JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochimica

Картирование резонансного переноса энергии Фёрстера: новая методология для выяснения глобальных структурных особенностей

Published: March 16, 2022
doi:
10.3791/63433
, ,
1Molecular Biology and Biochemistry Department,Wesleyan University, 2Molecular Biophysics Program,Wesleyan University

Summary

В исследовании подробно описывается методология картирования FRET, включая выбор мест маркировки, выбор красителей, сбор и анализ данных. Эта методология эффективна при определении сайтов связывания, конформационных изменений и динамических движений в белковых системах и наиболее полезна, если выполняется в сочетании с существующей 3-D структурной информацией.

Abstract

Резонансный перенос энергии Фёрстера (FRET) является признанным методом на основе флуоресценции, используемым для успешного измерения расстояний внутри и между биомолекулами in vitro , а также внутри клеток. В FRET эффективность передачи энергии, измеряемая изменениями интенсивности флуоресценции или времени жизни, относится к расстоянию между двумя флуоресцентными молекулами или метками. Определение динамики и конформационных изменений с расстояний является лишь некоторыми примерами применения этого метода к биологическим системам. При определенных условиях эта методология может дополнять и улучшать существующие рентгеновские кристаллические структуры, предоставляя информацию о динамике, гибкости и адаптации к связывающим поверхностям. Мы описываем использование FRET и связанных с ним определений расстояний для выяснения структурных свойств путем идентификации сайта связывания или ориентации субъединиц димера. Благодаря разумному выбору сайтов маркировки и часто использованию нескольких стратегий маркировки, мы успешно применили эти методы картирования для определения глобальных структурных свойств в комплексе белок-ДНК и системе транслокации белка SecA-SecYEG. В системе SecA-SecYEG мы использовали методы картирования FRET для идентификации сайта препротеин-связывания и определения локальной конформации области связанной последовательности сигналов. В этом исследовании описываются этапы выполнения картографических исследований FRET, включая идентификацию соответствующих мест маркировки, обсуждение возможных этикеток, включая ненативные аминокислотные остатки, процедуры маркировки, как выполнять измерения и интерпретацию данных.

Introduction

Для белков выяснение динамики наряду с 3-мерными (3-D) структурными знаниями приводит к лучшему пониманию структурно-функциональных отношений биомолекулярных систем. Структурные методы, такие как рентгеновская кристаллография и криогенная электронная микроскопия, захватывают статическую структуру и часто требуют определения нескольких структур для выяснения аспектов связывания биомолекул и динамики1. В этой статье обсуждается основанный на решении метод отображения глобальных структурных элементов, таких как сайты связывания или взаимодействия привязки, которые потенциально более преходящи и менее легко захватываются статическими методами. Сильными системами-кандидатами для этой методологии являются те, в которых 3D-структура была ранее определена рентгеновской кристаллографией, ЯМР-спектроскопией или другими структурными методами. В этом случае мы используем рентгеновскую кристаллическую структуру комплекса SecA-SecYEG, центрального игрока в общем секреторном пути белка, для отображения местоположения сайта связывания сигнального пептида с использованием резонансного переноса энергии Фёрстера (FRET) до переноса препротеина через мембрану2. Манипулирование биологической системой с помощью генетических модификаций в сочетании с нашими знаниями о 3D-структуре позволило определить конформацию сигнальной последовательности и ранней зрелой области непосредственно перед введением в канал 3.

FRET включает в себя безрадиационную передачу энергии от одной молекулы (донора) к другой (акцептору) в зависимости от расстояния, то есть через пространство 4,5. Эффективность этого переноса контролируется либо через уменьшение донора, либо через увеличение интенсивности акцепторной флуоресценции. Эффективность передачи энергии можно охарактеризовать как

E = R06/(R06 + R6)

в котором значение R0 — это расстояние, на котором передача эффективна на 50%6. Методика ранее была описана как молекулярная линейка и эффективна при определении расстояний в диапазоне 2,5-12 нм в зависимости от идентичности донор-акцепторных красителей 4,7,8,9. Интенсивность и срок службы донорской флуоресценции с акцептором или без него позволяют определить эффективность переноса и, следовательно, расстояния 5,8. Благодаря доступности технологии, чувствительности метода и простоте использования, FRET также нашел широкое применение в таких областях, как одномолекулярная флуоресцентная спектроскопия и конфокальная микроскопия6. Появление флуоресцентных белков, таких как зеленый флуоресцентный белок, сделало наблюдение за внутриклеточной динамикой и визуализацией живых клеток относительно легким10,11. Многие приложения FRET, подобные этим, подробно обсуждаются в этом виртуальном выпуске.

