Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Isolasjon og screening fra jordmangfold for sopp involvert i nedbrytning av tilbakevendende materialer

Published: May 16, 2022 doi: 10.3791/63445
Automatic Translation
1, 1, 1
1Laboratory of Mycology, Department of Earth and Environmental Sciences, University of Pavia

Summary

Her presenterer vi en protokoll for screening av jordmangfold for å se etter soppstammer involvert i nedbrytning av tilbakevendende materialer. For det første er soppstammer i stand til å vokse på humsyrer eller lignocellulose isolert. Deres aktivitet testes deretter både i enzymatiske analyser og på miljøgifter som hydrokarboner og plast.

Abstract

Miljøforurensning er et økende problem, og det er en viktig oppgave å identifisere sopp involvert i bioremedieringsprosessen. Jord er vert for et utrolig mangfold av mikrobielt liv og kan være en god kilde til disse bioremediative soppene. Dette arbeidet tar sikte på å søke etter jordsvamp med bioremedieringspotensial ved å bruke forskjellige screeningtester. Mineralkulturmedier supplert med tilbakevendende stoffer da den eneste karbonkilden ble brukt som veksttester. For det første ble jordfortynning belagt på Petri-retter med mineralmedium endret med humsyrer eller lignocellulose. De voksende soppkoloniene ble isolert og testet på forskjellige substrater, for eksempel komplekse blandinger av hydrokarboner (petrolatum og brukt motorolje) og pulver av forskjellige plastpolymerer (PET, PP, PS, PUR, PVC). Kvalitative enzymatiske tester var forbundet med veksttestene for å undersøke produksjon av esteraser, lakcaser, peroksidaser og proteaser. Disse enzymene er involvert i de viktigste nedbrytningsprosessene for tilbakevendende materiale, og deres konstituerende sekresjon av de undersøkte soppstammene kan ha potensial til å bli utnyttet for bioremediering. Mer enn 100 stammer ble isolert og testet, og flere isolerer med godt bioremedieringspotensial ble funnet. Til slutt er de beskrevne screeningtestene en enkel og rimelig metode for å identifisere soppstammer med bioremedieringspotensial fra jorda. I tillegg er det mulig å skreddersy screeningtestene for ulike miljøgifter, i henhold til kravene, ved å legge til andre tilbakevendende stoffer i minimale kulturmedier.

Introduction

Jord er en grunnleggende del av livet på jorden og er grunnlaget for mange økosystemer. Mineraler, organisk materiale og mikroorganismer i jorda kan betraktes som ett system, med nære assosiasjoner og interaksjoner mellom dem. Samspillet mellom disse forbindelsene har en viktig innvirkning på terrestriske prosesser, miljøkvalitet og økosystemhelse1. Jordforurensning utgjør alvorlige miljøproblemer over hele verden. Den ukritiske, langsiktige og overdreven anvendelsen av tilbakevendende og giftige stoffer, som plantevernmidler, petroleumsprodukter, plast og andre kjemikalier, har alvorlige effekter på jordøkologi og kan som et resultat endre jordmikrobiota. Mikrobielle samfunn i jord består av et bredt spekter av organismer i forskjellige fysiologiske tilstander, der de fleste er bakterier og sopp. Mange av forurensningene i jord har middels til langsiktig stabilitet, og deres utholdenhet kan føre til utvikling av adaptive mekanismer som gjør at mikroorganismer kan utnytte tilbakevendende stoffer som næringsstoffer 2,3. Disse mikroorganismer kan derfor vurderes for bioremedieringsteknikker.

Bioremediering forsøker å redusere effekten av forurensning ved å bruke mikroorganismer og deres enzymer for nedbrytning eller transformasjon av avfall til mindre giftige eller ikke-giftige forbindelser. Ulike arter av arkaea, bakterier, alger og sopp har denne bioremedieringsevnen4. Som et resultat av deres spesielle biologisk nedbrytende handlinger er sopp spesielt lovende organismer for bioremediering. De kan angripe forskjellige substrater ved hjelp av hyphalnettverket, slik at de kan trenge inn i jordmatrisen mer effektivt enn andre mikroorganismer. I tillegg kan de nå utilgjengelige interstices der forurensninger er vanskelige å fjerne5, og de kan også overleve lave fuktighetsnivåer6. Videre syntetiserer sopp forskjellige kassetter av uspesifiserte enzymer, vanligvis for å forringe naturlige tilbakevendende stoffer som cellulose, lignin og humsyrer. De som mangler målsubstratet kan være involvert i nedbrytning av et bredt spekter av tilbakevendende miljøgifter, som hydrokarboner, plast og plantevernmidler 7,8,9,10. Derfor, selv om mange sopparter allerede er rapportert som bioremedieringsmidler, er det økende interesse for å utforske arter som ennå ikke er studert for å velge kandidater til bioremediering av tilbakevendende forurensende stoffer. Arten som allerede er kjent for å ha bioremedieringsegenskaper tilhører phyla Ascomycota 11,12,13, Basidiomycota 14,15 og Mucoromycota. For eksempel er slekten Penicillium og Aspergillus kjent for å være involvert i nedbrytning av alifatiske hydrokarboner13, forskjellige plastpolymerer16,17,18, tungmetaller19 og fargestoffer20. På samme måte har studier utført på basidiomycetes sopp, som Phanerochaete chrysosporium og Trametes versicolor, avslørt deres engasjement i oksidasjon av tilbakevendende materialer som aromatiske hydrokarboner13 og plast21. Et annet eksempel på sopp involvert i biologisk nedbrytningsprosessene er zygomycetes Rhizopus spp., Mucor spp., og Cunninghamella spp.22,23. Spesielt er Cunninghamella i stand til å oksidase aromatiske hydrokarboner og regnes som en modellorganisme for å studere avgiftning av produkter fra et bredt spekter av xenobiotika13.

Det er flere soppenzymer involvert i de store nedbrytende prosessene for tilbakevendende materialer 24,25, som esterase, lakcase, peroksidase og protease. Laccases er kobberholdige oksidaser produsert i cellen og deretter utskilt, noe som tillater oksidasjon av en rekke fenoliske og aromatiske forbindelser. De kan forringe ortho og para diphenoler, aminogruppeholdige fenoler, lignin og arylgruppen som inneholder diaminer26. Peroksididaser bruker hydrogenperoksid som megler for å forringe lignin og andre aromatiske forbindelser. Det er mange forskjellige peroksidaser, men de med størst potensial til å forringe giftige stoffer er lignin peroksidase og mangan peroksidase27.

