Summary
거대분자의 고분해능 cryo-EM 맵은 또한 200kV TEM 현미경을 사용하여 달성할 수 있다. 이 프로토콜은 200kV TEM을 사용하여 고해상도 데이터 세트를 성공적으로 수집하는 데 필수적인 정확한 광학 정렬, 데이터 수집 체계 및 이미징 영역 선택을 설정하는 모범 사례를 보여줍니다.
Abstract
Cryo-electron microscopy (cryo-EM)는 지난 십 년 동안 단백질 구조 결정을위한 일상적인 방법으로 확립되어 출판 된 구조 데이터의 점유율이 계속 증가하고 있습니다. TEM 기술 및 자동화의 최근 발전으로 데이터 수집 속도와 획득 이미지의 품질이 향상되는 동시에 하위 3 Å 해상도에서 cryo-EM 맵을 얻는 데 필요한 전문 지식 수준이 감소했습니다. 이러한 고해상도 구조의 대부분은 최첨단 300kV cryo-TEM 시스템을 사용하여 얻어졌지만 특히 에너지 필터가 장착 된 경우 200kV cryo-TEM 시스템으로 고해상도 구조를 얻을 수 있습니다. 또한 실시간 이미지 품질 평가를 통해 현미경 정렬 및 데이터 수집을 자동화하면 시스템의 복잡성이 줄어들고 최적의 현미경 설정이 보장되므로 고품질 이미지의 수율과 데이터 수집의 전반적인 처리량이 증가합니다. 이 프로토콜은 200kV 냉동 투과 전자 현미경에서 최근의 기술 진보 및 자동화 기능의 구현을 시연하고 de novo 원자 모델 구축에 충분한 3D 맵의 재구성을 위한 데이터를 수집하는 방법을 보여줍니다. 우리는 모범 사례, 중요한 변수 및 이러한 고해상도 cryo-EM 데이터 세트의 일상적인 수집을 가능하게하기 위해 고려해야 할 일반적인 문제에 중점을 둡니다. 특히 i) 현미경 정렬 자동화, ii) 데이터 수집에 적합한 영역 선택, iii) 고품질의 고처리량 데이터 수집을 위한 최적의 광학 파라미터, iv) 제로 손실 이미징을 위한 에너지 필터 튜닝, v) 데이터 관리 및 품질 평가와 같은 필수 주제가 자세히 검토됩니다. 에너지 필터를 이용한 모범 사례의 적용 및 달성 가능한 분해능의 개선은 에너지 필터 및 직접 전자 검출기가 장착된 200kV TEM을 사용하여 2.1-Å 분해능으로 재구성된 1.6 Å 및 2.1-Å 분해능으로 재구성된 Thermoplasma acidophilum 20S 프로테아좀의 예에서 입증될 것이다.
Introduction
단백질 구조의 결정은 세포 대사, 신호 전달 또는 숙주-병원체 상호작용과 같은 주요 세포 과정에 관여하는 단백질 복합체의 분자 구조, 기능 및 조절을 이해하는 데 매우 중요하다. Cryo-electron microscopy (cryo-EM)는 X선 회절 및 NMR 분광법과 같은 전통적인 구조 기술에 비해 너무 어려웠던 많은 단백질과 그 복합체의 3D 구조를 해결할 수있는 강력한 기술로 부상했습니다. 특히, cryo-EM은 전통적인 구조 기술을 위해 충분한 양으로 쉽게 결정화되거나 제조 될 수없는 막 단백질의 선택 방법으로 입증되었으며 중요한 세포 수용체 및 이온 채널 1,2,3,4,5의 구조와 기능에 대한 새로운 통찰력을 제공했습니다. . 가장 최근에, cryo-EM은 분자 수준에서 SARS-CoV-2 감염의 메커니즘을 결정함으로써 Covid-19 전염병과 싸우는 데 중요한 역할을했으며, 이는 Covid-19 질병의 기원을 밝히고 효율적인 백신 및 치료제 6,7,8,9,10의 신속한 개발을위한 토대를 제공했습니다.
일반적으로 하이 엔드 300kV 투과 전자 현미경 (TEM)은 cryo-EM 단일 입자 분석 (SPA)에 의한 생체 분자의 고분해능 구조 결정에 사용되어 형태와 상호 작용을 나타냅니다. 최근에, SPA 기술은 공통 벤치마크 cryo-EM 샘플 아포페리틴이 냉장 방출 건(E-CFEG), 직접 전자 검출기 및 에너지 필터가 장착된 300-kV TEM을 사용하여 원자 분해능(1.2 Å)11,12로 재구성되었을 때 새로운 개척지에 도달했습니다. 이 결의안에서, 구조에서 개별 원자의 위치, 개별 아미노산 측쇄의 형태, 수소 결합 및 기타 상호 작용을 명확하게 해결할 수 있었으며, 이는 새로운 표적의 구조 기반 약물 발견 및 기존 약물 후보의 최적화에 대한 새로운 가능성을 열어줍니다.
중급 200kV TEM 현미경은 특히 대형 cryo-EM 시설에서 하이엔드 TEM 현미경을 사용하여 최종 고해상도 데이터를 수집하기 전에 샘플 스크리닝 및 샘플 최적화에 자주 사용됩니다. 일반적으로 이미지화된 샘플은 최종 데이터 수집을 위해 하이엔드 300kV TEM으로 이동하기에 충분한 3-4Å 분해능 범위에서 분해될 수 있습니다. 결과적으로, 200kV TEM을 사용한 데이터 수집은 가능한 가장 높은 분해능 결과를 위해 더 이상 최적화되지 않는 경우가 많습니다. 더욱이, 모든 아미노산 측쇄가 이미 해결됨에 따라 많은 흥미로운 생물학적 질문들이 이미 이러한 해상도에서 대답되고 발표될 수 있고, 리간드 결합 부위의 점유도 또한 신뢰성 있게 결정될 수 있다13. 200kV TEM은 수많은 샘플 14,15,16,17,18에 대해 3Å 이상의 분해능에 도달할 수 있음이 이미 입증되었습니다. 200kV에서 촬영된 이미지는 본질적으로 더 높은 이미지 입자의 콘트라스트를 나타내므로, 300kV TEM 이미지와 비교하여 고해상도에서 더 감쇠된 신호에도 불구하고 입자의 초기 정렬을 더욱 정확하게 할 수 있습니다. 재구성된 cryo-EM 맵의 달성된 해상도는 또한 200kV 및 300kV 재구성 모두에 영향을 미치는 이미지화된 샘플의 구조적 유연성과 형태적 이질성에 의해 제한된다는 점에 유의해야 합니다. 사실, 300kV 시스템을 사용하여 얻은 훨씬 더 많은 cryo-EM 재구성이 더 높은 해상도19에서보다 3-4 Å 분해능 범위에서 해결되었습니다. 200kV TEM 현미경은 덜 복잡하고 작은 방에 적합하기 때문에 이 현미경은 cryo-EM에 의한 생물학적 거대분자의 구조 결정을 위한 우수하고 저렴한 옵션을 제공하면서 현미경 오토로더 시스템에 저장된 여러 샘플에서 긴 데이터 수집을 자동화할 수 있습니다.