В этом исследовании мы уделяем особое внимание использованию измерений FRET для получения значений расстояния для определения структурных деталей. Ранее измерения FRET эффективно использовались для определения конформации молекул ДНК при связывании с белком 12,13,14, внутренней динамики белков и белковосвязывающих взаимодействий 15,16,17. Преимущества этого метода заключаются в возможности определения гибких и динамичных конструктивных элементов в растворе с относительно небольшим количеством материала. Примечательно, что этот метод особенно эффективен при использовании в сочетании с существующей структурной информацией и не может быть использован в качестве средства определения 3D-структуры. Метод обеспечивает наилучшее понимание и уточнение структуры, если работа основывается на существующей структурной информации, часто в сочетании с вычислительным моделированием18,19. Здесь описано использование расстояний, полученных из стационарных и разрешенных по времени измерений FRET, для картирования сайта связывания, местоположение которого не было известно, на существующей кристаллографической структуре комплекса SecA-SecYEG основных белков в общем секреторном пути3.

Общий секреторный путь, высококонсервативная система от прокариот до эукариот и архей, опосредует транспорт белков либо через мембрану, либо в мембрану к их функциональному расположению в клетке. Для грамотрицательных бактерий, таких как E. coli, организма, используемого в нашем исследовании, белки вставляются или перемещаются через внутреннюю мембрану в периплазму. Бактериальный комплекс каналов SecY (называемый транслоконом) координируется с другими белками для перемещения вновь синтезированного белка, который направляется к его правильному расположению в клетке через сигнальную последовательность, обычно расположенную на N-конце20,21. Для белков, связанных с периплазмой, белок АТФазы SecA связывается с выходным туннелем рибосомы и с препротеином после того, как приблизительно 100 остатков были переведены22. Наряду с белком шаперона SecB он поддерживает препротеин в развернутом состоянии. SecA связывается с транслоконом SecYEG и через многие циклы гидролиза АТФ облегчает транспорт белка через мембрану23,24.

SecA представляет собой многодоменный белок, который существует в цитозольной и мембраносвязанной формах. Гомодимерный белок в цитозоле, SecA состоит из препротеин-связывающего или сшивающего домена25, двух нуклеотид-связывающих доменов, спирального домена крыла, спирального каркасного домена и двух спиральных пальцев (THF)26,27,28,29 (Рисунок 1). В предыдущих кристаллографических исследованиях комплекса SecA-SecYEG расположение ТГФ предполагало, что он активно участвовал в транслокации белка, а последующие эксперименты по сшиванию с сигнальным пептидом дополнительно установили значение этой области в транслокации белка 30,31. Предыдущие исследования с использованием методологии картирования FRET показали, что экзогенные сигнальные пептиды связываются с этой областью SecA 2,32. Чтобы полностью понять конформацию и местоположение сигнальной последовательности и ранней зрелой области препротеина до вставки в канал SecYEG, была создана белковая химера, в которой сигнальная последовательность и остатки ранней зрелой области были прикреплены к SecA через линкер Ser-Gly (рисунок 1). Используя эту биологически жизнеспособную конструкцию, было дополнительно продемонстрировано, что сигнальная последовательность и ранняя зрелая область препротеина связываются с ТГФ параллельным образом2. Впоследствии методология картирования FRET была использована для выяснения конформации и местоположения последовательности сигналов и ранней зрелой области в присутствии SecYEG, как описано ниже3.

Знание 3-D структуры комплекса SecA-SecYEG 33,34,35 и возможного местоположения места связывания позволило нам разумно разместить донорско-акцепторные этикетки в местах, где пересечение отдельных расстояний FRET определяет местоположение места связывания. Эти измерения картирования FRET показали, что последовательность сигналов и ранняя зрелая область препротеина образуют шпильку с наконечником, расположенным в устье канала SecYEG, демонстрируя, что структура шпильки шаблонизируется до вставки канала.

