JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochimica

Förster Rezonans Enerji Transfer Haritalaması: Küresel Yapısal Özellikleri Aydınlatmak İçin Yeni Bir Metodoloji

Published: March 16, 2022
doi:
10.3791/63433
, ,
1Molecular Biology and Biochemistry Department,Wesleyan University, 2Molecular Biophysics Program,Wesleyan University

Summary

Çalışma, etiketleme alanlarının seçimi, boya seçimi, elde etme ve veri analizi dahil olmak üzere FRET haritalama metodolojisini detaylandırmaktadır. Bu metodoloji, protein sistemlerinde bağlanma bölgelerini, konformasyonel değişiklikleri ve dinamik hareketleri belirlemede etkilidir ve mevcut 3-B yapısal bilgilerle birlikte gerçekleştirilirse en yararlı olanıdır.

Abstract

Förster rezonans enerji transferi (FRET), in vitro ve hücrelerdeki biyomoleküller arasındaki mesafeleri başarılı bir şekilde ölçmek için kullanılan floresan tabanlı bir yöntemdir. FRET’te, floresan yoğunluğundaki veya ömründeki değişikliklerle ölçülen enerji transferinin verimliliği, iki floresan molekülü veya etiketi arasındaki mesafe ile ilgilidir. Dinamiklerin belirlenmesi ve mesafelerden gelen konformasyonel değişiklikler, bu yöntemin biyolojik sistemlere uygulanmasına sadece birkaç örnektir. Belirli koşullar altında, bu metodoloji dinamikler, esneklik ve bağlanma yüzeylerine adaptasyon hakkında bilgi sağlayarak mevcut X-ışını kristal yapılarına katkıda bulunabilir ve geliştirebilir. Bir bağlanma yerinin tanımlanması veya dimer alt birimlerinin oryantasyonları yoluyla yapısal özellikleri aydınlatmak için FRET ve ilişkili mesafe belirlemelerinin kullanımını açıklıyoruz. Etiketleme alanlarının akıllıca seçilmesi ve sıklıkla çoklu etiketleme stratejilerinin kullanılmasıyla, bir protein-DNA kompleksindeki ve SecA-SecYEG protein translokasyon sistemindeki küresel yapısal özellikleri belirlemek için bu haritalama yöntemlerini başarıyla uyguladık. SecA-SecYEG sisteminde, preprotein bağlanma bölgesini tanımlamak ve bağlı sinyal dizisi bölgesinin yerel konformasyonunu belirlemek için FRET haritalama yöntemlerini kullandık. Bu çalışma, uygun etiketleme alanlarının belirlenmesi, doğal olmayan amino asit kalıntıları dahil olmak üzere olası etiketlerin tartışılması, etiketleme prosedürleri, ölçümlerin nasıl yapılacağı ve verilerin yorumlanması dahil olmak üzere FRET haritalama çalışmalarının gerçekleştirilmesi için gereken adımları özetlemektedir.

Introduction

Proteinler için, 3 boyutlu (3-B) yapısal bilgi ile birlikte dinamiklerin aydınlatılması, biyomoleküler sistemlerin yapı-işlev ilişkilerinin daha iyi anlaşılmasına yol açar. X-ışını kristalografisi ve kriyojenik elektron mikroskobu gibi yapısal yöntemler, statik bir yapı yakalar ve genellikle biyomolekül bağlanmasının ve dinamiğinin yönlerini aydınlatmak için çoklu yapıların belirlenmesini gerektirir1. Bu makalede, bağlama siteleri veya bağlama etkileşimleri gibi genel yapısal öğeleri eşlemek için potansiyel olarak daha geçici ve statik yöntemlerle daha az kolay yakalanan çözüm tabanlı bir yöntem anlatılmaktadır. Bu metodoloji için güçlü aday sistemler, 3 boyutlu bir yapının daha önce X-ışını kristalografisi, NMR spektroskopisi veya diğer yapısal yöntemlerle belirlendiği sistemlerdir. Bu durumda, protein genel sekretuar yolunda merkezi bir oyuncu olan SecA-SecYEG kompleksinin X-ışını kristal yapısından yararlanarak, preproteinin membran2 boyunca taşınmasından önce Förster rezonans enerji transferini (FRET) kullanarak bir sinyal peptid bağlanma bölgesinin yerini haritalandırıyoruz. Biyolojik sistemin genetik modifikasyonlar yoluyla manipülasyonu, 3-D yapısı hakkındaki bilgimizle birleştiğinde, kanal 3’e yerleştirilmeden hemen önce sinyal dizisinin ve erken olgun bölgenin konformasyonunun belirlenmesini sağladı.