Esteraser og proteaser tilhører gruppen av ekstra- eller ekto-cellulære enzymer, som virker utenfor opprinnelsescellene, men som fortsatt er bundet til dem. Disse enzymene kan katalysere hydrolysen av store tilbakevendende molekyler i mindre. På grunn av deres lave substratspesifisitet kan disse enzymene spille en nøkkelrolle i bioremediering av ulike miljøgifter, for eksempel tekstilfarger, avløpsstoffer frigjort fra masse- og papirindustrien og lærbruning, petroleumsprodukter, plast og plantevernmidler 28,29,30.

En rekke screeningmetoder for å velge for bioremediative soppstammer er allerede publisert. For eksempel har halmbasert agarmedium blitt brukt til å screene for hvitrotsvamp med høyt potensial i polysykliske aromatiske hydrokarboner (PAH) nedbrytning31; og små biter av råtnende tre har blitt plassert på malt ekstrakt agar (MEA) for å isolere trerotting sopp32. Imidlertid velger de fleste metodene som allerede er foreslått, svært spesifikke sopp for deres interesseaktivitet. Denne forskningen foreslår en bredere tilnærming for å velge jordsvamp med et bredere spekter av handling. Metoden er avhengig av den første plating av serielle fortynninger av jordprøver på et medium endret med humsyrer eller lignocellulose blandet med antibiotika for å velge sopp med evnen til å forringe disse naturlige tilbakevendende stoffene. Humsyrer og lignocellulose er faktisk stoffer som er ekstremt motstandsdyktige mot biologisk nedbrytning siden de har svært komplekse molekylære strukturer, og dette gjør at de kan være gode indikatorer på de nedbrytende evnene til de testede soppene33,34. Deretter screenes soppene som er valgt i de første testene for å identifisere de med potensial til å forringe spesifikke miljøgifter som petrolatum, brukt motorolje og plast. Til slutt utføres kvalitative enzymatiske tester for å oppdage soppstammer som er i stand til å produsere enzymer involvert i biologisk nedbrytningsprosesser av tilbakevendende stoffer. Til dette formål utføres protease- og esterasetester, mens gallsyre og guaiacol brukes som indikatorer på lakk og annen ligninolytisk enzymproduksjon35,36. Disse substratene brukes fordi det er funnet en sterk sammenheng mellom soppens evne til å oksidere dem til deres brunfargede form og besittelse av ligninolytisk evne 37,38,39.

Gjennom disse protokollene er det mulig å isolere soppstammer med høyt nedbrytningspotensial og et bredt spekter av handling direkte fra jordprøver. Isolering av disse soppstammene kan bidra til å finne nye kandidater til bioremedieringsformål.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Utvalg av soppstammer som er i stand til å forringe tilbakevendende materialer fra jord

  1. Forberedelse av antibiotikaoppløsning.
    1. Sett penicillin (50 mg/l), streptomycin (40 mg/l), klortetracyklin (40 mg/l), neomycin (100 mg/l) og kloramfenikol (100 mg/l) i 250 ml deionisert sterilt vann.
    2. Før du legger kloramfenikol til antibiotikaoppløsningen, oppløs den i 3 ml ≥99% etanol.
    3. Plasser antibiotikaløsningen på en magnetisk omrører (ingen varme) med en magnetisk omrøringsstang inne i løsningen i 10 minutter. Oppbevar den ved 4 °C.
  2. Utarbeidelse av vekstmedier.
    1. Sett 1 g kommersiell huminsyre, 3,26 g Bushnell-Haas buljong (BH) og 15 g agar i 1 liter deionisert vann og autoklaver det i 20 min ved 121 °C (humsyreagar).
    2. Tallerken den huminsyre agar i Petri retter under en laminær strømningsskap.
    3. Sett 4 g lignocellulose, 3,26 g BH og 15 g agar i 1 L deionisert vann og autoklaver det i 20 minutter ved 121 °C (lignocellulose agar).
    4. Tallerken lignocellulose agar i Petri retter under en laminær strømningsskap.
    5. Under et laminært strømningsskap, etter at media har størknet i Petri-rettene, overfør 1 ml av antibiotikaløsningen på de tilberedte platene ved hjelp av en steril sprøyte med et 0,2 μm filter for å sterilisere det.
    6. Fordel antibiotikaløsningen jevnt på plateoverflatene ved hjelp av en steril til engangs L-formet cellespreder og la den lufttørke under laminært strømningsskap.
    7. Sett 20 g maltekstraktbuljong og 15 g agar i 1 L deionisert vann og autoklaver det i 20 min ved 121 °C (maltekstrakt agar - MEA).
    8. Tallerken MEA i Petri retter under en laminær strømning skap.
  3. Jordprøvetaking og jordfortynning.
    1. Prøv jorda av interesse på en dybde på 10 cm, fjern planter, gress og døde blader fra topplaget, og legg det i sterile polyetylenposer.
    2. Etter å ha nådd laboratoriet, sikt jorda ved hjelp av et 2 mm nett, fjern eventuelle røtter og planteavfall.
    3. Hvis det ikke er mulig å fortsette med nedstrømsanalysen med en gang, lagre de siktede jordprøvene ved 4 °C.
    4. Arbeid under et laminært strømningsskap, legg 1 g av den siktede jorda i et sterilt 15 ml rør med 10 ml sterilt avionisert vann (1 x 10-1 fortynning). Rist røret horisontalt i 30 min.
    5. Under et laminært strømningsskap, før suspensjonen legger seg, ta 1 ml av 1 x 10-1 fortynning med en steril pipette og overfør den til en 9 ml avionisert vann blank (1 x 10-2 fortynning ). Virvel det grundig.
    6. Før suspensjonen legger seg, ta 1 ml av 1 x 10-2 fortynning med en steril pipette og overfør den til en 9 ml deionisert vann blank (1 x 10-3 fortynning ). Virvel det grundig.
  4. Plating jordfortynning på selektive medier.
    1. Arbeid under et laminært strømningsskap, samle 100 μL av 1 x 10-3 fortynning ved hjelp av en mikropipette med et sterilt punkt og overfør det til en humic agar Petri-tallerken. Gjør dette for minst 4 eller 5 Petri retter.
    2. Fordel fortynning jevnt på Petri parabolen overflaten ved hjelp av en steril engangs L-formet celle spreder.
    3. La det lufttørke i 10-15 min under laminært strømningsskap.
    4. Gjenta trinn 1.4.1.-1.4.3. ved hjelp av lignocellulose Petri retter.
    5. Inkuber ved 25 °C i mørket i maksimalt 15 dager.
  5. Isolering av soppkolonier vokst fra selektive medier til vekstmedier.
    1. Fra 3 dager etter tilberedning, sjekk de tilberedte selektive mediene Petri retter daglig for eventuell soppkolonivekst i maksimalt 15 dager.
    2. Sjekk alle soppkoloniene som er tilstede for likheter. Om nødvendig, forbered et lysbilde som skal observeres under et lysmikroskop.
      MERK: Målet er å isolere det høyeste antallet soppkolonier, men det er nødvendig å unngå alltid å isolere den samme soppstammen fra forskjellige plater, så denne kontrollen er svært viktig. Se etter kolonier med forskjellig makro- og mikromorfologi.
    3. Under et laminært strømningsskap eller ved en Bunsen-brenner isolerer du hver valgte soppstamme ved å forsiktig fjerne en liten del av myceliet fra kolonien med en steril inokulasjonsnål og overføre den til en ny MEA Petri-tallerken.
      MERK: I denne fasen er det svært viktig å være delikat og presis fordi det er stor risiko for forurensning fra de andre soppkoloniene som finnes i den originale Petri-parabolen. Hvis mer enn én soppstamme vokser på den inokulerte MEA-platen, gjentar du trinn 1.5.3.
    4. Inkuber ved 25 °C i mørket i 7 dager. Dette er soppstammene som skal testes videre på spesifikke tilbakevendende stoffer.