Protocol

1. Подбор сайтов маркировки Определите по меньшей мере три потенциальных участка маркировки для триангуляции предполагаемого сайта связывания на существующих белковых структурах. В этом случае были идентифицированы SecA, SecYEG и препротеин, присоединенный к SecA посредством …

Representative Results

Это исследование было сосредоточено на определении местоположения сайта связывания препротеинов на SecA до введения препротеина в канал SecYEG. Чтобы отобразить место связывания, эксперименты FRET проводились между различными областями препротеина и тремя различными местами на белках SecA и…

Discussion

Используя методологию картирования FRET, мы идентифицировали сайт связывания сигнальной последовательности на белке SecA. Важно отметить, что наличие 3-D кристаллической структуры комплекса значительно облегчило наше исследование. Сила этой методологии картографирования заключается в с…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана грантом Национальных институтов здравоохранения R15GM135904 (присуждается IM) и грантом Национальных институтов здравоохранения GM110552 (присуждается DBO).

Materials

490 nm LED laser Horiba 1684-LED
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide//DIBO Alkyne Life Technologies A20347
Agar Difco DF0812
Alexa Fluor 488 C5 Maleimide/DIBO Alkyne Life Technologies A10254
Alexa Fluor 488 DIBO Alkyne Life Technologies S10904
Alexa Fluor 647 DIBO Alkyne Life Technologies S10906
Amicon Ultra­4 Centrifugal filter (50kDa MWCO) Sigma UFC805008
Dodecylmaltoside (DDM) Anatrace D310
E. coli alkaline phosphatase signal peptide SP22 Biomolecules Midwest N/A Synthesized custom item
extended signal peptide SP41 Biomolecules Midwest N/A Synthesized custom item
FluorEssence Horiba version 2.4 spectral acquisition program for Fluoromax4 spectrofluorometer
Fluoromax 4 spectrofluorometer Horiba N/A
GlobalsWE Laboratory for Fluorescence Dynamics, University of California, Irvine spectral analysis program for time-resolved decays
H­4­Azido­Phe­OH BACHEM 4020250.0001
LB (Miller) Broth Fisher Scientific BP9723
Ludox HS-40 colloidal silica (40 wt.% suspension in H2O) Sigma-Aldrich 420816 dilution is needed to make a proper scattering solution
PTI Felix GX Horiba version 4.1.0.4096 spectral acquisition program for PTI Time Master Instrument
PTI Time Master Instrument Horiba NA
Pymol Molecular Graphics Program Schrodinger version 2.4
Water bath Thermo Scientific NESLAB RTE 10
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Thompson, M. C., Yeates, T. O., Rodriguez, J. A. Advances in methods for atomic resolution macromolecular structure determination. F1000Research. 9, (2020).
  2. Zhang, Q., Li, Y., Olson, R., Mukerji, I., Oliver, D. Conserved SecA signal peptide-binding site revealed by engineered protein chimeras and Forester resonance energy transfer. Biochimica. 55 (9), 1291-1300 (2016).
  3. Zhang, Q., et al. Alignment of the protein substrate hairpin along the SecA two-helix finger primes protein transport in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (35), 9343-9348 (2017).
  4. Stryer, L. Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. Annual Review of Biochemistry. 47, 819-846 (1978).
  5. Lakowicz, J. R. . Principles of Fluorescence Spectroscopy. , (2006).
  6. Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. FRET as a biomolecular research tool – understanding its potential while avoiding pitfalls. Nature Methods. 16 (9), 815-829 (2019).
  7. Magde, D., Wong, R., Seybold, P. G. Fluorescence quantum yields and their relation to lifetimes of rhodamine 6G and fluorescein in nine solvents: improved absolute standards for quantum yields. Photochemistry and Photobiology. 75 (4), 327-334 (2002).
  8. Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids. Methods in Enzymology. 211, 353-388 (1992).
  9. . R0 Values from Some Alexa Fluor Dyes – Table 1.6 Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/molecular-probes-the-handbook/tables/r0-values-for-some-alexa-fluor-dyes.html (2021)
  10. Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs. Sensors. 16 (9), 1488 (2016).
  11. Day, R. N., Davidson, M. W. Fluorescent proteins for FRET microscopy: monitoring protein interactions in living cells. BioEssays : News and Reviews in Molecular, Cellular, and Developmental Biology. 34 (5), 341-350 (2012).