고분해능 구조 결정을 위한 cryo-EM 데이터 세트를 수집하려면 현미경 광학의 정확한 정렬이 필요합니다. 컬럼 정렬은 전자원에서 응축기 렌즈 시스템, 대물 렌즈 및 전자 검출기를 사용하는 에너지 필터까지 체계적으로 진행됩니다. 정렬의 전체 시퀀스는 일반적으로 필요하지 않습니다. 필요한 경우, 사용자는 현미경 사용자 인터페이스(Direct Alignments 제어판)의 정렬 절차 전반에 걸쳐 컨텍스트 인식 도움말 창에서 각 단계에 대한 적절한 설명과 함께 반자동 절차를 통해 안내됩니다. 현미경이 완전히 정렬되면 전자 광학은 안정적으로 유지되며 적어도 몇 달 동안 정렬을 변경할 필요가 없습니다. 샘플 평면의 병렬 조명, 객관적인 난시 및 혼수 상태 없는 정렬과 같은 가장 민감한 정렬만 각 데이터 집합의 수집을 시작하기 직전에 개선해야 합니다. 수집된 데이터의 품질은 EPU 품질 모니터, cryoSPARC Live 20, Relion 21, Scipion22, WARP23 또는 Appion 24와 같은 다양한 소프트웨어 패키지를 사용하여 데이터 수집 중에 모니터링할 수 있습니다.
현미경의 정확한 정렬 외에도 최소한의 형태 및 구성 이질성을 가진 잘 정제 된 샘플의 높은 품질은 고해상도 데이터 세트를 수집하고 고해상도 구조를 해결하기위한 전제 조건이기도합니다. 일반적인 프로토콜, 빈번한 도전 및 가능한 치료법에 대한 자세한 내용은이 주제25,26,27에 전념하는 다른 리뷰에서 찾을 수 있습니다. 본질적으로, 고해상도 정보를 보존하기에 충분히 얇은 얼음을 가진 주어진 cryo-EM 그리드에서 영역을 찾는 것이 중요하며, 개별 입자는 겹치지 않고 임의의 방향으로 조밀하게 분포되어 있습니다. 그러나 일반적인 cryo-EM 그리드는 균일하지 않은 얼음 두께를 가지므로 이미징을위한 최적의 영역을 찾아 선택하는 것이 중요합니다. 그리드의 얼음 두께를 추정하기 위한 다양한 수단은 EPU 2, Leginon28 또는 SerialEM29와 같은 cryo-EM 데이터 세트의 자동 수집을 위한 소프트웨어 패키지에서 사용할 수 있습니다.
빠르고 민감한 직접 전자 검출기의 출현은 빔으로 인한 움직임의 보상을 가능하게 하는 영화로서 많은 분파에서 이미지의 수집을 가능하게 하였고, 이미지 처리 및 최종 3D 재구성(30)에 사용되는 데이터의 질과 양을 상당히 증가시켰다. 동시에 자동화 및 고처리량 데이터 수집은 데이터 저장 및 액세스에 대한 문제를 나타내는 수천 개의 이미지 / 영화가있는 거대한 데이터 세트를 제공합니다. 수십에서 수백 명의 사용자에게 서비스를 제공하는 대형 cryo-EM 시설을 갖춘 채택 된 모델은 특히 확립 된 cryo-EM 파이프 라인31,32에서 적절한 추적 및 데이터 공유를 통해 체계적인 데이터 관리를 요구합니다.
이 연구는 200kV Glacios TEM 현미경을 사용하여 고해상도 cryo-EM 데이터 세트의 일상적인 수집을위한 프로토콜을 설명합니다. 현미경 광학의 필요한 정렬은 cryo-EM 샘플의 평가 절차 및 고해상도 데이터 수집에 적합한 영역의 선택과 함께 설명됩니다. 샘플 정보를 사용하여 수집 된 데이터 및 관련 메타 데이터의 구성은 샘플 정보 및 수집 된 데이터의 검토를 용이하게하는 데이터 관리 플랫폼 인 Athena에서 시연됩니다. 마우스 아포페리틴 샘플을 사용하여, 1.6 Å 분해능 13에서3D 재구성을 달성할 수 있었다. 설명된 프로토콜을 사용하여, 우리는 또한 2.1 Å 해상도에서 Thermoplasma acidophilum으로부터 20S 프로테아좀의 3D 밀도 맵을 재구성하였다.
Protocol
프로토콜의 모든 단계는 Selectris-X 에너지 필터 (이하 에너지 필터라고 함) 및 Falcon 4 검출기 (이하 직접 전자 검출기라고 함)가 장착 된 200kV Glacios TEM 시스템 (이하 200kV TEM이라고 함)에 대해 설명됩니다. 프로토콜 단계는 각 Glacios 시스템에 사전 설치된 기본 SPA 데이터 수집 소프트웨어인 EPU 애플리케이션에 따라 다릅니다. 아래의 프로토콜 단계는 EPU 버전 2.14에 해당하며 다른 EPU 버전을 사용할 때 약간의 수정이 예상됩니다. 이 프로토콜의 전제 조건은 i) 건과 컬럼 정렬이 잘 정렬되어 있고, ii) EM 교정이 정확하며, iii) EPU 자동 기능이 올바르게 교정됩니다.
1. 현미경에 그리드 로딩
참고: 이 실험에 사용된 200kV TEM은 현미경의 오토로더 내부에 로드되고 샘플 파괴를 방지하기 위해 -170°C 이하의 온도에서 지속적으로 유지되는 카세트 내에 최대 12개의 오토그리드(즉, 특수 카트리지로 클리핑된 기존 TEM 그리드)를 보유할 수 있습니다.
- 액체 질소 조건에서 오토로더 카세트에 오토그리드를 삽입합니다.
- 자동 그리드가 있는 카세트를 액체 질소 냉각 이송 캡슐에 넣습니다.