2. Veksttester på tilbakevendende stoffer

  1. Veksttest på petrolatum.
    1. Overfør 20 ml flytende BH (3,26 g/l BH) til 50 ml hetteglass og steriliser dem ved autoklavering ved 121 °C i 20 minutter.
    2. Overfør 7 ml deionisert vann til 15 ml hetteglass i glass og tilsett noen stykker knuste glassdeksler i hvert hetteglass.
    3. Steriliser dem ved autoklavering ved 121 °C i 20 minutter.
    4. Under laminært strømningsskap, tilsett 1 ml petrolatum til hvert 50 ml BH-hetteglass ved hjelp av en steril pipette. Oppbevar noen hetteglass med bare BH som negativ kontroll.
    5. Under laminært strømningsskap fjerner du myceliet på overflaten av mediet fra MEA-platene med de valgte soppstammene (tilberedt på trinn 1.5.3.) ved hjelp av en steril nål og overfører den til 15 ml glassflasker med de ødelagte dekslene.
    6. Agitate hvert hetteglass på en virvelblander i 2 min, slik at de ødelagte dekslene kan kutte kuben av soppkolonien, noe som gjør en soppfjæring.
    7. Inokuler hvert petrolatum hetteglass med 200 μL soppfjæring. Lag to repliker for hver soppstamme.
    8. For negativ kontroll, legg 200 μL soppfjæring i hetteglass med bare flytende BH. Videre, hold et par hetteglass med petrolatum uten sopp inokulering for å sjekke for forurensning i mediet.
    9. Inkuber hetteglassene ved 25 °C i mørket og kontroller dem etter 15 dager og 30 dager fra inokulumet.
  2. Veksttest på brukt motorolje.
    1. Sett 3,26 g BH og 15 g agar i 1 L deionisert vann og autoklaver det i 20 min ved 121 °C (BHA).
    2. Tallerken BHA i Petri retter under en laminær strømningsskap.
    3. Når den har størknet, overfør 500 μL brukt motorolje på BHA Petri-rettene og fordel den jevnt på plateflatene ved hjelp av en steril engangs L-formet cellespreder.
    4. Inokuler hver brukte motorolje BHA-plate med hver soppstamme, og samle myceliet fra platene som er tilberedt på trinn 1.5.3. Arbeid på en Bunsen brenner eller under en laminær strømningshette for å unngå forurensning. Lag to repliker for hver soppstamme.
    5. For den negative kontrollen, inokuler Petri-rettene med BHA bare. Videre, hold et par brukte motorolje BHA Petri retter uten sopp inokulering for å sjekke for forurensning i mediet.
    6. Inkuber Petri-rettene ved 25 °C i mørket og sjekk dem etter 15 dager og 30 dager fra inokulumet.
  3. Veksttest på plast.
    1. Overfør 200 μL soppfjæring (trinn 2.1.5.-2.1.6.) til en 96-mikrowell plate. Lag tre replikeringer av kombinasjonen av soppstammeplast.
    2. Til hver brønn med soppfjæring, tilsett 10 mg av en annen type plastpulver (polyetylentereftalat - PET, polyvinylklorid - PVC, polyetylen med høy tetthet - HDPE, polystyren - PS, polyuretan - PUR).
    3. For negativ kontroll, i stedet for å legge til plastpulveret, tilsett 200 μL sterilisert BH-løsning til brønnen med soppfjæringen. Videre, for hver type plastpulver, fyll en brønn med 200 μL sterilisert BH-løsning og 10 mg av hvert plaststøv for å sjekke for forurensning av mediet.
    4. Inkuber mikrowellplatene ved 25 °C i mørket og kontroller dem etter 15 dager og 30 dager fra inokulumet.

