在 奥沃 鸡胚血管内注射
1Joint International Research Laboratory of Agriculture and Agri-Product Safety of Ministry of Education of China,Yangzhou University, 2Key Laboratory of Animal Breeding Reproduction and Molecular Design for Jiangsu Province, College of Animal Science and Technology,Yangzhou University, 3Animal & Avian Sciences,University of Maryland, College Park, 4College of Biotechnology,Jiangsu University of Science and Technology
Summary
本文的总体目标是描述如何在卵细胞内将外源性物质注射到鸡胚 中 。这种方法对于研究鸡胚的发育生物学非常有用。
Abstract
作为胚胎生物学的经典模型系统，鸡胚已被用于研究胚胎发育和分化。将外源物质递送到鸡胚中，对于研究胚胎发育过程中的基因功能、转基因育种和嵌合体制备具有很大的优势。在这里，我们展示了 在卵子 血管内注射中的方法，其中外源性物质如质粒载体或修饰的原始生殖细胞（PGCs）可以在早期发育阶段转移到供体鸡胚胎中。结果表明，通过背主动脉和头部的血管内注射允许注射的物质通过血液循环系统扩散到整个胚胎中。在所提出的方案中，通过观察胚胎中的荧光，确定了外源质粒和慢病毒载体引入的疗效，以及注射的外源PGC在受体性腺中的定植。本文介绍了该方法的详细程序，从而为研究基因功能，胚胎和发育生物学以及性腺嵌合鸡的生产提供了极好的方法。综上所述，本文将使研究人员 能够在卵 子血管内将外源物质注射到鸡胚中，取得巨大成功和可重复性。
Introduction
几个世纪以来，鸡胚已被广泛用于发育，免疫，病理和其他生物学应用1，2，3。它们在毒理学和细胞生物学研究中比其他动物模型具有许多固有的优势4.鸡胚易于获取，可以在 体外 操纵并在任何发育阶段直接观察，这提供了一个方便的胚胎研究模型系统。
一般来说，目前的鸡胚胎递送方法，如电转染和胚芽下腔注射，具有局限性，例如需要专业设备和设计的程序，并且由于蛋黄和蛋白5，6，7的存在而效率低下。在这里，我们展示了一种将外源性物质输送到鸡胚中的简单有效的处理方法。这可以成为用于发育生物学研究的强大工具。注射的材料 通过 血液循环扩散到整个胚胎。在鸡胚胎的早期发育过程中，PGCs可以通过血液迁移，定植于生殖器脊，然后发育成配子，这为传递外源性物质提供了有价值的可能途径8。现在，该方法已广泛应用于研究基因功能、胚胎和发育生物学，以及嵌合和转基因鸡的生产9，10，11。
在蛋黄 血管内注射鸡胚中是一种完善和常用的方法12，13，14。在本文中，我们展示了该方案的全面描述，包括注射材料，部位，剂量和代表性结果。
Protocol
所有涉及动物护理和使用的程序均符合美国国立卫生研究院指南（NIH Pub. No. 85-23，1996年修订）和鸡胚胎方案均获得中国扬州大学实验动物管理和实验动物伦理委员会的批准（No.201803124）。 1. 受精卵收集和制备 注意：与哺乳动物不同，鸡在单个卵巢中有数百万个卵泡，但只有少数这些卵泡成熟到足以排卵。每个卵泡含有一个卵母细胞或生殖细?…
Representative Results
我们在这里展示了在 卵子 血管内注射鸡胚。血管内注射的过程示意图如图 1所示;在我们的研究中，我们使用各种外源性溶液来测试和验证注射。 为了更好地可视化注射的材料，台盼蓝（0.4%）作为示踪剂注射到胚胎中。观察到示踪剂（蓝色）通过背主动脉或头部注射 通过 血液循环扩散到整个胚胎（图2）。在两个不?…
Discussion
在 卵 子血管内注射鸡胚胎的方法针对要转移到胚胎中的外源性物质（载体，病毒或PGC）进行了优化。基于该方法，我们构建了具有稳定基因过表达或干扰的鸡胚模型（SpinZ，JUN，UBE2I等）。17，18，19.这些成熟的模型证明了这种方法的可行性。此外，我们不仅将分离的PGCs转移到受体的胚胎性腺上，而且还成功地用诱导的P…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了国家自然科学基金（31972547）的支持。我们感谢王静的文案编辑和美国华盛顿州立大学马利克·唐利克的画外音。
Materials
| Fluorescence macro-microscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Glass Capillaries | Narishige | G1 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 12566014 | liposome |
| pEGFP-N1 vector | Clontech | #6085-1 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit | Sigma | PKH26GL | |
| pLVX-EGFP lentivirus vector | Addgene | 128652 | |
| Pneumatic Microinjector | Narishige | IM-11-2 | |
| Puller | Narishige | PC-100 | |
| Trypan Blue Stain | Gibco | 15250061 |
Riferimenti
- Bednarczyk, M., Dunislawska, A., Stadnicka, K., Grochowska, E. Chicken embryo as a model in epigenetic research. Poultry Science. 100 (7), 101164 (2021).