- 캡슐을 현미경에 넣고 현미경 UI의 Dock 버튼을 클릭하여 캡슐의 카세트를 현미경의 자동 로더로로드에로드하십시오.
- 인벤토리 버튼을 클릭하여 로드된 카세트에 오토그리드가 있는지 확인합니다.
- 로드 및 언로드 버튼을 클릭하여 TEM 이미징을 위해 컬럼에 오토그리드를 삽입합니다.
2. 데이터 관리 플랫폼에서 프로젝트 설정 (선택 사항)
참고: 샘플 정보 및 수집된 데이터는 연결된 모든 계측기에 대해 구조화된 데이터를 저장할 수 있는 제공된 데이터 관리 플랫폼에서 구성할 수 있습니다. 검토 및 내보내기를 위해 체계적인 방식으로 이미지와 메타데이터를 캡처하기 위해 워크플로 단계를 정의할 수 있는 프로젝트를 만들 수 있습니다.
- 데이터 관리 포털 응용 프로그램을 시작하고 사용자 이름과 암호로 로그인합니다.
- 포털 UI의 왼쪽 패널에서 프로젝트 추가 단추를 클릭하여 새 프로젝트를 만들거나 아래 목록에서 기존 프로젝트의 단추를 클릭하여 프로젝트를 엽니다.
- 실험 추가 단추를 클릭하여 열린 프로젝트 내에서 새 실험을 만듭니다.
- 새 실험의 메타데이터 패널에서 설명을 채우고 워크플로 추가 단추를 클릭하여 실험 내에서 새 워크플로 (예: 단일 파티클 분석)를 만듭니다.
- 필요에 따라 중간 패널에서 단계 추가 단추를 클릭하여 사용자 지정 워크플로를 만들거나 미리 정의된 SPA 워크플로에 추가 단계를 추가합니다(그림 1 및 그림 2).
참고: 단계는 샘플 준비, 생화학 기술에 의한 샘플 특성화, 샘플 유리화, cryo-EM 그리드 스크리닝, 데이터 수집 세션 및 데이터 분석을 나타낼 수 있습니다. - 선택적으로 각 단계의 메모 에 이미지 및 사진을 포함할 수 있는 설명을 입력합니다.
- 워크플로에서 데이터 집합 단계를 만들고 데이터 집합 유형을 EPU로 선택합니다.
참고: 이렇게 하면 분석 소프트웨어가 데이터 수집 중에 모든 결과 데이터/메타데이터를 데이터 관리 포털의 올바른 위치에 자동으로 배치하고 모든 단계 및 데이터 전송에 대한 전체 기록을 유지하면서 데이터를 원하는 대상으로 자동으로 내보낼 수 있습니다. - 생화학 단계에서 샘플 및 EM 격자에 대한 템플릿을 채우고 각 그리드를 샘플과 연결합니다(하나의 샘플을 여러 격자와 연관시킬 수 있음).
- 샘플-그리드 조합을 데이터 집합 단계의 메타데이터 섹션에 연결합니다.
3. 분석 소프트웨어에서 이미징 사전 설정 및 이미지 시프트 보정 설정
- 표 1과 같이 개별 이미징 모드에 대한 이미징 파라미터를 설정합니다. 특정 설정 선택에 대한 고려 사항은 토론 섹션에 자세히 설명되어 있습니다.
- 분석 소프트웨어의 데이터 수집 사전 설정에서 선택한 배율에 대한 병렬 조명 설정
참고: 이 연구에 사용된 200kV TEM과 같은 2-콘덴서 TEM 시스템에서 주어진 SPOT 크기(즉, C1 렌즈의 사전 설정된 강도)에서 샘플의 병렬 조명을 위한 C2 렌즈의 설정은 하나만 있습니다. 따라서 단위 면적당 전자 선량율(e-/Å2/s)은 SPOT 크기 설정을 변경하고 아래 단계에 따라 C2 강도(빔 강도)를 재조정해야만 조정할 수 있습니다.- 탄소 호일을지지하고 얇거나 얼음이없는 지역으로 이동하십시오.
- TEM UI의 조리개 메뉴에서 100μm 또는 70μm 대물 조리개를 선택합니다.
- 제어판의 회 절 버튼을 눌러 회절 모드로 전환합니다.
- 형광 화면을 삽입하고 FluCam 모드를 고해상도로 변경하십시오.
- 중앙 회절 지점을 조리개 가장자리로 이동합니다. 조리개 가장자리가 보이지 않으면 확대 손잡이 사용으로 카메라 길이를 늘립니다.
- 컨트롤 패널의 초점 노브를 조심스럽게 돌려 후방 초점 평면에 초점을 맞춥니다. 후방 초점 평면은 조리개 가장자리가 눈에 띄게 선명할 때 초점을 맞춥니다.
- FluCam의 감도를 최저 수준으로 줄이고 중앙 회절 지점을 FluCam의 중심으로 이동하십시오.
- 컨트롤 패널의 강도 노브를 사용하여 중앙 지점의 크기를 최소화합니다.
- TEM UI에서 대물 조리개를 리트랙트하고 이미징 모드로 다시 전환합니다.
- 분석 소프트웨어에서 Get 버튼을 클릭하여 데이터 수집 사전 설정에 설정을 저장합니다.
- 데이터 수집 사전 설정에서 사용되는 검출기에 최적인 전자 선량률을 조정합니다.
- 그리드의 빈 영역으로 이동(예: 탄소 호일이 부러진 그리드 사각형)
- 분석 소프트웨어에서 선량 측정 버튼을 클릭하여 전자 선량 비율을 측정 하십시오.
- 최적의 용량 비율을 달성하기 위해 SPOT 크기를 변경하십시오. 이 프로토콜에 사용되는 직접 전자 검출기의 경우, 일반적으로 고해상도 데이터 수집에 4-5 e-/pixel/s의 선량 속도가 사용됩니다. 이는 일반적으로 SPOT 크기 4-6에 해당합니다.
- 위에서 설명한 대로 새로운 SPOT 크기 설정에서 병렬 조명을 확인하고 조정합니다.
- 분수 아래의 EER 옵션을 선택하여 직접 전자 검출기(33) 상에서 EER 모드를 사용한다.
- 분석 소프트웨어에서 Get 버튼을 클릭하여 데이터 수집 사전 설정에 설정을 저장합니다.
- 자동 초점 사전 설정으로 전환하고 가져오기 버튼을 눌러 초점을 맞추기 위한 조명 설정을 저장합니다. 노출 시간을 1초로 수동으로 변경하고 비닝 모드 2로 변경합니다.