3. Kvalitative enzymatiske tester

  1. Kvalitativ ligninolytiske enzymer kolorimetrisk test.
    1. Sett 27 g potet dextrose buljong (PD) og 15 g agar i 1 L deionisert vann og autoklaver det i 20 min ved 121 °C (PDA).
    2. Når mediet har avkjølt seg litt, men fortsatt er flytende, tilsett gallsyre (5 g/L) under en laminær strømningshette og tallerken mediet i Petri-retter.
    3. Inokuler PDA + gallsyreplater med hver soppstamme, samle myceliet fra platene som er tilberedt på trinn 1.5.3. Arbeid på en Bunsen brenner eller under en laminær strømningshette for å unngå forurensning.
    4. Som negative kontroller, lag Petri-retter med bare PDA (ingen gallsyre) og inokuler dem med soppstammene (en for hver soppstamme), samt en Petri-tallerken med PDA + gallsyre og ingen soppinokulering.
    5. Inkuber Petri-rettene ved 25 °C i mørket og sjekk dem etter 7 dager fra inokulumet.
  2. Kvalitativ lakcases kolorimetrisk test.
    1. Sett 27 g PD og 15 g agar i 1 L deionisert vann og autoklaver det i 20 min ved 121 °C (PDA).
    2. Når mediet har avkjølt seg litt, men fortsatt er flytende, tilsett guaiacol (400 μL/L) under en laminær strømningshette og tallerken den i Petri-retter.
    3. Inokuler PDA + guaiacol-platene med hver soppstamme, samle myceliet fra platene som er tilberedt på trinn 1.5.3. Arbeid på en Bunsen brenner eller under en laminær strømningshette for å unngå forurensning.
    4. Som negative kontroller, lag Petri-retter med bare PDA (ingen guaiacol) Og inokuler dem med soppstammene (en for hver soppstamme), samt en Petri-tallerken med PDA + guaiacol og ingen soppinokulering.
    5. Inkuber Petri-rettene ved 25 °C i mørket og sjekk dem etter 7 dager fra inokulumet.
  3. Kvalitativ proteaser test.
    1. Forbered JA-mediet ved å legge til K2HPO4 (1 g/L) , KH2PO4 (0,5 g/l), MgSO4·7H2O (0,5 g/l), MnCl2·4H2O (0,001 g /L), CuCl2·2H2O (1,4 x 10-5 g/l), ZnCl2 (1,1 x 10-5 g/l), CoCl2·6H 2 O (2 x 10-5 g/l), CoCl 2·6H2O (2 x 10-5 g/l), Na2MoO4·2H2O (1,3 x 10-5 g/L), FeCl3·6H2O (7,5 x 10-5 g/L) og gelatin/peptone (0,02 g/l) til deionisert vann.
    2. Plasser YES-mediet på en magnetisk rører (ingen varme) med en magnetisk rørestang inne i mediet i 10 minutter.
    3. Når alle saltene er oppløst i mediet, overfør 5 ml av oppløsningen til 20 ml sterile hetteglass og autoklaver dem i 20 minutter ved 121 °C.
    4. For negativ kontroll, lag rundt 20 ml sterile hetteglass med 5 ml BH-oppløsning og autoklaver dem i 20 minutter ved 121 °C.
    5. Under et laminært strømningsskap overfører du 200 μL soppfjæring (trinn 2.1.5.-2.1.6.) for hver belastning til JA-middels steriliserte hetteglass (gjør minst 2 repliker per soppstamme). For hver soppstamme, tilsett 200 μL av samme soppfjæring til BH-steriliserte hetteglass for å ha en negativ kontroll.
    6. Inkuber hetteglassene ved 25 °C i mørket i 21 dager og kontroller dem hver 7.
  4. Kvalitativ esterases test.
    1. Forbered Tween 80-mediet ved å tilsette peptone (10 g/l), NaCl (5 g/l), CaCl2 (0,1 g/l) og 10 ml Tween 80 til 1 L deionisert vann.
    2. Plasser Tween 80-mediet på en magnetisk omrører (ingen varme) med en magnetisk rørestang inne i mediet i 10 minutter.
    3. Når alt smeltes inne i mediet, overfør 5 ml av oppløsningen til 20 ml sterile hetteglass og autoklaver dem i 20 minutter ved 121 °C.
    4. For negativ kontroll, lag rundt 20 ml sterile hetteglass med 5 ml BH-oppløsning og autoklaver dem i 20 minutter ved 121 °C.
    5. Under et laminært strømningsskap, overfør 200 μL soppfjæring (trinn 2.1.5.-2.1.6.) for hver belastning til Tween 80 middels steriliserte hetteglass (gjør minst 2 repliker per soppstamme). For hver soppstamme tilsettes 200 μL av samme soppfjæring til BH-steriliserte hetteglass for negativ kontroll.
    6. Inkuber hetteglassene ved 25 °C i mørket i 21 dager og kontroller dem hver 7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De selektive mediemetodene (paragraf 1 i protokollen) gjorde det mulig å screene jordens rike biologiske mangfold og soppene med høyt bioremedieringspotensial som skulle velges. Med humsyre og lignocellulose media ble mer enn 100 soppstammer isolert. Disse soppene produserte enzymer involvert i biologisk nedbrytning av naturlige tilbakevendende materialer, som har en kjemisk struktur som ligner mange miljøgifter. Imidlertid trengte soppstammene isolert med de selektive mediene ytterligere screening. Spesielt isolerte de selektive testene stammene som var i stand til å forringe huminsyrer og lignocellulose, veksttestene screenet de isolerte soppene for de som kunne bruke et bestemt miljøgift som sin eneste karbonkilde, og de kvalitative enzymatiske testene beskrev deres metabolske aktiviteter.

Veksttestene var fokusert på soppevnen til å forringe hydrokarboner (petrolatum og brukt motorolje) og plast (PET, PVC, HDPE, PS, PUR). Hvert av disse stoffene ble brukt i en test som eneste karbonkilde for de valgte soppstammene. Soppevnen til å utnytte disse stoffene ble evaluert som forskjellen i kolonivekst mellom prøvene med det tilsatte stoffet og kontrollprøvene med bare minimalt medium (BH eller BHA, avhengig av testen). En kvalitativ skala ble brukt til å beskrive resultatene (figur 1), alt fra fravær av vekstforskjell med kontrollnivåene (0) til lav (+), middels (++) og høye (+++) vekstnivåer.

Figure 1
Figur 1: Vekstsuksess for soppstammer i veksttestene. Prosentandelen av soppstammer som kan vokse på petrolatum, brukt motorolje og plastpulver (polyetylentereftalat, PET; polyvinylklorid, PVC; polyetylen med høy tetthet, HDPE; polystyren, PS; polyuretan, PUR) som eneste karbonkilde med forskjellige grader av suksess (ingen vekst, 0; lav vekst, +; middels vekst, ++; høy vekst, ++; høy vekst, +++ Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Petrolatum- og bruktmotoroljetestene evaluerte hydrokarbonbiodegraderingspotensialet til de valgte soppstammene. Petrolatum, en blanding av langkjedede alkaner (>C25), ble brukt som eneste karbonkilde. Soppevnen til å utnytte dette stoffet ble evaluert som forskjellen i kolonivekst mellom hetteglass med BH + petrolatum og kontroll hetteglass med bare BH (figur 2). Nesten 75% av de testede soppstammene var i stand til å bruke petrolatum som sin eneste karbonkilde, og 21% av stammene viste maksimal vekst (+++, figur 1).

