Bioprospektion extremophiler Mikroorganismen zur Bekämpfung der Umweltverschmutzung

Summary

Die Isolierung von schwermetallbeständigen Mikroben aus geothermischen Quellen ist ein heißes Thema für die Entwicklung von Bioremediations- und Umweltüberwachungsbiosystemen. Diese Studie bietet einen methodischen Ansatz zur Isolierung und Identifizierung von schwermetalltoleranten Bakterien aus heißen Quellen.

Abstract

Geothermische Quellen sind aufgrund der Wechselwirkung zwischen Gestein und Wasser, die im tiefen Grundwasserleiter stattfindet, reich an verschiedenen Metallionen. Darüber hinaus wird aufgrund der saisonalen Variation von pH-Wert und Temperatur in diesen extremen Umgebungen periodisch eine Fluktuation der Elementzusammensetzung beobachtet, die die mikrobiellen Umweltgemeinschaften beeinflusst. Extremophile Mikroorganismen, die in vulkanischen Wärmequellen gedeihen, haben Resistenzmechanismen entwickelt, um mehrere in der Umwelt vorhandene Metallionen zu handhaben und so an komplexen biogeochemischen Metallkreisläufen teilzunehmen. Darüber hinaus haben Extremophile und ihre Produkte auf dem Markt Fuß gefasst, und dies gilt insbesondere für ihre Enzyme. In diesem Zusammenhang ist ihre Charakterisierung funktional für die Entwicklung von Biosystemen und Bioprozessen zur Umweltüberwachung und Bioremediation. Bis heute stellen die Isolierung und Kultivierung extremophiler Mikroorganismen unter Laborbedingungen einen Engpass dar, um ihr biotechnologisches Potenzial voll auszuschöpfen. Diese Arbeit beschreibt ein optimiertes Protokoll zur Isolierung thermophiler Mikroorganismen aus heißen Quellen sowie deren genotypische und phänotypische Identifizierung durch die folgenden Schritte: (1) Probenahme von Mikroorganismen aus geothermischen Gebieten (“Pisciarelli”, ein vulkanisches Gebiet von Campi Flegrei in Neapel, Italien); (2) Isolierung von schwermetallresistenten Mikroorganismen; (3) Identifizierung von mikrobiellen Isolaten; (4) Phänotypische Charakterisierung der Isolate. Die in dieser Arbeit beschriebenen Methoden können im Allgemeinen auch für die Isolierung von Mikroorganismen aus anderen extremen Umgebungen angewendet werden.

Introduction

Die extremen Umgebungen auf unserem Planeten sind ausgezeichnete Quellen für Mikroorganismen, die in der Lage sind, raue Bedingungen (d.h. Temperatur, pH-Wert, Salzgehalt, Druck und Schwermetalle) zu ^{tolerieren1,2}, wobei Island, Italien, USA, Neuseeland, Japan, Zentralafrika und Indien, die am besten anerkannten und untersuchten vulkanischen Gebiete^sind 3,4,5,6,7,8,9 . Thermophile haben sich in rauen Umgebungen in einem Temperaturbereich von 45 °C bis 80 °C^10,11,12 entwickelt. Thermophile Mikroorganismen, die entweder zum archaealen oder bakteriellen Königreich gehören, sind ein Reservoir für das Studium der Biodiversität, der Phylogenese und der Produktion exklusiver Biomoleküle für industrielle Anwendungen ^13,14,15,16. In der Tat hat in den letzten Jahrzehnten die kontinuierliche industrielle Nachfrage auf dem Weltmarkt die Ausbeutung von Extremophilen und Thermozymen für ihre vielfältigen Anwendungen in verschiedenen biotechnologischen Bereichen gefördert ^17,18,19.

Heiße Quellen, in denen Organismen in Konsortien leben, sind reiche Quellen der biologischen Vielfalt und stellen somit einen attraktiven Lebensraum für die Erforschung der mikrobiellen Ökologie^{dar 20,21}. Darüber hinaus werden diese vulkanischen metallreichen Gebiete häufig von Mikroorganismen besiedelt, die Toleranzsysteme entwickelt haben, um zu überleben und sich an das Vorhandensein von Schwermetallen anzupassen^22,23 und daher aktiv an ihren biogeochemischen ^Kreisläufen beteiligt sind. Schwermetalle gelten heute als prioritäre Schadstoffe für Mensch und Umwelt. Die schwermetallresistenten Mikroorganismen sind in der Lage, Metalle zu lösen und auszufällen, indem sie sie transformieren und ihre Ökosysteme umgestalten^24,25. Das Verständnis der molekularen Mechanismen der Schwermetallresistenz ist ein heißes Thema für die Dringlichkeit, neuartige grüne Ansätze zu entwickeln^26,27,28. In diesem Zusammenhang stellt die Entdeckung neuer toleranter Bakterien den Ausgangspunkt für die Entwicklung neuer Strategien zur ökologischen Bioremediation^{dar 24,29}. Begleitend zu den Bemühungen, hydrothermale Umgebungen durch mikrobiologische Verfahren zu erforschen und das Wissen über die Rolle der Gene, die der Schwermetalltoleranz zugrunde liegen, zu erweitern, wurde ein mikrobielles Screening im Thermalgebiet von Campi Flegrei in Italien durchgeführt. Diese schwermetallreiche Umgebung zeigt eine starke hydrothermale Aktivität, Fumarol- und Siedebecken, die in Abhängigkeit von Saisonalität, Niederschlag und geologischen unterirdischen Bewegungen variabel^{sind 30}. In dieser Perspektive beschreiben wir eine einfach anzuwendende und wirksame Möglichkeit, Bakterien, die gegen Schwermetalle resistent sind, zu isolieren, zum Beispiel Geobacillus stearothermophilus GF16³¹ (benannt als Isolat 1) und Alicyclobacillus mali ^{FL18 32} (benannt als Isolat 2) aus dem Pisciarelli-Gebiet von Campi Flegrei.

Protocol

1. Probenahme von Mikroorganismen aus geothermischen Standorten Wählen Sie den Ort für die Probenahme anhand von Kriterienorten mit gewünschter Temperatur und pH-Wert. Messen Sie die physikalischen Parameter durch eine digitale Thermoelementsonde und führen Sie sie in die ausgewählten Becken oder Schlämme ein. Sammeln Sie 20 g Bodenproben (in diesem Fall aus Schlamm in der hydrothermalen Stätte von Pisciarelli Solfatara) und sammeln Sie sie mit einem sterilisierten Löffel. Neh…

Representative Results

ProbenahmestelleDieses Protokoll veranschaulicht eine Methode zur Isolierung von schwermetallresistenten Bakterien aus einer heißen Quelle. In dieser Studie wurde das Gebiet von Pisciarelli, eine säuresulfidische geothermale Umgebung, als Probenahmestelle verwendet (Abbildung 1). Dieses Ökosystem zeichnet sich durch den Fluss aggressiver schwefelhaltiger Flüssigkeiten aus, die aus vulkanischen Aktivitäten stammen. Es wurde gezeigt, dass die mikrobie…

Discussion

Heiße Quellen enthalten eine ungenutzte Vielfalt von Mikrobiomen mit ebenso unterschiedlichen Stoffwechselkapazitäten¹². Die Entwicklung von Strategien zur Isolierung von Mikroorganismen, die Schwermetalle effizient in weniger toxische Verbindungen^{umwandeln können 10} stellt weltweit ein Forschungsgebiet von wachsendem Interesse dar. Dieses Papier zielt darauf ab, einen optimierten Ansatz für das Screening und die Isolierung von Mikroben mit der Fähigkeit, toxischen Che…

Materials

Ampicillin	Sigma Aldrich	A9393
Aura Mini	bio air s.c.r.l.		Biological hood
Bacitracin	Sigma Aldrich	B0125
Cadmium chloride	Sigma Aldrich	202908
Chloramphenicol	Sigma Aldrich	C0378
Ciprofloxacin	Sigma Aldrich	17850
Cobalt chloride	Sigma Aldrich	C8661
Copper chloride	Sigma Aldrich	224332
Erythromycin	Sigma Aldrich	E5389
Exernal Service	DSMZ		Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH
Genomic DNA Purification Kit	Thermo Scientific	#K0721
Kanamycin sulphate	Sigma Aldrich	60615
MaxQTM 4000 Benchtop Orbital Shaker	Thermo Scientific	SHKE4000
Mercury chloride	Sigma Aldrich	215465
NanoDrop 1000 Spectrophotometer	Thermo Scientific
Nickel chloride	Sigma Aldrich	654507
Orion Star A221 Portable pH Meter	Thermo Scientific	STARA2218
Sodium (meta) arsenite	Sigma Aldrich	S7400
Sodium arsenate dibasic heptahydrate	Sigma Aldrich	A6756
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S5886
Streptomycin	Sigma Aldrich	S6501
Tetracycline	Sigma Aldrich	87128
Tryptone BioChemica	Applichem Panreac	A1553
Vancomycin	Sigma Aldrich	PHR1732
Yeast extract for molecular biology	Applichem Panreac	A3732