I Ovo Intravaskulær injektion i kyllingembryoner

Summary

Det overordnede mål med dette papir er at beskrive, hvordan man udfører intracellulær injektion af eksogene materialer i kyllingembryoner. Denne tilgang er meget nyttig til at studere kyllingembryoners udviklingsbiologi.

Abstract

Som et klassisk modelsystem for embryobiologi er kyllingembryoet blevet brugt til at undersøge embryonal udvikling og differentiering. Levering af eksogene materialer til kyllingembryoner har en stor fordel for at studere genfunktion, transgen avl og kimærpræparation under embryonal udvikling. Her viser vi metoden til in ovo intravaskulær injektion, hvorved eksogene materialer såsom plasmidvektorer eller modificerede urkimceller (PGC’er) kan overføres til donorkyllingembryoner på tidlige udviklingsstadier. Resultaterne viser, at den intravaskulære injektion gennem dorsal aorta og hoved tillader injicerede materialer at diffundere ind i hele embryoet gennem blodcirkulationssystemet. I den præsenterede protokol blev effekten af eksogen plasmid og lentiviral vektorintroduktion og koloniseringen af injicerede eksogene PGC’er i modtagerens gonad bestemt ved at observere fluorescens i embryonerne. Denne artikel beskriver detaljerede procedurer for denne metode og giver derved en fremragende tilgang til at studere genfunktion, embryo- og udviklingsbiologi og gonad-kimær kyllingeproduktion. Afslutningsvis vil denne artikel gøre det muligt for forskere at udføre i ovo intravaskulær injektion af eksogene materialer i kyllingembryoner med stor succes og reproducerbarhed.

Introduction

Kyllingembryoner har været meget udbredt i århundreder i udviklingsmæssige, immunologiske, patologiske og andre biologiske anvendelser ^1,2,3. De har mange iboende fordele i forhold til andre dyremodeller i studiet af toksikologi og cellebiologi⁴. Kyllingeembryoner er let tilgængelige og kan manipuleres in vitro og observeres direkte på ethvert udviklingsstadium, hvilket giver et praktisk embryoforskningsmodelsystem.

Generelt har de nuværende kyllingembryoleveringsmetoder såsom elektrotransfektion og subgerminalhulrumsinjektion begrænsninger såsom kravet om specialudstyr og et designet program og ineffektivitet på grund af tilstedeværelsen af æggeblomme og albumen ^5,6,7. Her viser vi en enkel og effektiv håndteringsmetode til levering af eksogene materialer til kyllingembryoner. Dette kan være et kraftfuldt værktøj, der anvendes til studiet af udviklingsbiologi. De injicerede materialer spredes til hele embryoet via blodcirkulationen. Under den tidlige udvikling af kyllingeembryoner kunne PGC’erne migrere gennem blod, kolonisere kønsryggen og derefter udvikle sig til kønsceller, som giver en værdifuld mulig vej til at levere eksogene materialer⁸. Nu er denne metode blevet anvendt i vid udstrækning i studiet af genfunktion, embryo- og udviklingsbiologi og kimær og transgen kyllingeproduktion ^9,10,11.

In ovo intravaskulær injektion i kyllingembryoner er en veletableret og almindeligt anvendt metode 12,13,14. I dette papir viser vi en omfattende beskrivelse af denne protokol, herunder injektionsmaterialer, steder, dosering og repræsentative resultater.

Protocol

Alle procedurer, der involverer pleje og brug af dyr, var i overensstemmelse med US National Institute of Health retningslinjer (NIH Pub. nr. 85-23, revideret 1996), og kyllingeembryoprotokollerne blev godkendt af Laboratory Animal Management and Experimental Animal Ethics Committee ved Yangzhou University, Kina (nr. 201803124). 1. Opsamling og tilberedning af befrugtede æg BEMÆRK: I modsætning til pattedyr har kyllingen millioner af follikler i en…

Representative Results

Vi viser her in ovo intravaskulær injektion af kyllingembryoner. En skematisk proces for den intravaskulære injektion er vist i figur 1; I vores undersøgelse brugte vi forskellige eksogene opløsninger til at teste og verificere injektion. For bedre at visualisere de injicerede materialer blev Trypan Blue (0,4%) injiceret som sporstof i embryoet. Sporstoffet (blåt) blev observeret at diffundere til hele embryoet via blodcirkulationen ved ente…

Discussion

Metoden til in ovo intravaskulær injektion af kyllingembryoner er optimeret til eksogene materialer (vektor, viral eller PGC’er), der skal overføres til embryoet. Baseret på denne metode konstruerede vi kyllingeembryomodeller med stabil genoverekspression eller interferens (SpinZ, JUN, UBE2I osv.) 17,18,19. Disse veletablerede modeller viser gennemførligheden af denne tilgang. Derudover overførte vi ikke kun isole…

Materials

Fluorescence macro-microscope	OLYMPUS	MVX10
Glass Capillaries	Narishige	G1
Lipofectamine 2000	Invitrogen	12566014	liposome
pEGFP-N1 vector	Clontech	#6085-1
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit	Sigma	PKH26GL
pLVX-EGFP lentivirus vector	Addgene	128652
Pneumatic Microinjector	Narishige	IM-11-2
Puller	Narishige	PC-100
Trypan Blue Stain	Gibco	15250061