Figure 2
Figur 2: Bilder av den kvalitative vekstskalaen på petrolatum som eneste karbonkilde. Den kvalitative skalaen er basert på vekstforskjellen mellom de behandlede prøvene og BH-kontrollen. Den varierer fra fravær av vekstforskjell (0), til lav (+), middels (++) og høye (+++) nivåer av vekstforskjell. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Brukt motorolje er en kompleks blanding av hydrokarboner, motortilsetninger og metaller. Den ble brukt i veksttestene for å evaluere soppevnen til å utnytte en kompleks og giftig hydrokarbonblanding som karbonkilde. I likhet med de andre veksttestene ble veksten evaluert ved å sammenligne soppveksten i plater med motoroljen med vekst i kontrollplatene som bare inneholder BHA (figur 3). Vekstresultatene bekreftet effekten av det selektive mediet (§ 1 i protokollen). Faktisk var nesten 90% av de isolerte soppstammene i stand til å vokse på brukt motorolje, med 39% som viste maksimal vekst (+++, figur 1).

Figure 3
Figur 3: Bilder av den kvalitative vekstskalaen på brukt motorolje som eneste karbonkilde. Den kvalitative skalaen er basert på vekstforskjellen mellom de behandlede prøvene og BHA-kontrollen. Den varierer fra fravær av vekstforskjell (0), til lave (+), middels (++) og høye (+++) nivåer av vekstforskjell. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Veksttester på plastpulver ble brukt til å velge soppstammer som kunne bruke spesifikke plastpolymerer som primær karbonkilde; Derfor har disse stammene et stort potensial for plastisk bioremediering. Veksten i flerboplater ble observert av stereomikroskop og evaluert ved hjelp av en kvalitativ skala, alt fra fravær av vekst (0) til høy produksjon av hyphae (+++). PUR var plastpulveret som hadde den høyeste prosentandelen soppstammer som viste vekst (92%), med 31% av stammene som viste maksimal vekst (+++). Omtrent 70% av stammene isolert fra huminsyre og lignocellulosemedier vokste på PS-pulver, mens nesten 60% -65% av dem var i stand til å bruke HDPE, PVC og PET som sin eneste karbonkilde. Derfor var en stor prosentandel sopp i stand til å vokse på de forskjellige plastpulverene i multiwellplater, men et svært lavt antall av dem viste høy kolonisering av plast. Faktisk var bare 10% av stammene i stand til å trives på PET og HDPE, og 13% var i stand til å trives på PS. Den eneste plasten der høy soppvekst regelmessig ble observert var PUR, hvor ca. 30% av soppstammene klarte å vokse veldig rikelig.

Kvalitative enzymatiske tester ble utført for å oppdage soppstammer som kan produsere enzymer involvert i biologisk nedbrytningsprosesser av tilbakevendende stoffer. Peroksidaser og lakcaser er ligninolytiske enzymer hvis produksjon er indikert av en brunaktig glorie på undersiden av mediet i gallsyre- og guaiacoltester (trinn 3.1. og trinn 3.2. i protokollen). I begge testene indikerte økningen i fargens intensitet en høyere produksjon av disse enzymene (figur 4).

Figure 4
Figur 4: Bilder av den kvalitative skalaen av kvalitative ligninolytiske enzymer. Den kvalitative skalaen er basert på produksjon av en rød/brunaktig glorie rundt kolonien. 0 = ingen aktivitet, + = noe aktivitet, ++ = høy aktivitet, +++ svært høy aktivitet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Omtrent 60% av de testede soppene var i stand til å produsere ligninolytiske enzymer, noe som indikerer suksessen til det selektive mediet. Videre produserte 12% av de isolerte soppstammene en intens mørk glorie rundt kolonien (+++) i gallsyremedium, med 17% som gjorde det i guaiacol medium (laccases), noe som indikerer høy soppsekresjon av disse enzymene (figur 5).

Figure 5
Figur 5: Frekvens av enzymaktivitet ved soppstammer under kvalitative enzymatiske tester. Prosentandelen av soppstammer som er i stand til å produsere ligninolytiske enzymer, lakcaser, proteaser og esteraser med forskjellige suksessnivåer (0 = ingen aktivitet, + = aktivitet, ++ = høy aktivitet, +++ veldig høy aktivitet) under deres tilsvarende kvalitative enzymatiske tester. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

En annen screeningtest som ble brukt til å analysere soppaktivitet var proteasetesten, som var basert på forskjellen i soppvekst mellom JA-mellomstore hetteglass og kontroll hetteglass med BH. Imidlertid viste omtrent 70% av soppstammene i JA-mediet lignende vekst som kontroller, eller til og med redusert vekst. Ingen soppstamme nådde det maksimale forskjellsnivået (+++). Disse resultatene tyder på at denne testen kan være uegnet for screening for proteaseaktivitet.

Til slutt ble esterases aktivitet evaluert ved dannelsen av et hvitt bunnfall i Tween 80 medium (figur 5). Nesten 60% av de valgte soppstammene viste esteraseaktivitet, og 13% viste en høy dannelse av bunnfallet (+++), noe som tyder på at stammene i de 13% bør velges for å undersøke deres biologisk nedbrytningspotensial (figur 5).