FRET, enerjinin bir molekülden (donör) diğerine (alıcı) radyasyonsuz transferini, mesafeye bağlı bir şekilde,uzay 4,5 boyunca içerir. Bu transferin etkinliği, donördeki bir azalma veya alıcı floresan yoğunluğundaki bir artış ile izlenir. Enerji transferinin verimliliği şu şekilde tanımlanabilir:

E = R 0 6/(R0 6 + R 6)

R0 değerinin, aktarımın% 50 verimli olduğu mesafe6. Bu teknik daha önce moleküler bir cetvel olarak tanımlanmıştır ve donör-alıcıboyaların 4,7,8,9 kimliğine bağlı olarak 2.5-12 nm aralığındaki mesafelerin belirlenmesinde etkilidir. Donör floresan yoğunlukları ve alıcılı veya alıcısız ömürleri, transfer verimliliklerinin ve dolayısıylamesafelerin 5,8 olarak belirlenmesine izin verir. Teknolojinin mevcudiyeti, yöntemin hassasiyeti ve kullanım kolaylığı nedeniyle, FRET ayrıca tek moleküllü floresan spektroskopisi ve konfokal mikroskopi6 gibi alanlarda geniş bir uygulama alanı bulmuştur. Yeşil floresan proteini gibi floresan proteinlerin ortaya çıkışı, hücre içi dinamiklerin ve canlı hücre görüntülemenin gözlemlenmesini nispeten kolay hale getirmiştir10,11. Bunlar gibi birçok FRET uygulaması bu sanal sayıda ayrıntılı olarak ele alınmıştır.

Bu çalışmada, yapısal detayları belirlemek için mesafe değerlerini elde etmek için FRET ölçümlerinin kullanımına özellikle odaklanıyoruz. Daha önce, FRET ölçümleri, protein 12,13,14’e, proteinlerin iç dinamiklerine ve protein bağlanma etkileşimlerine15,16,17 bağlandığında DNA moleküllerinin konformasyonunu belirlemek için etkili bir şekilde kullanılmıştır. Bu yöntemin avantajları, nispeten düşük miktarda malzemeye sahip bir çözeltide esnek ve dinamik yapısal elemanları belirleme yeteneğinde yatmaktadır. Önemli bir şekilde, bu yöntem mevcut yapısal bilgilerle birlikte kullanıldığında özellikle etkilidir ve 3 boyutlu yapı belirleme aracı olarak kullanılamaz. Yöntem, çalışmanın genellikle hesaplamalı simülasyon18,19 ile birleştirilen mevcut yapısal bilgilere dayanması durumunda yapının en iyi içgörüsünü ve iyileştirilmesini sağlar. Burada, kararlı durum ve zaman çözümlü FRET ölçümlerinden elde edilen mesafelerin kullanımı, genel sekretuar yolu3’teki ana proteinler olan SecA-SecYEG kompleksinin mevcut bir kristalografik yapısı üzerinde, yeri bilinmeyen bir bağlanma bölgesini haritalamak için tanımlanmıştır.

Prokaryotlardan ökaryotlara ve arkelere kadar oldukça korunmuş bir sistem olan genel salgı yolu, proteinlerin hücre içindeki fonksiyonel konumlarına membran boyunca veya içine taşınmasına aracılık eder. Çalışmamızda kullanılan organizma olan E. coli gibi Gram-negatif bakteriler için, proteinler iç zar boyunca periplazmaya yerleştirilir veya yer değiştirir. Bakteriyel SecY kanal kompleksi (translokon olarak adlandırılır), tipik olarak N-terminus20,21’de bulunan bir sinyal dizisi aracılığıyla hücredeki doğru konumuna yönlendirilen yeni sentezlenmiş proteini translokasyona yerleştirmek için diğer proteinlerle koordine olur. Periplazmaya bağlı proteinler için, ATPaz SecA proteini, ribozomun çıkış tüneli ile ve yaklaşık 100 kalıntı çevrildikten sonra preprotein ile ilişkilidir22. SecB şaperon proteini ile birlikte, preproteini açılmamış bir durumda tutar. SecA, SecYEG translokonuna bağlanır ve birçok ATP hidrolizi döngüsü boyunca, membran23,24 boyunca protein taşınmasını kolaylaştırır.