- Thon Rings 사전 설정으로 전환하고 가져오기 버튼을 눌러 이 사전 설정에 대한 조명 설정을 저장합니다. 노출 시간을 1-2초로 수동으로 변경하고 비닝 모드 2로 변경합니다.
- 제로 손실 사전 설정으로 전환하고 가져오기 버튼을 눌러 이 사전 설정에 대한 조명 설정을 저장합니다. 노출 시간을 0.5초로 수동으로 변경하고 비닝 모드 4로 변경합니다.
- 준비 탭의 이미지 시프트 보정 작업을 사용하여 분석 소프트웨어 설명서에 설명된 대로 설정된 광학 설정 간에 이미지 이동을 보정합니다(보충 그림 1).
표 1: 에너지 필터 및 직접 전자 검출기가 장착된 200kV cryo-TEM을 사용한 고해상도 데이터 수집을 위한 일반적인 이미징 설정. 자동 데이터 수집을 설정하는 데 사용되는 각 광학 사전 설정에 대한 설정이 표시됩니다(프로토콜 섹션 3). 이러한 설정은 본 연구에 사용된 200kV TEM 현미경 및 직접 전자 검출기에 따라 다릅니다. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
4. 그리드 매핑 및 데이터 수집을위한 최고의 cryo-EM 그리드 선택
- Atlas 탭을 선택하고 새 세션 버튼을 클릭하여 새 세션을 엽니다.
- 세션 이름 및 데이터 저장 위치와 같은 세부 정보를 입력하고 적용 단추를 클릭하여 Autoloader 인벤토리의 모든 그리드 목록을 표시하는 새 스크리닝 작업 창을 엽니다. 필요에 따라 격자의 이름을 편집합니다.
- 해당 격자선 번호 옆에 있는 확인란을 선택하여 관심 격자를 선택합니다.
- 시작 단추를 클릭하여 선택한 모든 격자의 완전히 자동화된 아틀라스 컬렉션을 시작합니다.
- 컬렉션이 완료되면 그리드 레이블을 클릭하여 획득한 아틀라스를 검토합니다.
참고: 개별 격자 사각형은 각 아틀라스의 상대적 그레이스케일 값 평가를 기반으로 하는 상대적인 얼음 두께에 따라 분류됩니다. 분류된 격자 사각형은 데이터 수집 영역의 선택을 안내하는 데 사용할 수 있는 다양한 색 구성표로 표시됩니다. Vitrobot Mk IV로 생성된 그리드는 일반적으로 전체 그리드에 얼음 두께 기울기를 표시하므로 데이터 수집에 이상적인 얼음 두께를 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 최적의 그리드는 가능한 한 적은 이송 얼음 오염을 포함해야 하며 파손되지 않고 균열이 없는 그리드 사각형을 충분히 나타내야 합니다(그림 3). 적합한 얼음 분포를 갖는 격자는 높은 배율(즉, 개별 입자의 밀도 및 배향)에서 얼음 중의 입자의 분포를 평가하기 위해 추가로 조사될 수 있다. - 상단 메뉴에서 샘플 로드 버튼을 클릭하여 적절한 얼음 분포를 가진 선택된 격자를 현미경 컬럼에 삽입합니다.
- Atlas 탭을 선택하고 아틀 라스 이미지에서 적합한 격자 사각형을 마우스 오른쪽 단추로 클릭한 다음 드롭다운 메뉴에서 스테이지를 여기로 이동 옵션을 선택하여 스테이지를 격자 사각형으로 이동합니다.
- 자동 기능 탭을 선택하여 격자선 사각형을 유센트릭 높이로 설정합니다. Eucentric 높이 사전 설정으로 전환하고 선택한 격자 사각형의 중간에있는 빔 틸트 자동 기능에 의한 자동 유센트릭 (Auto-Eucentric)을 클릭하고 시작 버튼을 클릭하십시오.
- 그리드 사각형 사전 설정으로 전환하고 이미지를 획득합니다. 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 스테이지를 여기로 이동 옵션을 사용하여 오염이 없거나 최소화된 얼음이 있는 구멍으로 스테이지를 이동합니다.
- 구멍/유중심 높이 사전 설정으로 전환하고 이미지를 획득합니다. 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 스테이지를 여기로 이동 옵션을 사용하여 스테이지를 관심 구멍 옆의 탄소 영역으로 이동합니다.
- 자동 초점 자동 기능을 클릭하고 원하는 디포커스 값을 0μm로 설정하고 반복을 -2μm로 설정합니다. 자동 초점 사전 설정으로 전환하고 시작 버튼을 클릭하십시오.
- 준비 탭을 다시 선택하고 구멍/유중심 높이 사전 설정으로 전환합니다. 이전에 획득한 구멍 이미지에서 구멍 내에서 관심 영역을 선택하고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 스테이지를 여기로 이동 옵션을 선택하여 스테이지를 이 위치로 이동합니다.
- 데이터 수집 사전 설정으로 전환하고 빔 시프트 후 대기 시간을 0.5초로 설정하고 스테이지 이동 후 대기 시간을 20초로 설정합니다. -3μm와 -5μm 사이의 디포커스를 사용하여 이미지를 획득하여 저해상도 콘트라스트를 높여 개별 입자를 더 잘 시각화할 수 있습니다.
- 선택적으로 4.7-4.13단계를 반복하여 필요에 따라 서로 다른 구멍과 서로 다른 얼음 두께의 다른 격자 사각형에 있는 입자를 이미지화합니다.
- 고해상도 데이터 수집에 가장 적합한 그리드를 식별하고 선택했으면 상단 메뉴에서 샘플 로드 단추를 클릭하여 선택한 그리드를 TEM에 로드 합니다.
참고: 또는 더 많은 정보가 필요하거나 이 스크리닝 프로세스의 자동화가 필요한 경우 섹션 5를 수행하십시오.
5. 단일 입자 분석 소프트웨어에서 데이터 수집 세션 설정
참고: 금박 격자를 사용하는 경우, 객관적인 난시 및 혼수 상태 정렬(섹션 6)의 개선이 안정적으로 작동하지 않을 수 있습니다. 탄소 호일 그리드 또는 교차 격자 EM 그리드를로드하고 데이터 수집을 설정하기 전에 이러한 최종 정렬을 수행하는 것이 좋습니다.
- EPU 탭을 선택하고 세션 생성 버튼을 클릭하여 왼쪽 패널에 새 세션을 만듭니다. 새 세션 옵션을 선택하여 현재 광학 사전 설정을 사용하거나 [환경 설정에서 새로 만들기] 옵션을 선택하여 이전에 내보낸 세션 설정을 로드합니다.
- 세션 이름과 데이터 저장 위치를 입력합니다.
참고: 이 위치는 데이터 수집 세션의 통합 이미지 및 메타데이터를 세션 이름의 하위 폴더에 저장하는 데 사용됩니다. 이러한 데이터는 상당한 양의 저장 공간을 차지하지는 않지만 EER 카메라 프레임은 항상 세션 이름을 가진 디렉토리의 이 데이터 저장소의 루트 디렉토리에 저장되므로 DMP 서버의 Falcon 오프로드 데이터 저장소에 이러한 데이터를 저장하는 것이 좋습니다. - 세션의 수동 유형을 선택하여 프로토콜의 뒷부분에 있는 데이터 수집을 위해 선택된 격자 사각형의 개별 구멍 선택을 제어할 수 있습니다.
- 더 빠른 수집 모드를 선택하여 데이터 수집에 수차 없는 이미지 시프팅(AFIS)을 사용하여 개별 구멍 간의 스테이지 이동을 줄이고 전체 샘플 드리프트를 줄이며 이미지 품질 저하 없이 데이터 수집 처리량을 높입니다.
- 저장된 통합 이미지의 기본 mrc 형식을 선택합니다.
- 사용된 격자선과 그 유형을 지정합니다. 이 프로토콜은 아포페리틴에는 R-1.2/1.3 UltraAufoil을, 20S 프로테아좀에는 R-2/1 Quantifoil 그리드를 사용했습니다. 시편 캐리어 아래에서 Quantifoil을 선택하고 Quantifoil 유형에서 R1.2/1.3 또는 2/1을 선택합니다.
- 선택 사항: EPU 품질 모니터(EQM)를 활용하려면 오른쪽 하단에 있는 Athena 로그인 버튼을 클릭합니다.
- 브라우저 팝업 창에 로그인 세부 정보를 입력하여 세션 설정 개요의 설정 섹션을 활성화합니다.
- 설정 섹션에서 선택 단추를 클릭하고 이전에 만든 데이터 세트(프로토콜 섹션 2)를 찾아 현재 데이터 컬렉션과 연결합니다. 품질 모니터 사용 확인란을 켭니다.
- 적용 버튼을 클릭하여 새 세션을 만듭니다.
참고: 이 작업은 왼쪽 열 메뉴에서 새 작업을 엽니다. 세션 중 언제든지 일부 세부 정보가 올바르지 않으면 세션 설정 작업으로 돌아가서 세부 정보를 변경 / 업데이트 한 다음 적용 을 다시 클릭하여 세션을 업데이트 할 수 있습니다. - 왼쪽 패널에서 사각형 선택 작업을 선택하여 격자의 수집된 아틀라스를 표시합니다.
- 선택적으로 아틀라스의 타일을 두 번 클릭하면 그리드 사각형의 얼음 품질을 더 잘 판단 할 수있는 더 높은 품질의 이미지를보십시오. 이미지를 다시 두 번 클릭하여 그리드 아틀라스로 돌아갑니다.
- 다음과 같은 특성을 가진 그리드 사각형을 식별합니다(그림 4): (i) 그리드 사각형의 지지 호일이 손상 없이 손상되지 않은 상태, (ii) 호일 구멍의 유리질 얇은 얼음(구멍이 지지 탄소 호일보다 밝게 나타남), (iii) 그리드 사각형에 가능한 한 결정질 얼음 오염(검은 얼룩)이 거의 없음, (iv) 그리드 사각형과 개별 호일 구멍 내에서 최소 밝기 구배.
참고 : 사전 설정을 선택하고 좋은 그리드로이 연구에 사용 된 200kV cryo TEM은 ~ 200-300 영화 / h의 속도로 이미지 할 수 있습니다. 이를 염두에두고 필요한만큼 사각형을 선택하거나 나중에 현미경 사용 가능한 시간에 따라 사각형 선택 작업으로 돌아가 더 추가하십시오. 참고로, 아포페리틴의 1.6 Å 해상도를 달성하기 위해 3000편의 영화가 수집되었다. - 전체 아틀라스 또는 고품질 타일 이미지에서 데이터 수집을 위한 격자 사각형 선택
- 관심 있는 격자 사각형을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 상황에 맞는 메뉴에서 선택 옵션을 선택합니다 .
- 또는 키보드의 Ctrl 키를 누른 상태에서 원하는 격자 사각형을 마우스 왼쪽 단추로 클릭하십시오.
- 반대로, 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 Shift 키를 누른 상태에서 선택을 취소하거나 마우스 왼쪽 버튼을 클릭하여 사각형을 제거합니다.
- 왼쪽 패널에서 구멍 선택 작업을 선택하여 선택한 격자선 사각형의 구멍을 선택합니다.
- Auto-Eucentric 버튼을 클릭하여 자동으로 첫 번째로 선택한 격자 사각형으로 이동하고, Eucentric 높이를 조정하고, 호일 구멍을 찾기 위한 격자 사각형 이미지를 획득합니다.
- 구멍 찾기 버튼을 클릭하여 이미지에서 호일 구멍을 찾으십시오.
참고: 구멍 찾기가 제대로 작동하지 않는 경우(예: 건너뛴 구멍이나 이미지에 구멍 크기가 잘못된 구멍이 있는 경우) 세션 설정 태스크의 Quantifoil 유형 항목에 올바른 값이 입력되었는지 확인하고 구멍을 다시 찾으십시오. 구멍이 여전히 올바르게 발견되지 않으면 구멍 크기 측정 버튼을 클릭하여 구멍 지름과 거리를 수동으로 설정하고 구멍을 다시 찾으십시오. - 격자 막대 단추에 있는 구멍 제거 단추를 클릭하여 격자 막대 근처의 구멍을 선택 취소합니다.
- 그림 4와 같이 Ice 필터의 밝기 히스토그램(소프트웨어 창의 오른쪽 하단)에서 한계를 조정하여 얼음이 너무 두꺼운 모든 구멍(왼쪽 한계선 사용)과 모든 빈 구멍(오른쪽 한계선 사용)을 제거합니다.
참고: 구체화를 위해 특정 강도 값을 적용 단추 옆의 해당 텍스트 상자에도 입력할 수 있습니다. - 선택적으로 선택 브러시를 사용하여 수동으로 구멍 선택을 구체화합니다. 마우스 왼쪽 버튼을 클릭하고 브러시를 드래그하여 원하지 않는 구멍의 선택을 취소합니다. Ctrl 키를 누른 채 마우스 왼쪽 버튼을 클릭하면 호일 구멍을 다시 선택할 수 있습니다. Shift 키를 누른 채 마우스 휠로 스크롤하여 브러시 크기를 조정합니다.