Når det gjelder all vekst og enzymatiske tester, var de mest vellykkede stammene (dvs. de som oppnådde +++ i minst en test) de mest interessante. Disse soppstammene var i stand til effektivt å bruke tilbakevendende stoffer som sin eneste karbonkilde, eller de produserte et høyt nivå av enzymer involvert i biologisk nedbrytning av tilbakevendende stoffer. Faktisk var 39 av de 115 soppstammene som ble testet i stand til å trives (+++) på hydrokarbonkilder (petrolatum eller brukt motorolje), og 58 hadde høy vekst på minst en plastpolymer. Bare 32 viste svært høy enzymatisk aktivitet (+++) i minst en av de enzymatiske testene som ble utført. Disse resultatene viser den høye effekten av alle de rapporterte screeningtestene, bortsett fra proteasestesten, som ikke valgte noen høypresterende stammer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det rike biologiske mangfoldet av jord er en rikelig kilde til sopp som har mange metabolske evner, hvorav noen kan være potensielle kandidater for bioremediering. Selektive medietester (paragraf 1 i protokollen) er enkle å utføre og effektive metoder for å isolere sopp som kan vokse på naturlige komplekse polymerer som sin eneste karbonkilde. Sopp kan produsere ekstracellulære, ikke-spesifikke hydrolaser og oksidoreductaser30 som ligninolytiske enzymer lakcaser og peroksidaser31. Disse enzymene kan forringe lignocellulose og humsyrer, men også mange forskjellige xenobiotika, inkludert hydrokarboner, aromatiske forbindelser og klorerte organiske forbindelser32.

De beskrevne metodene gir resultater som er enkle å tolke og er rimelige å utføre. Disse egenskapene gjør at de kan brukes av ikke-eksperter. Imidlertid krever visse aspekter, som sterilitet og morfologisk identifikasjon, spesiell oppmerksomhet. For eksempel er 30 min agitasjon av jordfjæringen (trinn 1.3.4.) nødvendig slik at soppsporene og propagulene frigjøres fra jordmikrostrukturen og kan suspenderes i løsningen. På denne måten, ved å plating fortynning av denne jordfjæringen, er det mulig å isolere maksimalt antall soppstammer. Makro og mikroskopisk morfologisk identifisering av soppstammer er viktig for å skille mellom stammer og unngå å isolere den samme soppstammen flere ganger. Dessuten er sterilitet og unngåelse av mikrobielle forurensninger avgjørende fordi tilstedeværelsen av andre aktive soppstammer kan feilaktig fremstille aktiviteten til de studerte koloniene.

Etter de selektive testene ble det utført en rekke veksttester på forskjellige tilbakevendende stoffer, for eksempel petrolatum, brukt motorolje og forskjellige plastpolymerer. Dette stadiet kan tilpasses i henhold til de tilbakevendende stoffene av interesse. Det viktige trinnet er å legge det valgte stoffet til BH eller BHA som eneste karbonkilde og å sjekke soppveksten mot en kontroll uten det tilsatte tilbakevendende stoffet.

Målet med veksttestene på plast og hydrokarboner var å vurdere om soppen kunne bruke disse stoffene som eneste karbonkilde ved å kvalitativt observere veksten på materialet. Dessverre, på grunn av den ekstreme tilbakevendende av disse materialene, er det svært vanskelig å kvantifisere den faktiske nedgangen i vekten av substratet og økningen i vekten av soppbiomassen, spesielt etter relativt kort tid. Hvis en soppstamme fungerer veldig bra i disse screeningveksttestene, bør det gjennomføres ytterligere studier for å kvantifisere nedbrytningen av det tilbakevendende stoffet.

De brukte enzymatiske testene (paragraf 3 i protokollen) ble valgt fordi de viste seg å være effektive og raske å utføre, men de gir bare kvalitative resultater. De fremhever nedbrytningspotensialet til en soppstamme, men de kan ikke nøyaktig kvantifisere det. Hvis en stamme av spesiell interesse er isolert, kan ytterligere tester, for eksempel spektrofotometriske kvantitative enzym essays, utføres for å beskrive metabolsk aktivitet mer presist. Den eneste enzymatiske testen som viste suboptimal effekt var den kvalitative proteastesten, med et lavt antall stammer som kunne vokse på JA-mediet. Faktisk antyder den høye prosentandelen av stammer som er i stand til å vokse på PUR at sopp produserte proteaser involvert i å bryte amid- og uretanbindingene, med esterase rettet mot esterbindingene40. Det nesten fullstendige fraværet av proteaseproduserende sopp tyder på at det kan ha vært et problem i metoden som brukes. Andre tester kan tas i bruk for proteaseaktivitet, for eksempel kasein41, skummet melk42 eller melkepulver43 agarplatetester. Den galliske syretesten viste seg å være svært nyttig for å oppdage produksjonen av ligninolytiske enzymer, men dessverre var den ikke veldig spesifikk og kunne ikke skille mellom typen ligninolytisk enzym produsert (enten peroksidaser eller lakcaser).