SecA, sitozolik ve membrana bağlı formlarda bulunan çok alanlı bir proteindir. Sitosoldeki homodimerik bir protein olan SecA, bir preprotein bağlanma veya çapraz bağlanma alanı25, iki nükleotid bağlayıcı alan, bir sarmal kanat alanı, bir sarmal iskele alanı ve iki sarmal parmak (THF) 26,27,28,29’dan oluşur (Şekil 1). SecA-SecYEG kompleksinin önceki kristalografik çalışmalarında, THF’nin yeri, protein translokasyonunda aktif olarak yer aldığını ve daha sonra sinyal peptidi ile çapraz bağlanma deneylerinin bu bölgenin protein translokasyonundaki önemini daha da ortaya koyduğunu ileri sürdü30,31. FRET haritalama metodolojisini kullanan önceki çalışmalar, eksojen sinyal peptitlerinin SecA 2,32’nin bu bölgesine bağlandığını göstermiştir. SecYEG kanalına yerleştirilmeden önce sinyal dizisinin ve preproteinin erken olgun bölgesinin konformasyonunu ve yerini tam olarak anlamak için, erken olgun bölgenin sinyal dizisinin ve kalıntılarının bir Ser-Gly bağlayıcı aracılığıyla SecA’ya bağlandığı bir protein kimera oluşturuldu (Şekil 1). Bu biyolojik olarak uygulanabilir yapı kullanılarak, preproteinin sinyal dizisinin ve erken olgun bölgesinin THF’ye paralel bir şekilde bağlandığıgösterilmiştir 2. Daha sonra, FRET haritalama metodolojisi, aşağıda açıklandığı gibi SecYEG’nin varlığında sinyal dizisinin ve erken olgun bölgenin konformasyonunu ve yerini aydınlatmak için kullanılmıştır.

SecA-SecYEG kompleksi33,34,35’in 3-D yapısı ve bağlanma yerinin olası konumu hakkında bilgi, bireysel FRET mesafelerinin kesişiminin bağlanma yeri yerini tanımladığı yerlere bağışçı-alıcı etiketlerini makul bir şekilde yerleştirmemize izin verdi. Bu FRET haritalama ölçümleri, sinyal dizisinin ve preproteinin erken olgun bölgesinin, ucu SecYEG kanalının ağzında bulunan bir saç tokası oluşturduğunu ve saç tokası yapısının kanal yerleştirmeden önce şablonlandığını gösterdiğini ortaya koymuştur.

Protocol

1. Etiketleme alanlarının seçimi Mevcut protein yapıları üzerindeki varsayılan bağlanma bölgesini üçgenleştirmek için en az üç potansiyel etiketleme bölgesi tanımlayın. Bu durumda, genetik füzyon yoluyla SecA’ya bağlı SecA, SecYEG ve preprotein tanımlandı2. Varsayılan bağlanma bölgesinin 25-75 şiçindeki etiketleme bölgelerini seçin ve proteinin nispeten statik bölgelerinde, mesafe kullanılacak spesifik FRET boya çiftini belirleyec…

Representative Results

Bu çalışma, preproteinin SecYEG kanalına yerleştirilmesinden önce preprotein bağlanma bölgesinin SecA üzerindeki yerini belirlemeye odaklanmıştır. Bağlanma bölgesini haritalamak için, preproteinin farklı bölgeleri ile SecA ve SecYEG proteinleri üzerindeki üç farklı konum arasında FRET deneyleri yapıldı (Şekil 1A-D). Elde edilen mesafelerden ve SecA, SecYEG ve preproteinin üç boyutlu yapılarından, preprotein bağlanma bölgesinin …

Discussion

FRET haritalama metodolojisini kullanarak, SecA proteini üzerindeki sinyal dizisi bağlanma bölgesini belirledik. Daha da önemlisi, kompleksin 3 boyutlu kristal yapısının varlığı, çalışmamızı büyük ölçüde kolaylaştırdı. Bu haritalama metodolojisinin gücü, etiketleme için konumları tanımlamak için mevcut bir yapıyı kullanma yeteneğinde yatmaktadır. Bu metodoloji 3B bir yapıyı belirlemek için kullanılamaz; Bununla birlikte, yapısal elemanların belirlenmesi56, me…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri hibesi R15GM135904 (IM’ye verildi) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Hibe GM110552 (DBO’ya verildi) tarafından desteklenmiştir.