- Darnell, D. K., Schoenwolf, G. C. The chick embryo as a model system for analyzing mechanisms of development. Developmental Biology Protocols. , 25-29 (2000).
- Fauzia, E., et al. Chick embryo: a preclinical model for understanding ischemia-reperfusion mechanism. Frontiers in Pharmacology. 9, 1034 (2018).
- Fonseca, B. B., da Silva, M. V., de Morais Ribeiro, L. N. The chicken embryo as an in vivo experimental model for drug testing: Advantages and limitations. Lab Animal. 50 (6), 138-139 (2021).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In ovo electroporations of HH stage 10 chicken embryos. Journal of Visualized Experiments. (9), e408 (2007).
- Islam, M. M., Doh, S. T., Cai, L. In ovo electroporation in embryonic chick retina. Journal of Visualized Experiments. (60), e3792 (2012).
- Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. In ovo electroporation in the chicken auditory brainstem. Journal of Visualized Experiments. (124), e55628 (2017).
- van de Lavoir, M. -. C., et al. Germline transmission of genetically modified primordial germ cells. Nature. 441 (7094), 766-769 (2006).
- Ballantyne, M., et al. Avian primordial germ cells are bipotent for male or female gametogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 726827 (2021).
- Park, T. S., Han, J. Y. piggyBac transposition into primordial germ cells is an efficient tool for transgenesis in chickens. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (24), 9337-9341 (2012).
- Lee, H. J., et al. Targeted gene insertion into Z chromosome of chicken primordial germ cells for avian sexing model development. The FASEB Journal. 33 (7), 8519-8529 (2019).
- Han, J. Y., Lee, B. R. Isolation and characterization of chicken primordial germ cells and their application in transgenesis. Avian and Reptilian Developmental Biology: Methods and Protocols. , 229-242 (2017).
- Naito, M., Harumi, T., Kuwana, T. Long-term culture of chicken primordial germ cells isolated from embryonic blood and production of germline chimaeric chickens. Animal Reproduction Science. 153, 50-61 (2015).
- Yu, F., et al. Isolation, characterization and germline chimera preparation of primordial germ cells from the Chinese Meiling chicken. Poultry Science. 98 (2), 566-572 (2019).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Zhang, Z., et al. Crucial genes and pathways in chicken germ stem cell differentiation. The Journal of Biological Chemistry. 290 (21), 13605-13621 (2015).
- Jin, K., et al. UBE2I stimulates female gonadal differentiation in chicken (Gallus gallus) embryos. Journal of Integrative Agriculture. 20 (11), 2986-2994 (2021).
- Shi, X., et al. HMGCS1 promotes male differentiation of chicken embryos by regulating the generate of cholesterol. All Life. 14 (1), 577-587 (2021).
- Jiang, J., et al. Spin1z induces the male pathway in the chicken by down-regulating Tcf4. Gene. 780, 145521 (2021).
- Zhao, R., et al. Production of viable chicken by allogeneic transplantation of primordial germ cells induced from somatic cells. Nature Communications. 12 (1), 2989 (2021).
Citazione di questo articolo
Jin, K., Zhou, J., Wu, G., Lian, Z., Zhao, Z., Zhou, S., Chen, C., Sun, H., Niu, Y., Zuo, Q., Zhang, Y., Song, J., Chen, G., Li, B. In Ovo Intravascular Injection in Chicken Embryos. J. Vis. Exp. (184), e63458, doi:10.3791/63458 (2022).