- 데이터 수집 전체에서 반복적으로 사용될 데이터 수집 템플릿을 설정하고 테스트할 구멍 선택: 격자 사각형 이미지의 구멍을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 스테이지를 위치로 이동 옵션을 선택합니다.
- 왼쪽 패널에서 템플릿 정의 작업을 선택합니다.
- 구멍/유센트릭 사전 설정을 선택하고 획득 버튼을 클릭하여 이미지를 획득합니다.
- 구멍 찾기 및 중앙(Center Hole) 단추를 클릭하여 이미지의 구멍 중앙에 배치합니다.
- 이미지 시프트 후 지연 값을 0.5초(기본값)로 설정하고 스테이지 시프트 후 지연 값을 20초로 설정합니다.
참고: 병렬 빔 직경은 본 연구에 사용된 200kV cryo-TEM 시스템에 고정되어 있고 일반적으로 50μm 조리개가 있는 1.6-1.7μm에 해당하므로 R-2/1.3 그리드를 사용하여 구멍당 1개의 이미지만 획득할 수 있으며 R-2/1 또는 R-2/2 그리드를 사용하여 구멍당 2개의 이미지(반대쪽 가장자리 근처)만 얻을 수 있습니다. 화면에 설정된 획득 영역의 크기는 실제 빔 직경과 일치하지 않습니다. 이미지 스케일 바는 적절한 배치 거리를 추정하는데 이용될 수 있다. - 획득 영역 추가 버튼을 선택하고 이미지를 클릭하여 고배율 이미지 획득을 가져올 중앙 구멍의 위치를 선택합니다.
- 자동 초점 영역 추가 단추를 선택하고 이미지를 클릭하여 이미지 자동 초점이 수행될 중앙 구멍 옆의 지지 호일의 위치를 선택합니다.
참고: 초점을 맞추기 위한 빔 크기는 1.6-1.7 μm이며 탄소의 인접 구멍과 동등하게 배치해야 합니다. - 녹색 획득 영역을 클릭하여 소프트웨어 창의 위쪽 섹션에 있는 디포커스 목록에서 디포커스 값의 시퀀스를 설정합니다. 다음 템플릿 실행 작업의 테스트 실행에서 파티클의 시각화를 향상시키기 위해 가장 높은 디포커 스를 먼저 입력합니다.
- 파란색 자동 초점 영역을 클릭하여 동일한 영역에서 자동 초점 관련 설정을 지정합니다.
- After Centering 옵션을 선택하여 각 AFIS 클러스터의 시작 부분에 자동 초점을 맞춥니다.
- 더 빠른 자동 초점 조정과 스테이지 드리프트 감소를 위한 대물 렌즈 옵션을 선택하십시오.
- 템플릿 실행 작업을 선택하고 실행 단추를 클릭합니다.
- 데이터 수집 절차의 개별 단계(구멍 중앙, 선택한 영역의 자동 초점 및 설정된 영역의 이미지 획득)를 관찰하고 최종 고배율 이미지에서 이미지화된 입자의 품질을 확인합니다.
- 고배율 이미지 창의 오른쪽 하단에 있는 FFT 버튼을 클릭하여 FFT 이미지를 확인하고 Thon 링이 여러 진동을 표시하고 FFT 이미지에서 고해상도로 확장되는지 시각적으로 평가합니다.
- 템플릿 실행이 성공적으로 완료되면 구멍 선택 임무에서 모든 사각형 준비 단추를 클릭하여 이 첫 번째 격자선 사각형에서 사용된 설정에 따라 선택한 다른 모든 격자 사각형에서 데이터 수집이 자동으로 설정되도록 합니다.
6. 데이터 수집을 시작하기 전에 최종 현미경 정렬
참고: 최상의 고해상도 결과를 얻으려면 가장 민감한 정렬은 데이터 수집 소프트웨어의 데이터 수집 모드와 동일한 설정에서 실제 데이터 수집을 시작하기 직전에 정확하게 수행해야 합니다. 이러한 정렬은 그리드의 얇은 지지 탄소가있는 위치에서 수행되어야하며, 그리드 막대에서 충분히 멀리 떨어져 있어야하며 Eucentric 높이에서 정렬되어야합니다.
- 템플릿 실행 작업을 선택하고 새 이미지를 획득한 다음 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 스테이지와 함께 탄소 호일의 깨끗한 영역으로 이동한 다음 메뉴 옵션을 선택합니다.
- 자동 기능 탭을 선택하고 원하는 디포커스를 0μm로 설정하고 반복을 -2μm로 설정합니다. 자동 초점 사전 설정으로 전환하고 시작 버튼을 클릭하여 자동 초점 기능을 실행합니다.
- 형광 화면을 아래로 놓고 TEM UI에서 직접 정렬 메뉴를 엽니다.
- 최상의 결과를 위해 숙련된 사용자는 피벗 포인트 정렬을 확인할 수 있습니다: 직접 정렬 메뉴에서 nP 빔 틸트 pp X 작업을 선택하고 제어판의 다기능 노브를 사용하여 튀는 빔을 최대한 겹치십시오. np 빔 틸트 pp Y 작업에 대해 반복하십시오.
- 형광 스크린 카메라 메뉴에서 EF 버튼을 클릭하면 에너지 필터 입구 조리개를 나타내는 녹색 원이 표시되고 녹색 원 위에 빔이 가운데에 배치됩니다.
참고: 계속하기 전에 터보 펌프가 정지되었는지 확인하십시오. 그것으로부터의 진동은 눈에 보이는 톤 링의 수를 줄이고 종종 자동 기능을 실패하게 만듭니다. - 소프트웨어 창으로 돌아가서 메뉴 막대에서 자동 기능 탭을 선택하십시오.
- 자동 태그 지정 작업을 선택하고 Thon Ring 사전 설정으로 전환한 다음 시작 단추를 누릅니다. 이 과정을 관찰하여 (i) 촬영된 이미지가 탄소에 있고, (ii) 톤 링이 명확하게 보이고, (iii) 계산된 CTF 핏(점선)이 톤 링 미니마에 잘 배치되어 있는지 확인합니다(보충 그림 2).
- Autocoma 작업을 선택하고 시작 단추를 누릅니다. 이 과정을 관찰하여 촬영한 이미지가 탄소에 있고 톤 링이 명확하게 보이는지, 계산된 적합도(점선)가 톤 링 미니마에 잘 배치되어 있는지 확인합니다. 마우스 스크롤 휠을 사용하여 각 Thon-ring 이미지를 확대합니다(보충 그림 3).