Materials

490 nm LED laser Horiba 1684-LED
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide//DIBO Alkyne Life Technologies A20347
Agar Difco DF0812
Alexa Fluor 488 C5 Maleimide/DIBO Alkyne Life Technologies A10254
Alexa Fluor 488 DIBO Alkyne Life Technologies S10904
Alexa Fluor 647 DIBO Alkyne Life Technologies S10906
Amicon Ultra­4 Centrifugal filter (50kDa MWCO) Sigma UFC805008
Dodecylmaltoside (DDM) Anatrace D310
E. coli alkaline phosphatase signal peptide SP22 Biomolecules Midwest N/A Synthesized custom item
extended signal peptide SP41 Biomolecules Midwest N/A Synthesized custom item
FluorEssence Horiba version 2.4 spectral acquisition program for Fluoromax4 spectrofluorometer
Fluoromax 4 spectrofluorometer Horiba N/A
GlobalsWE Laboratory for Fluorescence Dynamics, University of California, Irvine spectral analysis program for time-resolved decays
H­4­Azido­Phe­OH BACHEM 4020250.0001
LB (Miller) Broth Fisher Scientific BP9723
Ludox HS-40 colloidal silica (40 wt.% suspension in H2O) Sigma-Aldrich 420816 dilution is needed to make a proper scattering solution
PTI Felix GX Horiba version 4.1.0.4096 spectral acquisition program for PTI Time Master Instrument
PTI Time Master Instrument Horiba NA
Pymol Molecular Graphics Program Schrodinger version 2.4
Water bath Thermo Scientific NESLAB RTE 10
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Thompson, M. C., Yeates, T. O., Rodriguez, J. A. Advances in methods for atomic resolution macromolecular structure determination. F1000Research. 9, (2020).
  2. Zhang, Q., Li, Y., Olson, R., Mukerji, I., Oliver, D. Conserved SecA signal peptide-binding site revealed by engineered protein chimeras and Forester resonance energy transfer. Biochimica. 55 (9), 1291-1300 (2016).
  3. Zhang, Q., et al. Alignment of the protein substrate hairpin along the SecA two-helix finger primes protein transport in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (35), 9343-9348 (2017).
  4. Stryer, L. Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. Annual Review of Biochemistry. 47, 819-846 (1978).
  5. Lakowicz, J. R. . Principles of Fluorescence Spectroscopy. , (2006).
  6. Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. FRET as a biomolecular research tool – understanding its potential while avoiding pitfalls. Nature Methods. 16 (9), 815-829 (2019).
  7. Magde, D., Wong, R., Seybold, P. G. Fluorescence quantum yields and their relation to lifetimes of rhodamine 6G and fluorescein in nine solvents: improved absolute standards for quantum yields. Photochemistry and Photobiology. 75 (4), 327-334 (2002).
  8. Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids. Methods in Enzymology. 211, 353-388 (1992).
  9. . R0 Values from Some Alexa Fluor Dyes – Table 1.6 Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/molecular-probes-the-handbook/tables/r0-values-for-some-alexa-fluor-dyes.html (2021)
  10. Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs. Sensors. 16 (9), 1488 (2016).
  11. Day, R. N., Davidson, M. W. Fluorescent proteins for FRET microscopy: monitoring protein interactions in living cells. BioEssays : News and Reviews in Molecular, Cellular, and Developmental Biology. 34 (5), 341-350 (2012).
  12. Lee, S. J., Syed, S., Ha, T. Single-Molecule FRET Analysis of Replicative Helicases. Methods in Molecular Biology. 1805, 233-250 (2018).
  13. Uhm, H., Hohng, S. Single-Molecule FRET Assay for Studying Cotranscriptional RNA Folding. Methods in Molecular Biology. 2106, 271-282 (2020).
  14. Globyte, V., Joo, C. Single-molecule FRET studies of Cas9 endonuclease. Methods in Enzymology. 616, 313-335 (2019).
  15. Qiao, Y., Luo, Y., Long, N., Xing, Y., Tu, J. Single-Molecular Förster Resonance Energy Transfer Measurement on Structures and Interactions of Biomolecules. Micromachines. 12 (5), 492 (2021).
  16. Catipovic, M. A., Bauer, B. W., Loparo, J. J., Rapoport, T. A. Protein translocation by the SecA ATPase occurs by a power-stroke mechanism. The EMBO Journal. 38 (9), 101140 (2019).
