I Ovo Intravaskulär injektion i kycklingembryon
Summary
Det övergripande målet med detta dokument är att beskriva hur man utför i ovo intracellulär injektion av exogena material i kycklingembryon. Detta tillvägagångssätt är mycket användbart för att studera utvecklingsbiologin hos kycklingembryon.
Abstract
Som ett klassiskt modellsystem för embryobiologi har kycklingembryot använts för att undersöka embryonal utveckling och differentiering. Att leverera exogena material till kycklingembryon har en stor fördel för att studera genfunktion, transgen avel och chimärberedning under embryonal utveckling. Här visar vi metoden för in ovo intravaskulär injektion varigenom exogena material såsom plasmidvektorer eller modifierade primordiala könsceller (PGC) kan överföras till donator kycklingembryon i tidiga utvecklingsstadier. Resultaten visar att den intravaskulära injektionen genom dorsal aorta och huvud gör att injicerade material kan diffundera in i hela embryot genom blodcirkulationssystemet. I det presenterade protokollet bestämdes effekten av exogen plasmid och lentiviral vektorintroduktion och koloniseringen av injicerade exogena PGC i mottagargenaden genom att observera fluorescens i embryonerna. Denna artikel beskriver detaljerade förfaranden för denna metod, vilket ger ett utmärkt sätt att studera genfunktion, embryo- och utvecklingsbiologi och gonad-chimär kycklingproduktion. Sammanfattningsvis kommer denna artikel att tillåta forskare att utföra i ovo intravaskulär injektion av exogena material i kycklingembryon med stor framgång och reproducerbarhet.
Introduction
Kycklingembryon har använts i stor utsträckning i århundraden i utvecklings-, immunologiska, patologiska och andra biologiska tillämpningar 1,2,3. De har många inneboende fördelar jämfört med andra djurmodeller i studiet av toxikologi och cellbiologi4. Kycklingembryon är lättillgängliga och kan manipuleras in vitro och observeras direkt i alla utvecklingsstadier, vilket ger ett praktiskt embryoforskningsmodellsystem.
I allmänhet har nuvarande leveransmetoder för kycklingembryo som elektrotransfektion och subgerminal kavitetsinjektion begränsningar såsom kravet på specialutrustning och ett utformat program och ineffektivitet på grund av närvaron av äggula och albumen 5,6,7. Här visar vi en enkel och effektiv hanteringsmetod för att leverera exogena material till kycklingembryon. Detta kan vara ett kraftfullt verktyg som används vid studier av utvecklingsbiologi. De injicerade materialen sprids till hela embryot via blodcirkulationen. Under den tidiga utvecklingen av kycklingembryon kunde PGC migrera genom blod, kolonisera könsryggen och sedan utvecklas till gameter, vilket ger en värdefull möjlig väg att leverera exogena material8. Nu har denna metod använts i stor utsträckning i studien av genfunktion, embryo och utvecklingsbiologi och chimär och transgen kycklingproduktion 9,10,11.
I ovo intravaskulär injektion i kycklingembryon är en väletablerad och vanligt använd metod 12,13,14. I detta dokument visar vi en omfattande beskrivning av detta protokoll inklusive injektionsmaterial, platser, dosering och representativa resultat.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoden för intravaskulär injektion av kycklingembryon i ovo är optimerad för exogena material (vektor, viral eller PGC) som ska överföras till embryot. Baserat på denna metod konstruerade vi kycklingembryomodeller med stabilt genuttryck eller interferens (SpinZ, JUN, UBE2I, etc.) 17,18,19. Dessa väletablerade modeller bevisar genomförbarheten av detta tillvägagångssätt. Dessutom överförde vi inte bara is…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (31972547). Vi uppskattar copyediting av Jing Wang och voiceover av Malik Donlic vid Washington State University, USA.
Materials
| Fluorescence macro-microscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Glass Capillaries | Narishige | G1 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 12566014 | liposome |
| pEGFP-N1 vector | Clontech | #6085-1 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit | Sigma | PKH26GL | |
| pLVX-EGFP lentivirus vector | Addgene | 128652 | |
| Pneumatic Microinjector | Narishige | IM-11-2 | |
| Puller | Narishige | PC-100 | |
| Trypan Blue Stain | Gibco | 15250061 |
Riferimenti
- Bednarczyk, M., Dunislawska, A., Stadnicka, K., Grochowska, E. Chicken embryo as a model in epigenetic research. Poultry Science. 100 (7), 101164 (2021).
- Darnell, D. K., Schoenwolf, G. C. The chick embryo as a model system for analyzing mechanisms of development. Developmental Biology Protocols. , 25-29 (2000).
- Fauzia, E., et al. Chick embryo: a preclinical model for understanding ischemia-reperfusion mechanism. Frontiers in Pharmacology. 9, 1034 (2018).
- Fonseca, B. B., da Silva, M. V., de Morais Ribeiro, L. N. The chicken embryo as an in vivo experimental model for drug testing: Advantages and limitations. Lab Animal. 50 (6), 138-139 (2021).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In ovo electroporations of HH stage 10 chicken embryos. Journal of Visualized Experiments. (9), e408 (2007).
- Islam, M. M., Doh, S. T., Cai, L. In ovo electroporation in embryonic chick retina. Journal of Visualized Experiments. (60), e3792 (2012).
- Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. In ovo electroporation in the chicken auditory brainstem. Journal of Visualized Experiments. (124), e55628 (2017).
- van de Lavoir, M. -. C., et al. Germline transmission of genetically modified primordial germ cells. Nature. 441 (7094), 766-769 (2006).
- Ballantyne, M., et al. Avian primordial germ cells are bipotent for male or female gametogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 726827 (2021).
- Park, T. S., Han, J. Y. piggyBac transposition into primordial germ cells is an efficient tool for transgenesis in chickens. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (24), 9337-9341 (2012).
- Lee, H. J., et al. Targeted gene insertion into Z chromosome of chicken primordial germ cells for avian sexing model development. The FASEB Journal. 33 (7), 8519-8529 (2019).
- Han, J. Y., Lee, B. R. Isolation and characterization of chicken primordial germ cells and their application in transgenesis. Avian and Reptilian Developmental Biology: Methods and Protocols. , 229-242 (2017).
- Naito, M., Harumi, T., Kuwana, T. Long-term culture of chicken primordial germ cells isolated from embryonic blood and production of germline chimaeric chickens. Animal Reproduction Science. 153, 50-61 (2015).
- Yu, F., et al. Isolation, characterization and germline chimera preparation of primordial germ cells from the Chinese Meiling chicken. Poultry Science. 98 (2), 566-572 (2019).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Zhang, Z., et al. Crucial genes and pathways in chicken germ stem cell differentiation. The Journal of Biological Chemistry. 290 (21), 13605-13621 (2015).
- Jin, K., et al. UBE2I stimulates female gonadal differentiation in chicken (Gallus gallus) embryos. Journal of Integrative Agriculture. 20 (11), 2986-2994 (2021).
- Shi, X., et al. HMGCS1 promotes male differentiation of chicken embryos by regulating the generate of cholesterol. All Life. 14 (1), 577-587 (2021).
- Jiang, J., et al. Spin1z induces the male pathway in the chicken by down-regulating Tcf4. Gene. 780, 145521 (2021).
- Zhao, R., et al. Production of viable chicken by allogeneic transplantation of primordial germ cells induced from somatic cells. Nature Communications. 12 (1), 2989 (2021).