참고: 현미경에 에너지 필터가 장착되어 있는 경우, 필터 슬릿을 제로 손실 피크에 중심을 맞추고 에너지 필터의 프리즘에서 왜곡을 수정하기 위해 정렬 시퀀스의 일부로 에너지 필터 튜닝을 수행해야 합니다(단계 6.9-6.14). 이러한 정렬은 깨진 격자 사각형 내부와 같이 격자의 빈 영역에서 수행되어야합니다. - Sherpa UI를 열고 에너지 필터 응용 프로그램을 선택합니다(보충 그림 4).
- 설정 창에서 카메라를 EF-Falcon, bin 4x, 노출 시간 0.2초로 설정합니다 .
- 제로 손실 옵션에서 가운데 버튼을 클릭하여 제로 손실 에너지 필터 슬릿을 중앙에 맞춥니다.
- 등색성 옵션에서 조정 단추를 클릭합니다(보충 그림 4).
- 기하학적 및 색채 왜곡 옵션에서 배율 조정 및 왜곡 조정을 클릭합니다(보충 그림 5, 보충 그림 6).
- 결과가 표시된 사양 내에 있지 않고 출력 보고서에 빨간색으로 표시되면 6.11단계의 정렬을 다시 반복합니다.
참고: 직접 전자 검출기 이득 기준은 수개월에 걸쳐 안정적일 수 있지만, 빈 영역의 이미지가 균일한 강도를 나타내지 않지만 줄무늬 또는 기타 뚜렷한 특징을 나타내는 경우 Falcon 4 참조 이미지 관리자를 사용하여 새로운 이득 참조를 수행해야 합니다. 또는 이러한 이미지의 FFT(고속 푸리에 변환)를 계산하고 선이 보이지 않는지 확인합니다. - 소프트웨어 창에서 준비 탭을 선택하고 데이터 수집 사전 설정으로 전환합니다.
- 복용량 설정을 40 e-/Å2 로 설정하고 복용량 비율 측정 버튼을 클릭하십시오.
- EPU 탭으로 이동하여 자동 수집 작업을 선택하고 선택적으로 자동 제로 손실 기능을 확인하십시오. 실행 시작 단추를 클릭하여 완전히 자동화된 데이터 수집을 시작합니다.
7. 데이터 수집 중 데이터 품질 모니터링 및 최적화
참고: 데이터 수집이 진행되는 동안 데이터 관리 포털을 통해 EQM을 사용하여 수집된 데이터를 모니터링할 수 있습니다. EQM은 즉석에서 동작 보정 및 CTF 결정을 수행하고 결과를 포털에 표시합니다. 그런 다음 사용자는 개별 획득의 품질을 판단하고, 다양한 품질 지표의 그래프를 보고, 원치 않는 수집을 필터링하고, 데이터를 즉석 또는 배치 작업으로 최종 스토리지로 내보낼 수 있습니다.
- 분석 소프트웨어가 웹 브라우저를 사용하여 데이터를 배치하는 데이터 세트로 이동합니다.
- 데이터 세트 개요에서 수집 카드는 동작 보정 및 CTF 결정에 대한 정보를 그래픽 형식으로 표시합니다. 개별 카드를 클릭하여 자세한 정보를 얻으십시오.
- DataViz 패널이 전체 데이터 세트에서 집계된 그래프를 표시하여 획득당 디포커스, 난시 및 CTF 신뢰 범위를 보여 줍니다(보충 그림 7).
- 패널 상단의 필터를 사용하여 요청된 디포커스 범위 내에 있는 데이터만 선택하고, 난시가 0에 가까우며, CTF를 지정된(대상) 해상도까지 결정할 수 있습니다. 필터가 설정되면 적용 단추를 눌러 데이터 세트 개요 창에 선택한 데이터만 표시합니다.
- 획득한 이미지의 대부분이 설정된 기준 내에 있는 경우 데이터 수집 세션이 계속 완료되도록 합니다. 획득한 이미지의 극히 일부만이 설정된 기준을 충족하는 경우 분석 소프트웨어 설정을 다시 구성하거나, 샘플의 다른 영역으로 이동하거나(분석 소프트웨어에서 다음 격자 사각형 단추 누르기) 데이터 수집을 중지합니다.
Representative Results
데이터 관리 포털은 단일 소프트웨어 플랫폼에서 여러 실험 워크플로에서 수집된 이미지, 데이터 및 메타데이터를 효율적이고 구조화된 스토리지로 제공합니다. 생성된 프로젝트에서 정의된 각 실험은 샘플 정보, 수집된 데이터 및 관련 메타데이터를 제약 조건 없이 캡처하여 가능한 모든 실험 및 모든 사용 사례에 대해 최대한의 유연성과 유용성을 제공하는 고객 정의 단계가 있는 워크플로로 구성됩니다(그림 1, 그림 2). 또한 데이터 관리 포털에는 중간 결과를 사용한 이미지 처리를 포함한 워크플로 단계를 설명하는 랩 노트 기능이 있으며, 이 기능은 모두 프로젝트와 함께 연결될 수 있으며 보고서 및 간행물의 분석 및 작성을 위해 가능한 한 완전한 레코드를 제공할 수 있습니다.
그림 1: 데이터 관리 플랫폼에서 데이터 및 메타데이터의 가능한 구성 예. 각 프로젝트는 cryo-EM 또는 질량 분광법 (viz. 프로토콜 단계 2.3)과 같은 여러 실험으로 구성 될 수 있습니다. 각 실험에는 여러 사용자 정의 워크플로(viz. 프로토콜 단계 2.5)가 포함될 수 있으며, 각 워크플로는 구성 가능한 여러 단계(viz. 프로토콜 단계 2.7)로 구성됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 데이터 관리 플랫폼에서 열린 프로젝트 워크플로에서 보기 그림에서는 워크플로에서 열린 단계에 대한 관련 메타데이터 및 메모를 보여 줍니다. 아이콘이있는 왼쪽 막대는 데이터 관리 플랫폼의 다양한 옵션과 메뉴에 빠르게 액세스 할 수 있습니다. 왼쪽 패널에는 저장된 워크플로 목록(저장된 워크플로 "Exp2_ApoF_EFTEM_Grid7"이 하나만 표시됨)과 새 워크플로를 추가하는 파란색 단추가 포함되어 있습니다. 중앙 패널에는 여기에 SPA 워크플로에 표시된 것처럼 열린 워크플로의 개별 단계가 표시됩니다. 오른쪽 위에 있는 파란색 단추는 열려 있는 워크플로에 단계를 추가할 수 있습니다. 오른쪽 패널에는 기록된 메타데이터 또는 워크플로의 사용자 입력 노트를 위한 공간이 포함되어 있으며, 여기에는 텍스트, 테이블 및 이미지가 포함될 수 있습니다. 텍스트에 대한 다양한 서식 옵션을 사용할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Vitrobot과 같은 전통적인 급락 냉동 장치로 생산 된 Cryo-EM 그리드는 일반적으로 그리드 표면 위에 얼음 두께의 기울기를 표시합니다. 일부 그리드는 수동 처리 및/또는 오토그리드 링 캐리어로 클리핑 후 손상(구부러짐)될 수도 있습니다. 그림 3은 아틀라스 개요에 표시된 것처럼 다양한 격자의 예를 보여 줍니다. 두꺼운 얼음이나 손상이있는 그리드는 추가 조사에서 제외되어야합니다.