  17. Seinen, A. B., Spakman, D., van Oijen, A. M., Driessen, A. J. M. Cellular dynamics of the SecA ATPase at the single molecule level. Scientific Reports. 11 (1), 1433 (2021).
  18. Dimura, M., et al. Quantitative FRET studies and integrative modeling unravel the structure and dynamics of biomolecular systems. Current Opinion in Structural Biology. 40, 163-185 (2016).
  19. Kalinin, S., et al. A toolkit and benchmark study for FRET-restrained high-precision structural modeling. Nature Methods. 9 (12), 1218-1225 (2012).
  20. Paetzel, M. Structure and mechanism of Escherichia coli type I signal peptidase. Biochimica et Biophysica Acta. 1843 (8), 1497-1508 (2014).
  21. Ng, D., Brown, J., Walter, P. Signal sequences specify the targeting route to the endoplasmic reticulum membrane. The Journal of Cell Biology. 134 (2), 269-278 (1996).
  22. Huber, D., et al. SecA Cotranslationally Interacts with Nascent Substrate Proteins In Vivo. Journal of Bacteriology. 199 (2), 00622 (2017).
  23. Lill, R., et al. SecA protein hydrolyzes ATP and is an essential component of the protein translocation ATPase of Escherichia coli. The EMBO Journal. 8 (3), 961-966 (1989).
  24. Lill, R., Dowhan, W., Wickner, W. The ATPase activity of SecA is regulated by acidic phospholipids, SecY, and the leader and mature domains of precursor proteins. Cell. 60 (2), 271-280 (1990).
  25. Kimura, E., Akita, M., Matsuyama, S., Mizushima, S. Determination of a region of SecA that interacts with presecretory proteins in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 266 (10), 6600-6606 (1991).
  26. Hunt, J. F., et al. Nucleotide control of interdomain interactions in the conformational reaction cycle of SecA. Science. 297 (5589), 2018-2026 (2002).
  27. Sharma, V., et al. Crystal structure of Mycobacterium tuberculosis SecA, a preprotein tranlsocating ATPase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2243-2248 (2003).
  28. Vassylyev, D., et al. Crystal structure of the translocation ATPase SecA from Thermus thermophilus reveals a parallel, head-to-head dimer. Journal of Molecular Biology. 364 (3), 248-258 (2006).
  29. Zimmer, J., Li, W., Rapoport, T. A. A novel dimer interface and conformational changes revealed by an X-ray structure of B. subtilis SecA. Journal of Molecular Biology. 364 (3), 259-265 (2006).
  30. Zimmer, J., Rapoport, T. A. Conformational flexibility and peptide interaction of the translocation ATPase SecA. Journal of Molecular Biology. 394 (4), 606-612 (2009).
  31. Bauer, B. W., Rapoport, T. A. Mapping polypeptide interactions of the SecA ATPase during translocation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (49), 20800-20805 (2009).
  32. Auclair, S., et al. Mapping of the signal peptide-binding domain of Escherichia coli SecA using Förster resonance energy transfer. Biochimica. 49 (4), 782-792 (2010).
  33. Zimmer, J., Nam, Y., Rapoport, T. A. Structure of a complex of the ATPase SecA and the protein-translocation channel. Nature. 455 (7215), 936-943 (2008).
  34. Li, L., et al. Crystal structure of a substrate-engaged SecY protein-translocation channel. Nature. 531 (7594), 395-399 (2016).
  35. Ma, C., et al. Structure of the substrate-engaged SecA-SecY protein translocation machine. Nature Communications. 10 (1), 2872 (2019).
  36. Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nature Methods. 16 (4), 277-278 (2019).
  37. Jilaveanu, L. B., Oliver, D. In vivo membrane topology of Escherichia coli SecA ATPase reveals extensive periplasmic exposure of multiple functionally important domains clustering on one face of SecA. The Journal of Biological Chemistry. 282 (7), 4661-4668 (2007).
  38. Ramamurthy, V., Oliver, D. Topology of the integral-membrane form of Escherichiacoli SecA protein. The Journal of Biological Chemistry. 272 (37), 23239-23246 (1997).
  39. Chin, J., et al. Addition of p-Azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).