Resultatene av dette arbeidet tyder på at bruk av lignocellulose eller humsyrer som selektive medier gjør at soppstammer med bioremedieringspotensial kan isoleres fra det rike jordmangfoldet. Faktisk var mer enn 70% av soppstammene isolert av de selektive metodene i stand til å vokse på petrolatum eller brukt motorolje, og 60% var i stand til å vokse på forskjellige plastpolymerer som eneste karbonkilde. Videre beskrev de kvalitative enzymatiske testene den metabolske aktiviteten til disse soppene knyttet til biologisk nedbrytningsprosesser. Utvalget av soppstammer som viser +++ aktivitet i en eller flere tester anbefales fordi det øker sjansene for å finne en soppstamme som er veldig aktiv i bioremediering. Tester ved bruk av gassmassekrommatografi (GC-MS) på de tilbakevendende stoffene etter langvarig kontakt med soppstammene valgt med våre screeningtester har vist faktisk biologisk nedbrytning av materialene 9,44. Bruken av disse enkle screeningtestene i ulike økosystemer vil tillate undersøkelse av soppmangfold i forskjellige jordarter. Søk etter sopp som kan forringe tilbakevendende materialer vil øke antall identifiserte stammer som har potensial for bioremediering og bidra til å takle det økende problemet med miljøforurensning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi anerkjenner Scuola di Alta Formazione Dottorale (SAFD) ved Universitetet i Pavia og professor Solveig Tosi for å gi mulighet for dette arbeidet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 microwell plate Greiner bio-one 650185
Agar VWR 84609.05
Bushnell-Haas Broth Fluka B5051
CaCl2 Sigma-Aldrich C5670
Chloroamphenicol Eurobio GABCRL006Z
Chlortetracycline Sigma-Aldrich Y0001451
CoCl2·6H2O Sigma-Aldrich C8661
CuCl2·2H2O Sigma-Aldrich C3279
Ethanol VWR Chemicals 20821.296
FeCl3·6H2O Sigma-Aldrich 236489
Filter 0.2 µm Whatman 10462200
gallic acid Sigma-Aldrich G7384
Glass cover slips Biosigma VBS634
Glass vials 15 mL SciLabware P35467
guaiacol Sigma-Aldrich G5502
High-density polyethylene (HDPE) Sigma-Aldrich 434272
Humic acids Aldrich Chemistry 53680
K2HPO4 Sigma-Aldrich P8281
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5655
Lignocellulose / / Sterilized bioethanol production waste
L-shaped cell spreader Laboindustria S.p.a 21133
magnetic stirrer A.C.E.F 8235
Malt Extract Broth Sigma-Aldrich 70146
MgSO4·7H2O Sigma-Aldrich M2643
Micropipette 1000 μL Gilson FA10006M
Micropipette 200  μL Gilson FA10005M
MnCl2·4H2O Sigma-Aldrich M5005
Na2MoO4·2H2O Sigma-Aldrich M1651
NaCl Sigma-Aldrich S5886
Neomycin Sigma-Aldrich N0401000
Penicillin Sigma-Aldrich 1504489
peptone Sigma-Aldrich 83059
Polyethylene terephthalate (PET) Goodfellow ES306031
Petri dishes Laboindustria S.p.a 21050
Petrolatum (Paraffin liquid) A.C.E.F 009661
Potato Dextrose Broth Sigma-Aldrich P6685
Polystyrene (PS) Sigma-Aldrich 331651
Polyurethane (PUR) Sigma-Aldrich GF20677923
Polyvinyl chloride (PVC) Sigma-Aldrich 81388
Sterile falcon tube Greiner bio-one 227 261
Sterile glass vials 20 mL Sigma-Aldrich SU860051
Sterile point 1000  μL Gilson F172511
Sterile point 200  μL Gilson F172311
Sterile polyethylene bags WHIRL-PAK B01018
sterile syringe Rays 5523CM25
Streptomycin Sigma-Aldrich S-6501
Tween 80 Sigma-Aldrich P1754
Used engine oil / / complex mixture of hydrocarbons, engine additives, and metals, provided by an Italian private company
Vials 50 mL Sigma-Aldrich 33108-U
ZnCl2 Sigma-Aldrich Z0152

