In zona Ovo Iniezione intravascolare in embrioni di pollo
Summary
L’obiettivo generale di questo articolo è quello di descrivere come eseguire l’iniezione intracellulare ovo di materiali esogeni in embrioni di pollo. Questo approccio è molto utile per studiare la biologia dello sviluppo degli embrioni di pollo.
Abstract
Come sistema modello classico di biologia embrionale, l’embrione di pollo è stato utilizzato per studiare lo sviluppo e la differenziazione embrionale. La consegna di materiali esogeni in embrioni di pollo ha un grande vantaggio per lo studio della funzione genica, dell’allevamento transgenico e della preparazione della chimera durante lo sviluppo embrionale. Qui mostriamo il metodo di iniezione intravascolare in ovo in cui materiali esogeni come vettori plasmidici o cellule germinali primordiali modificate (PGC) possono essere trasferiti in embrioni di pollo donatori nelle prime fasi dello sviluppo. I risultati mostrano che l’iniezione intravascolare attraverso l’aorta dorsale e la testa consente ai materiali iniettati di diffondersi nell’intero embrione attraverso il sistema circolatorio del sangue. Nel protocollo presentato, l’efficacia dell’introduzione di plasmidi esogeni e vettori lentivirali e la colonizzazione di PGC esogeni iniettati nella gonade ricevente sono state determinate osservando la fluorescenza negli embrioni. Questo articolo descrive le procedure dettagliate di questo metodo, fornendo così un approccio eccellente allo studio della funzione genica, della biologia dell’embrione e dello sviluppo e della produzione di pollo gonad-chimeric. In conclusione, questo articolo consentirà ai ricercatori di eseguire in ovo iniezione intravascolare di materiali esogeni in embrioni di pollo con grande successo e riproducibilità.
Introduction
Gli embrioni di pollo sono stati ampiamente utilizzati per secoli in applicazioni di sviluppo, immunologiche, patologiche e altre applicazioni biologiche 1,2,3. Hanno molti vantaggi intrinseci rispetto ad altri modelli animali nello studio della tossicologia e della biologia cellulare4. Gli embrioni di pollo sono facilmente accessibili e possono essere manipolati in vitro e osservati direttamente in qualsiasi fase dello sviluppo, il che fornisce un pratico sistema di modelli di ricerca sugli embrioni.
In generale, gli attuali metodi di consegna dell’embrione di pollo come l’elettrotrasfezione e l’iniezione subgerminale-cavità hanno limitazioni come la necessità di attrezzature specialistiche e un programma progettato e l’inefficienza dovuta alla presenza di tuorlo e albume 5,6,7. Qui mostriamo un metodo di manipolazione semplice ed efficiente per la consegna di materiali esogeni in embrioni di pollo. Questo può essere un potente strumento utilizzato nello studio della biologia dello sviluppo. I materiali iniettati si diffondono all’intero embrione attraverso la circolazione sanguigna. Durante lo sviluppo precoce degli embrioni di pollo, i PGC potrebbero migrare attraverso il sangue, colonizzare la cresta genitale e quindi svilupparsi in gameti, che forniscono un prezioso percorso possibile per fornire materiali esogeni8. Ora, questo metodo è stato ampiamente utilizzato nello studio della funzione genica, della biologia dell’embrione e dello sviluppo e della produzione chimerica e transgenica di pollo 9,10,11.
Nell’iniezione intravascolare di ovo negli embrioni di pollo è un metodo ben consolidato e comunemente usato 12,13,14. In questo documento, mostriamo una descrizione completa di questo protocollo, inclusi materiali di iniezione, siti, dosaggio e risultati rappresentativi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo di iniezione intravascolare in ovo di embrioni di pollo è ottimizzato per il trasferimento di materiali esogeni (vettori, virali o PGC) nell’embrione. Sulla base di questo metodo, abbiamo costruito modelli di embrioni di pollo con sovraespressione o interferenza genica stabile (SpinZ, JUN, UBE2I, ecc.) 17,18,19. Questi modelli consolidati dimostrano la fattibilità di questo approccio. Inoltre, non solo abbi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (31972547). Apprezziamo il copyediting di Jing Wang e la voce fuori campo di Malik Donlic alla Washington State University, USA.
Materials
| Fluorescence macro-microscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Glass Capillaries | Narishige | G1 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 12566014 | liposome |
| pEGFP-N1 vector | Clontech | #6085-1 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit | Sigma | PKH26GL | |
| pLVX-EGFP lentivirus vector | Addgene | 128652 | |
| Pneumatic Microinjector | Narishige | IM-11-2 | |
| Puller | Narishige | PC-100 | |
| Trypan Blue Stain | Gibco | 15250061 |
Riferimenti
- Bednarczyk, M., Dunislawska, A., Stadnicka, K., Grochowska, E. Chicken embryo as a model in epigenetic research. Poultry Science. 100 (7), 101164 (2021).
- Darnell, D. K., Schoenwolf, G. C. The chick embryo as a model system for analyzing mechanisms of development. Developmental Biology Protocols. , 25-29 (2000).
- Fauzia, E., et al. Chick embryo: a preclinical model for understanding ischemia-reperfusion mechanism. Frontiers in Pharmacology. 9, 1034 (2018).
- Fonseca, B. B., da Silva, M. V., de Morais Ribeiro, L. N. The chicken embryo as an in vivo experimental model for drug testing: Advantages and limitations. Lab Animal. 50 (6), 138-139 (2021).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In ovo electroporations of HH stage 10 chicken embryos. Journal of Visualized Experiments. (9), e408 (2007).
- Islam, M. M., Doh, S. T., Cai, L. In ovo electroporation in embryonic chick retina. Journal of Visualized Experiments. (60), e3792 (2012).
- Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. In ovo electroporation in the chicken auditory brainstem. Journal of Visualized Experiments. (124), e55628 (2017).
- van de Lavoir, M. -. C., et al. Germline transmission of genetically modified primordial germ cells. Nature. 441 (7094), 766-769 (2006).
- Ballantyne, M., et al. Avian primordial germ cells are bipotent for male or female gametogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 726827 (2021).
- Park, T. S., Han, J. Y. piggyBac transposition into primordial germ cells is an efficient tool for transgenesis in chickens. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (24), 9337-9341 (2012).
- Lee, H. J., et al. Targeted gene insertion into Z chromosome of chicken primordial germ cells for avian sexing model development. The FASEB Journal. 33 (7), 8519-8529 (2019).
- Han, J. Y., Lee, B. R. Isolation and characterization of chicken primordial germ cells and their application in transgenesis. Avian and Reptilian Developmental Biology: Methods and Protocols. , 229-242 (2017).
- Naito, M., Harumi, T., Kuwana, T. Long-term culture of chicken primordial germ cells isolated from embryonic blood and production of germline chimaeric chickens. Animal Reproduction Science. 153, 50-61 (2015).
- Yu, F., et al. Isolation, characterization and germline chimera preparation of primordial germ cells from the Chinese Meiling chicken. Poultry Science. 98 (2), 566-572 (2019).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Zhang, Z., et al. Crucial genes and pathways in chicken germ stem cell differentiation. The Journal of Biological Chemistry. 290 (21), 13605-13621 (2015).
- Jin, K., et al. UBE2I stimulates female gonadal differentiation in chicken (Gallus gallus) embryos. Journal of Integrative Agriculture. 20 (11), 2986-2994 (2021).
- Shi, X., et al. HMGCS1 promotes male differentiation of chicken embryos by regulating the generate of cholesterol. All Life. 14 (1), 577-587 (2021).
- Jiang, J., et al. Spin1z induces the male pathway in the chicken by down-regulating Tcf4. Gene. 780, 145521 (2021).
- Zhao, R., et al. Production of viable chicken by allogeneic transplantation of primordial germ cells induced from somatic cells. Nature Communications. 12 (1), 2989 (2021).