  40. Deiters, A., et al. Adding amino acids with novel reactivity to the genetic code of Saccharomyces cerevisiae. Journal of the American Chemical Society. 125 (39), 11782-11783 (2003).
  41. Lanzetta, P. A., Alvarez, L. J., Reinach, P. S., Candia, O. A. An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate. Analytical Biochemistry. 100 (1), 95-97 (1979).
  42. Mitchell, C., Oliver, D. B. Two distinct ATP-binding domains are needed to promote protein export by Escherichia coli SecA ATPase. Molecular Microbiology. 10 (3), 483-497 (1993).
  43. Thiol-reactive Probe Labeling Protocol. Thermo Fischer Scientific Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/labeling-chemistry-protocols/thiol-reactive-probe-labeling-protocol.html (2021)
  44. Click Chemistry – Section 3.1. Thermo Fischer Scientific Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/molecular-probes-the-handbook/reagents-for-modifying-groups-other-than-thiols-or-amines/click-chemistry.html (2021)
  45. Correction Factor. AAT Bioquest Available from: https://www.aatbio.com/resources/correction-factor/ (2019)
  46. Calculate dye:protein (F/P) molar ratios. Thermo Fischer Scientific Available from: https://tools.thermofischer.com/content/sfs/brochures/TR0031-Calc-FP-rations.pdf (2011)
  47. A Guide to Recording Fluorescence Quantum Yields. Horiba Scientific Available from: https://static.horiba.com/fileadmin/Horiba/Application/Materials/Material_Research/Quantum_Dots/quantumyieldstrad.pdf (2011)
  48. Ivanov, V., Li, M., Mizuuchi, K. Impact of emission anisotropy on fluorescence stectroscopy and FRET distance measurements. Biophysical Journal. 97 (3), 922-929 (2009).
  49. Auclair, S., Oliver, D., Mukerji, I. Defining the solution state dimer structure of Escherichia coli SecA using Forster resonance energy transfer. Biochimica. 52 (14), 2388-2401 (2013).
  50. . The PyMOL Molecular Graphics System, Version 2.4 Available from: https://pymol.org/2/ (2021)
  51. Musial-Siwek, M., Rusch, S. L., Kendall, D. A. Selective photoaffinity labeling identifies the signal peptide binding domain on SecA. Journal of Molecular Biology. 365 (3), 637-648 (2007).
  52. Miller, A., Wang, L., Kendall, D. A. Synthetic signal peptides specifically recognize SecA and stimulate ATPase activity in the absence of preprotein. The Journal of Biological Chemistry. 273 (19), 11409-11412 (1998).
  53. Gelis, I., et al. Structural basis for signal-sequence recognition by the translocase motor SecA as determined by NMR. Cell. 131 (4), 756-769 (2007).
  54. Erlandson, K. J., et al. A role for the two-helix finger of the SecA ATPase in protein translocation. Nature. 455 (7215), 984-988 (2008).
  55. Das, S., Oliver, D. Mapping of the SecA-SecY and SecA-SecG interfaces by site-directed in vivo photocross-linking. The Journal of Biological Chemistry. 286 (14), 12371-12380 (2011).
  56. Wheatley, E. G., Pieniazek, S. N., Vitoc, I., Mukerji, I., Beveridge, D. L. Molecular Dynamics Structure Prediction of a Novel Protein-DNA Complex: Two HU Proteins with a DNA Four-way Junction. Innovations in Biomolecular Modeling and Simulations: Volume 2. , 111-128 (2012).
  57. Vitoc, C. I., Mukerji, I. HU binding to a DNA four-way junction probed by Förster resonance energy transfer. Biochimica. 50 (9), 1432-1441 (2011).
  58. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature Protocols. 2 (8), 1849-1861 (2007).

Tags

Keywords Extracted From The Given Text:FRET MappingLigand Binding SitesSubunit OrientationConformational ChangesDynamic MotionsBiomolecular SystemLabeling SitesR0 ValuesDonor DyeAcceptor DyeSpectrofluorometerEmission ScanExcitation Wavelength
check_url/it/63433?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Northrop, J., Oliver, D. B., Mukerji, I. Förster Resonance Energy Transfer Mapping: A New Methodology to Elucidate Global Structural Features. J. Vis. Exp. (181), e63433, doi:10.3791/63433 (2022).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image