Isolering af tungmetalresistente mikrober fra geotermiske kilder er et varmt emne for udviklingen af bioremediering og miljøovervågningsbiosystemer. Denne undersøgelse giver en metodologisk tilgang til isolering og identifikation af tungmetaltolerante bakterier fra varme kilder.
Geotermiske kilder er rige på forskellige metalioner på grund af samspillet mellem sten og vand, der finder sted i det dybe akvifer. På grund af sæsonvariation i pH og temperatur observeres der desuden periodisk udsving i elementsammensætningen inden for disse ekstreme miljøer, hvilket påvirker de miljømæssige mikrobielle samfund. Ekstremofile mikroorganismer, der trives i vulkanske termiske ventilationskanaler, har udviklet resistensmekanismer til at håndtere flere metalioner, der er til stede i miljøet, og dermed deltage i komplekse metalbiogeokemiske cyklusser. Desuden har ekstremofiler og deres produkter fundet et omfattende fodfæste på markedet, og det gælder især for deres enzymer. I denne sammenhæng er deres karakterisering funktionel for udviklingen af biosystemer og bioprocesser til miljøovervågning og bioremediering. Hidtil udgør isolering og dyrkning under laboratorieforhold af ekstremofile mikroorganismer stadig en flaskehals for fuldt ud at udnytte deres bioteknologiske potentiale. Dette arbejde beskriver en strømlinet protokol for isolering af termofile mikroorganismer fra varme kilder samt deres genotypiske og fænotypiske identifikation gennem følgende trin: (1) Prøveudtagning af mikroorganismer fra geotermiske steder (“Pisciarelli”, et vulkansk område i Campi Flegrei i Napoli, Italien); 2) Isolering af tungmetalresistente mikroorganismer 3) Identifikation af mikrobielle isolater (4) Fænotypisk karakterisering af isolaterne. De metoder, der er beskrevet i dette arbejde, kan generelt også anvendes til isolering af mikroorganismer fra andre ekstreme miljøer.
De ekstreme miljøer på vores planet er fremragende kilder til mikroorganismer, der er i stand til at tolerere barske forhold (dvs. temperatur, pH, saltholdighed, tryk og tungmetaller)1,2, idet de er Island, Italien, USA, New Zealand, Japan, Centralafrika og Indien, de bedst anerkendte og studerede vulkanske områder 3,4,5,6,7,8,9 . Termofiler har udviklet sig i barske miljøer i en række temperaturer fra 45 ° C til 80 ° C 10,11,12. Termofile mikroorganismer, der enten tilhører de arkæale eller bakterielle kongeriger, er et reservoir til undersøgelse af biodiversitet, fylogenese og produktion af eksklusive biomolekyler til industrielle anvendelser 13,14,15,16. Faktisk har den fortsatte industrielle efterspørgsel på det globale marked i de sidste årtier tilskyndet til udnyttelse af ekstremofiler og termozymer til deres diversificerede anvendelser inden for flere bioteknologiske områder 17,18,19.
Varme kilder, hvor organismer lever i konsortier, er rige kilder til biodiversitet og repræsenterer således et attraktivt levested for at studere mikrobiel økologi20,21. Desuden koloniseres disse vulkanske metalrige områder almindeligvis af mikroorganismer, der har udviklet tolerancesystemer til at overleve og tilpasse sig tilstedeværelsen af tungmetaller22,23 og er derfor aktivt involveret i deres biogeokemiske cyklusser. I dag betragtes tungmetaller som prioriterede forurenende stoffer for mennesker og miljø. De tungmetalresistente mikroorganismer er i stand til at opløse og udfælde metaller ved at omdanne dem og ombygge deres økosystemer24,25. Forståelsen af de molekylære mekanismer for tungmetalresistens er et varmt emne for det presserende behov for at udvikle nye grønne tilgange 26,27,28. I den forbindelse udgør opdagelsen af nye tolerante bakterier udgangspunktet for at udvikle nye strategier for miljømæssig bioremediering24,29. Som led i bestræbelserne på at udforske hydrotermiske miljøer gennem mikrobiologiske procedurer og øge kendskabet til den rolle, som genet/generne, der understøtter tungmetaltolerancen, spiller, blev der foretaget en mikrobiel screening i det varme kildeområde Campi Flegrei i Italien. Dette tungmetalrige miljø viser en kraftig hydrotermisk aktivitet, fumarol og kogende puljer, variabel i pH og temperatur i afhængighed af sæsonbestemthed, nedbør og underjordiske geologiske bevægelser30. I dette perspektiv beskriver vi en let anvendelig og effektiv måde at isolere bakterier, der er resistente over for tungmetaller, for eksempel Geobacillus stearothermophilus GF1631 (navngivet som isolat 1) og Alicyclobacillus mali FL1832 (navngivet som isolat 2) fra Pisciarelli-området i Campi Flegrei.
Varme kilder indeholder en uudnyttet mangfoldighed af mikrobiomer med lige så forskellige metaboliske kapaciteter12. Udviklingen af strategier for isolering af mikroorganismer, der effektivt kan omdanne tungmetaller til mindre giftige forbindelser10 , repræsenterer et forskningsområde af stigende interesse på verdensplan. Dette papir har til formål at beskrive en strømlinet tilgang til screening og isolering af mikrober med evnen til at modstå giftige kemikalier. Den…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af ERA-NET Cofund MarTERA: “FLAshMoB: Functional Amyloid Chimera for Marine Biosensing”, PRIN 2017-PANACEA CUP:E69E19000530001 og af GoodbyWaste: ObtainGOOD products-exploit BY-products-reduce WASTE, MIUR 2017-JTNK78.006, Italien. Vi takker Dr. Monica Piochi og Dr. Angela Mormone (Istituto Nazionale di Geofisica e Vulcanologia, Sezione di Napoli Osservatorio Vesuviano, Italien) for identifikation og karakterisering af geotermisk sted.
Ampicillin | Sigma Aldrich | A9393 | |
Aura Mini | bio air s.c.r.l. | Biological hood | |
Bacitracin | Sigma Aldrich | B0125 | |
Cadmium chloride | Sigma Aldrich | 202908 | |
Chloramphenicol | Sigma Aldrich | C0378 | |
Ciprofloxacin | Sigma Aldrich | 17850 | |
Cobalt chloride | Sigma Aldrich | C8661 | |
Copper chloride | Sigma Aldrich | 224332 | |
Erythromycin | Sigma Aldrich | E5389 | |
Exernal Service | DSMZ | Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH | |
Genomic DNA Purification Kit | Thermo Scientific | #K0721 | |
Kanamycin sulphate | Sigma Aldrich | 60615 | |
MaxQTM 4000 Benchtop Orbital Shaker | Thermo Scientific | SHKE4000 | |
Mercury chloride | Sigma Aldrich | 215465 | |
NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
Nickel chloride | Sigma Aldrich | 654507 | |
Orion Star A221 Portable pH Meter | Thermo Scientific | STARA2218 | |
Sodium (meta) arsenite | Sigma Aldrich | S7400 | |
Sodium arsenate dibasic heptahydrate | Sigma Aldrich | A6756 | |
Sodium chloride | Sigma Aldrich | S5886 | |
Streptomycin | Sigma Aldrich | S6501 | |
Tetracycline | Sigma Aldrich | 87128 | |
Tryptone BioChemica | Applichem Panreac | A1553 | |
Vancomycin | Sigma Aldrich | PHR1732 | |
Yeast extract for molecular biology | Applichem Panreac | A3732 |