  12. Lee, S. J., Syed, S., Ha, T. Single-Molecule FRET Analysis of Replicative Helicases. Methods in Molecular Biology. 1805, 233-250 (2018).
  13. Uhm, H., Hohng, S. Single-Molecule FRET Assay for Studying Cotranscriptional RNA Folding. Methods in Molecular Biology. 2106, 271-282 (2020).
  14. Globyte, V., Joo, C. Single-molecule FRET studies of Cas9 endonuclease. Methods in Enzymology. 616, 313-335 (2019).
  15. Qiao, Y., Luo, Y., Long, N., Xing, Y., Tu, J. Single-Molecular Förster Resonance Energy Transfer Measurement on Structures and Interactions of Biomolecules. Micromachines. 12 (5), 492 (2021).
  16. Catipovic, M. A., Bauer, B. W., Loparo, J. J., Rapoport, T. A. Protein translocation by the SecA ATPase occurs by a power-stroke mechanism. The EMBO Journal. 38 (9), 101140 (2019).
  17. Seinen, A. B., Spakman, D., van Oijen, A. M., Driessen, A. J. M. Cellular dynamics of the SecA ATPase at the single molecule level. Scientific Reports. 11 (1), 1433 (2021).
  18. Dimura, M., et al. Quantitative FRET studies and integrative modeling unravel the structure and dynamics of biomolecular systems. Current Opinion in Structural Biology. 40, 163-185 (2016).
  19. Kalinin, S., et al. A toolkit and benchmark study for FRET-restrained high-precision structural modeling. Nature Methods. 9 (12), 1218-1225 (2012).
  20. Paetzel, M. Structure and mechanism of Escherichia coli type I signal peptidase. Biochimica et Biophysica Acta. 1843 (8), 1497-1508 (2014).
  21. Ng, D., Brown, J., Walter, P. Signal sequences specify the targeting route to the endoplasmic reticulum membrane. The Journal of Cell Biology. 134 (2), 269-278 (1996).
  22. Huber, D., et al. SecA Cotranslationally Interacts with Nascent Substrate Proteins In Vivo. Journal of Bacteriology. 199 (2), 00622 (2017).
  23. Lill, R., et al. SecA protein hydrolyzes ATP and is an essential component of the protein translocation ATPase of Escherichia coli. The EMBO Journal. 8 (3), 961-966 (1989).
  24. Lill, R., Dowhan, W., Wickner, W. The ATPase activity of SecA is regulated by acidic phospholipids, SecY, and the leader and mature domains of precursor proteins. Cell. 60 (2), 271-280 (1990).
  25. Kimura, E., Akita, M., Matsuyama, S., Mizushima, S. Determination of a region of SecA that interacts with presecretory proteins in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 266 (10), 6600-6606 (1991).
  26. Hunt, J. F., et al. Nucleotide control of interdomain interactions in the conformational reaction cycle of SecA. Science. 297 (5589), 2018-2026 (2002).
  27. Sharma, V., et al. Crystal structure of Mycobacterium tuberculosis SecA, a preprotein tranlsocating ATPase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2243-2248 (2003).
  28. Vassylyev, D., et al. Crystal structure of the translocation ATPase SecA from Thermus thermophilus reveals a parallel, head-to-head dimer. Journal of Molecular Biology. 364 (3), 248-258 (2006).
  29. Zimmer, J., Li, W., Rapoport, T. A. A novel dimer interface and conformational changes revealed by an X-ray structure of B. subtilis SecA. Journal of Molecular Biology. 364 (3), 259-265 (2006).
  30. Zimmer, J., Rapoport, T. A. Conformational flexibility and peptide interaction of the translocation ATPase SecA. Journal of Molecular Biology. 394 (4), 606-612 (2009).
  31. Bauer, B. W., Rapoport, T. A. Mapping polypeptide interactions of the SecA ATPase during translocation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (49), 20800-20805 (2009).
  32. Auclair, S., et al. Mapping of the signal peptide-binding domain of Escherichia coli SecA using Förster resonance energy transfer. Biochimica. 49 (4), 782-792 (2010).
  33. Zimmer, J., Nam, Y., Rapoport, T. A. Structure of a complex of the ATPase SecA and the protein-translocation channel. Nature. 455 (7215), 936-943 (2008).
  34. Li, L., et al. Crystal structure of a substrate-engaged SecY protein-translocation channel. Nature. 531 (7594), 395-399 (2016).
  35. Ma, C., et al. Structure of the substrate-engaged SecA-SecY protein translocation machine. Nature Communications. 10 (1), 2872 (2019).
  36. Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nature Methods. 16 (4), 277-278 (2019).
  37. Jilaveanu, L. B., Oliver, D. In vivo membrane topology of Escherichia coli SecA ATPase reveals extensive periplasmic exposure of multiple functionally important domains clustering on one face of SecA. The Journal of Biological Chemistry. 282 (7), 4661-4668 (2007).