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mohammadi, K., Heidari, G., Khalesro, S., Sohrabi, Y. Soil management, microorganisms and organic matter interactions: A review. African Journal of Biotechnology. 10 (86), 19840-19849 (2011).
  2. Daccò, C., Girometta, C., Asemoloye, M. D., Carpani, G., Picco, A. M., Tosi, S. Key fungal degradation patterns, enzymes and their applications for the removal of aliphatic hydrocarbons in polluted soils: A review. International Biodeterioration and Biodegradation. 147, (2020).
  3. Asemoloye, M. D., Ahmad, R., Jonathan, S. G. Synergistic action of rhizospheric fungi with Megathyrsus maximus root speeds up hydrocarbon degradation kinetics in oil polluted soil. Chemosphere. 187, 1-10 (2017).
  4. Abatenh, E., Gizaw, B., Tsegaye, Z., Wassie, M. The role of microorganisms in bioremediation - A review. Open Journal of Environmental Biology. 2, 038-046 (2017).
  5. Dix, N. J., Webster, J. Fungal Ecology. , Chapman & Hall. Cambridge, UK. (1995).
  6. Magan, N. Fungi in extreme environment. Environmental and Microbial Relationships. The Mycota. Esser, K., Lemke, P. A. 4, Springer. Berlin, Heidelberg. 99-114 (2007).
  7. Aranda, E. Promising approaches towards biotransformation of polycyclic aromatic hydrocarbons with Ascomycota fungi. Current Opinion in Biotechnology. 38, 1-8 (2016).
  8. Hasan, I. F., AI-Jawhari, Role of Filamentous Fungi to Remove Petroleum Hydrocarbons from the Environment. Microbial Action on Hydrocarbons. Kumar, V., Kumar, M., Prasad, R. , Springer. Singapore. (2018).
  9. Daccò, C., et al. Trichoderma: evaluation of its degrading abilities for the bioremediation of hydrocarbon complex mixtures. Applied Sciences. 10 (9), 3152 (2020).
  10. Alarcón, A., Davies, F. T., Autenrieth, R. L., Zuberer, D. A. Arbuscular mycorrhiza and petroleum-degrading microorganisms enhance phytoremediation of petroleum-contaminated soil. International Journal of Phytoremediation. 10, 251-263 (2008).
  11. Mancera-López, M. E., et al. Bioremediation of an aged hydro-carbon-contaminated soil by a combined system of biostimulation-bioaugmentation with filamentous fungi. International Biodeterioration and Biodegradation. 61, (2008).
  12. Hatami, E., Abbaspour, A., Dorostkar, V. Phytoremediation of a petroleum-polluted soil by native plant species in Lorestan Province, Iran. Environmental Science and Pollution Research. 26, 24323-24330 (2019).
  13. Prenafeta-Boldú, F. X., De Hoog, G. S., Summerbell, R. C. Fungal communities in hydrocarbon degradation. Microbial Communities Utilizing Hydrocarbons and Lipids: Members, Metagenomics and Ecophysiology. Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology. , Springer. Cham. 1-36 (2018).
  14. Gu, J., Ford, T., Mitton, D., Mitchell, R. Microbiological degradation of polymeric materials. Uhlig's Corrosion Handbook. , John Wiley and Sons. 421-438 (2011).
  15. Tuomela, M., Hatakka, A. Oxidative fungal enzymes for bioremediation. Comprehensive Biotechnology: Environmental and Related Biotechnologies. 6, Elsevier. 224-239 (2019).
  16. DSouza, G. C., et al. Fungal biodegradation of low-density polyethylene using consortium of Aspergillus species under controlled conditions. Heliyon. 7 (5), 07008 (2021).
  17. El-Sayed, M. T., Rabie, G. H., Hamed, E. A. Biodegradation of low-density polyethylene (LDPE) using the mixed culture of Aspergillus carbonarius and A. fumigates. Environment, Development, and Sustainability. 23 (10), 14556-14584 (2021).
  18. Sepperumal, U., Markandan, M., Palraja, I. Micromorphological and chemical changes during biodegradation of polyethylene terephthalate (PET) by Penicillium sp. Journal of Microbiology and Biotechnology Research. 3 (4), 47-53 (2013).
  19. Leitão, A. L. Potential of Penicillium species in the bioremediation field. International Journal of Environmental Research and Public Health. 6 (4), 1393-1417 (2009).
  20. Chen, S. H., Ting, A. S. Y. Biosorption and biodegradation potential of triphenylmethane dyes by newly discovered Penicillium simplicissimum isolated from indoor wastewater sample. International Biodeterioration & Biodegradation. 103, 1-7 (2015).
  21. Orhan, Y., Buyukgungor, H. Enhancement of biodegradability of disposable polyethylene in controlled biological soil. International Biodeterioration and Biodegradation. 45, 49-55 (2000).
  22. Deshmukh, R., Khardenavis, A. A., Purohit, H. J. Diverse metabolic capacities of fungi for bioremediation. Indian journal of microbiology. 56 (3), 247-264 (2016).
  23. Viswanath, B., Rajesh, B., Janardhan, A., Kumar, A. P., Narasimha, G. Fungal laccases and their applications in bioremediation. Enzyme research. 2014, 163242 (2014).
  24. Ali, M., Husain, Q., Ishqi, H. M. Fungal peroxidases mediated bioremediation of industrial pollutants. Fungal Bioremediation. , CRC Press. Boca Raton. (2019).
  25. Nousiainen, P., Kontro, J., Manner, H., Hatakka, A., Sipilä, J. Phenolic mediators enhance the manganese peroxidase catalyzed oxidation of recalcitrant lignin model compounds and synthetic lignin. Fungal Genetics and Biology. 72, 137-149 (2014).
  26. Srivastava, S., Kumar, M. Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs): A sustainable approach. Sustainable Green Technologies for Environmental Management. , Springer. Singapore. (2019).
  27. Wei, R., Zimmermann, W. Microbial enzymes for the recycling of recalcitrant petroleum-based plastics: how far are we. Microbial Biotechnology. 10 (6), 1308-1322 (2017).
  28. Matsubara, M., Lynch, J. M., De Leij, F. A. A. M. A simple screening procedure for selecting fungi with potential for use in the bioremediation of contaminated land. Enzyme and Microbial Technology. 39 (7), 1365-1372 (2006).
  29. Mann, J., et al. Screening and selection of fungi for bioremediation of olive mill wastewater. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 26 (3), 567-571 (2010).
  30. Andlar, M., Rezić, T., Marđetko, N., Kracher, D., Ludwig, R., Šantek, B. Lignocellulose degradation: an overview of fungi and fungal enzymes involved in lignocellulose degradation. Engineering in Life Sciences. 18, 768-778 (2018).
  31. Goméz-Toribio, V., García-Martín, A. B., Martínez, M. J., Martínez, A. T., Guillén, F. Induction of extracellular hydroxyl radical production by white-rot fungi through quinone redox cycling. Applied and Environmental Microbiology. 75, 3944-3953 (2009).
  32. Belcarz, A., Ginalska, G., Kornillowicz-Kowalska, T. Extracellular enzyme activities of Bjerkandera adusta R59 soil strain, capable of daunomycin and humic acids degradation. Applied Microbiology and Biotechnology. 68 (5), 686-694 (2005).
  33. Stevenson, F. J. Humus Chemistry: Genesis, Composition, Reactions. 2nd ed. , Wiley. New York. (1995).
  34. Andlar, M., et al. Lignocellulose degradation: An overview of fungi and fungal enzymes involved in lignocellulose degradation. Engineering in Life Sciences. 18 (11), 768-778 (2018).
  35. Lee, H., et al. Biotechnological procedures to select white rot fungi for the degradation of PAHs. Journal of Microbiological Methods. 97 (1), 56-62 (2014).
  36. Batista-García, R. A., et al. Simple screening protocol for identification of potential mycoremediation tools for the elimination of polycyclic aromatic hydrocarbons and phenols from hyperalkalophile industrial effluents. Journal of Environmental Management. 198, 1-11 (2017).
  37. Shleev, S. V., et al. Comparison of physico-chemical characteristics of four laccases from different basidiomycetes. Biochimie. 86 (9-10), (2004).
  38. Kiiskinen, L. L., Rättö, M., Kruus, K. Screening for novel laccase-producing microbes. Journal of Applied Microbiology. 97, (2004).
  39. Kumar, V. V., Rapheal, V. S. Induction and purification by three-phase partitioning of aryl alcohol oxidase (AAO) from Pleurotus ostreatus. Applied Biochemistry and Biotechnology. , 163 (2011).
  40. Loredo-Treviño, A., Gutiérrez-Sánchez, G., Rodríguez-Herrera, R., Aguilar, C. N. Microbial enzymes involved in polyurethane biodegradation: a review. Journal of Polymers and the Environment. 20 (1), 258-265 (2012).
  41. Garriga, M., et al. Technological and sensorial evaluation of Lactobacillus strains as starter cultures in fermented sausages. International Journal of Food Microbiology. 32 (1-2), 173-183 (1996).
  42. Zerdani, I., Faid, M., Malki, A. Feather wastes digestion by new isolated strains Bacillus sp. In microcco. African Journal of Biotechnology. 3 (1), 67-70 (2004).
  43. Nygren, C. M., Edqvist, J., Elfstrand, M., Heller, G., Taylor, A. F. Detection of extracellular protease activity in different species and genera of ectomycorrhizal fungi. Mycorrhiza. 17 (3), 241-248 (2007).
  44. Asemoloye, M. D., et al. Hydrocarbon degradation and enzyme activities of Aspergillus oryzae and Mucor irregularis isolated from Nigerian crude oil-polluted sites. Microorganisms. 8 (12), 1912 (2020).

Tags

Biologi Utgave 183 Sopp jord biologisk mangfold bioremediering screeningtest hydrokarboner plast enzymatisk aktivitet
Isolasjon og screening fra jordmangfold for sopp involvert i nedbrytning av tilbakevendende materialer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Temporiti, M. E. E., Daccò, C., … More

Temporiti, M. E. E., Daccò, C., Nicola, L. Isolation and Screening from Soil Biodiversity for Fungi Involved in the Degradation of Recalcitrant Materials. J. Vis. Exp. (183), e63445, doi:10.3791/63445 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter