphatase signal peptide SP22 | Biomolecules Midwest | N/A | Synthesized custom item |
extended signal peptide SP41 | Biomolecules Midwest | N/A | Synthesized custom item |
FluorEssence | Horiba | version 2.4 | spectral acquisition program for Fluoromax4 spectrofluorometer |
Fluoromax 4 spectrofluorometer | Horiba | N/A | |
GlobalsWE | Laboratory for Fluorescence Dynamics, University of California, Irvine | spectral analysis program for time-resolved decays | |
H4AzidoPheOH | BACHEM | 4020250.0001 | |
LB (Miller) Broth | Fisher Scientific | BP9723 | |
Ludox HS-40 colloidal silica (40 wt.% suspension in H2O) | Sigma-Aldrich | 420816 | dilution is needed to make a proper scattering solution |
PTI Felix GX | Horiba | version 4.1.0.4096 | spectral acquisition program for PTI Time Master Instrument |
PTI Time Master Instrument | Horiba | NA | |
Pymol Molecular Graphics Program | Schrodinger | version 2.4 | |
Water bath | Thermo Scientific | NESLAB RTE 10 |