  38. Ramamurthy, V., Oliver, D. Topology of the integral-membrane form of Escherichiacoli SecA protein. The Journal of Biological Chemistry. 272 (37), 23239-23246 (1997).
  39. Chin, J., et al. Addition of p-Azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).
  40. Deiters, A., et al. Adding amino acids with novel reactivity to the genetic code of Saccharomyces cerevisiae. Journal of the American Chemical Society. 125 (39), 11782-11783 (2003).
  41. Lanzetta, P. A., Alvarez, L. J., Reinach, P. S., Candia, O. A. An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate. Analytical Biochemistry. 100 (1), 95-97 (1979).
  42. Mitchell, C., Oliver, D. B. Two distinct ATP-binding domains are needed to promote protein export by Escherichia coli SecA ATPase. Molecular Microbiology. 10 (3), 483-497 (1993).
  43. Thiol-reactive Probe Labeling Protocol. Thermo Fischer Scientific Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/labeling-chemistry-protocols/thiol-reactive-probe-labeling-protocol.html (2021)
  44. Click Chemistry – Section 3.1. Thermo Fischer Scientific Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/molecular-probes-the-handbook/reagents-for-modifying-groups-other-than-thiols-or-amines/click-chemistry.html (2021)
  45. Correction Factor. AAT Bioquest Available from: https://www.aatbio.com/resources/correction-factor/ (2019)
  46. Calculate dye:protein (F/P) molar ratios. Thermo Fischer Scientific Available from: https://tools.thermofischer.com/content/sfs/brochures/TR0031-Calc-FP-rations.pdf (2011)
  47. A Guide to Recording Fluorescence Quantum Yields. Horiba Scientific Available from: https://static.horiba.com/fileadmin/Horiba/Application/Materials/Material_Research/Quantum_Dots/quantumyieldstrad.pdf (2011)
  48. Ivanov, V., Li, M., Mizuuchi, K. Impact of emission anisotropy on fluorescence stectroscopy and FRET distance measurements. Biophysical Journal. 97 (3), 922-929 (2009).
  49. Auclair, S., Oliver, D., Mukerji, I. Defining the solution state dimer structure of Escherichia coli SecA using Forster resonance energy transfer. Biochimica. 52 (14), 2388-2401 (2013).
  50. . The PyMOL Molecular Graphics System, Version 2.4 Available from: https://pymol.org/2/ (2021)
  51. Musial-Siwek, M., Rusch, S. L., Kendall, D. A. Selective photoaffinity labeling identifies the signal peptide binding domain on SecA. Journal of Molecular Biology. 365 (3), 637-648 (2007).
  52. Miller, A., Wang, L., Kendall, D. A. Synthetic signal peptides specifically recognize SecA and stimulate ATPase activity in the absence of preprotein. The Journal of Biological Chemistry. 273 (19), 11409-11412 (1998).
  53. Gelis, I., et al. Structural basis for signal-sequence recognition by the translocase motor SecA as determined by NMR. Cell. 131 (4), 756-769 (2007).
  54. Erlandson, K. J., et al. A role for the two-helix finger of the SecA ATPase in protein translocation. Nature. 455 (7215), 984-988 (2008).
  55. Das, S., Oliver, D. Mapping of the SecA-SecY and SecA-SecG interfaces by site-directed in vivo photocross-linking. The Journal of Biological Chemistry. 286 (14), 12371-12380 (2011).
  56. Wheatley, E. G., Pieniazek, S. N., Vitoc, I., Mukerji, I., Beveridge, D. L. Molecular Dynamics Structure Prediction of a Novel Protein-DNA Complex: Two HU Proteins with a DNA Four-way Junction. Innovations in Biomolecular Modeling and Simulations: Volume 2. , 111-128 (2012).
  57. Vitoc, C. I., Mukerji, I. HU binding to a DNA four-way junction probed by Förster resonance energy transfer. Biochimica. 50 (9), 1432-1441 (2011).
  58. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature Protocols. 2 (8), 1849-1861 (2007).

Tags

Keywords Extracted From The Given Text:FRET MappingLigand Binding SitesSubunit OrientationConformational ChangesDynamic MotionsBiomolecular SystemLabeling SitesR0 ValuesDonor DyeAcceptor DyeSpectrofluorometerEmission ScanExcitation Wavelength
check_url/it/63433?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Northrop, J., Oliver, D. B., Mukerji, I. Förster Resonance Energy Transfer Mapping: A New Methodology to Elucidate Global Structural Features. J. Vis. Exp. (181), e63433, doi:10.3791/63433 (2022).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image