그림 3: 아틀라스 개요에서 볼 수 있듯이 다양한 그리드의 갤러리 . (A) 두꺼운 얼음이 있는 불량 그리드, (B) 얼음과 얼음 오염이 심한 구부러진 그리드, (C) 얼음 그라디언트가 좋은 허용 가능한 그리드, (D) 좋은 얇은 얼음과 작은 얼음 그라디언트가 있는 일반적인 그리드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
손상이 없고 최적의 얼음 두께가 있는 그리드 사각형을 선택하는 것은 고해상도 데이터 세트를 수집하는 데 매우 중요합니다. 얼음 두께는 개별 격자 사각형의 수준에서도 다를 수 있으므로 선택한 각 격자 사각형에서 최적으로 얇은 얼음이있는 구멍 만 선택하는 것이 중요합니다. 그림 4는 중앙에 손상되지 않은 호일과 얇은 얼음이있는 적절한 그리드 사각형을 보여줍니다. 표시된 격자 사각형은 얼음이 없는 빈 구멍뿐만 아니라 다양한 얼음 두께의 범위를 포함하므로 선택된 모든 격자 사각형에 얇은 얼음이 있는 구멍을 자동으로 선택하기 위한 필터를 설정하는 데 적합하며, 이는 구멍 선택 작업에서 얼음 필터에서 적절한 범위의 강도를 설정하는 데 매우 유용합니다.
그림 4: 중앙의 빈 격자 사각형과 격자 막대 근처의 두꺼운 얼음에서 얼음 두께의 그라디언트가 있는 격자 사각형의 예입니다. 얼음 품질의 필터는 그리드 사각형 (녹색 오버레이가있는 구멍)에서 선택한 이상적인 얼음 두께로 구멍 내부의 강도 범위를 선택하는 데 사용할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
기술된 프로토콜을 이용한 벤치마크 결과는 Kikkawa 그룹11로부터의 마우스 아포페리틴(apoF)의 샘플을 사용하여 수득되었다. ApoF는 매우 안정적인 팔면체 케이지를 형성하는 매우 α 나선형 단백질입니다. 높은 안정성과 높은 대칭성을 통해 apoF는 고해상도 cryo-EM 이미징 및 이미지 처리를 위한 최적의 샘플입니다. 따라서 ApoF는 cryo-EM 계측기11,12,13의 성능을 평가하기 위한 표준 샘플이 되었습니다. 정제된 apoF 샘플 15 mg/mL를 함유하는 냉동 분취량을 얼음 상에서 해동시키고, 10분 동안 10,000 x g에서 원심분리에 의해 정화하였다. 상청액을 20 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl로 5 mg/mL로 희석하였다. 희석된 샘플 3 μL를 30초 동안 글로우 배출된 R-1.2/1.3, 300 메쉬 금 격자 상에 적용하였다. 그 다음 그리드를 액체 질소에 의해 냉각된 액체 에탄으로 급락-동결시키기 전에 5 s 동안 블롯팅하였다. 플런지-동결은 100% 습도 및 4°C에서 완전 자동화된 유리화 시스템을 사용하여 수행되었다. 모든 그리드를 오토그리드로 클리핑하고 200kV Cryo-TEM에 로드했습니다. 약 3000 편의 영화가 300 영화 / h의 처리량으로 수집되었습니다. 데이터는 다음과 같은 수정과 함께11에 설명된 바와 같은 방법을 사용하여 처리되었다: i) Relion 3.1 대신 Relion 4-beta 버전을 사용하였고, ii) 자동화된 입자 채킹은 이전 apoF 재구성의 2D 클래스 평균을 참조로 사용하여 수행되었으며, iii) 초기 3D 모델은 이전의 apoF 재구성으로부터 15-Å 분해능으로 저역통과하여 생성되었다. 사용된 AFIS 절차 34가 보고된 해상도에서3D 맵을 재구성하기 위해 데이터 품질을 제한하지 않는 빔 틸트 유도 위상 이동을 효율적이고 안정적으로 최소화하는 것으로 입증되었기 때문에 광학 그룹화는 이 데이터 세트에 대해 수행되지 않았다. 베이지안 연마 및 CTF 개선 후 3D 개선은 1.68 Å 해상도 맵으로 이어졌습니다. Ewald 구 보정을 통해 해상도가 더욱 향상되어 1.63 Å 해상도 맵이 생성되었습니다. 데이터 수집 및 처리 파라미터에 대한 개요는 표 2에 나와 있으며, 최종 재구성된 밀도 맵은 보충 그림 8에 표시된 푸리에 쉘 상관관계(FSC) 곡선과 함께 그림 5에 나와 있습니다.
표 2: 아포페리틴의 3D 재구성에 사용되는 데이터 수집 및 이미지 처리 파라미터. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 아포페리틴의 Cryo-EM 재구성 . (왼쪽 패널) 1.6 Å 해상도에서 재구성된 apoF cryo-EM 맵의 3D 렌더링. (오른쪽 패널) 개별 아미노산 측쇄의 수준에서 재구성 된 맵의 상세보기. 아미노산 측쇄의 밀도는 잘 해결되며, 원자 모델은이 맵 내에서 명확하게 구축 될 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
SPA 재구성에서 에너지 필터를 사용하는 효과 및 이점은 T. acidophilum으로부터 분리된 원핵생물 20S 프로테아좀을 사용하여 평가하였다. 원핵생물 20S 프로테아좀은 D7 대칭을 갖는 프로테아좀 복합체의 안정한 촉매 코어를 나타내기 때문에 표준 cryo-EM 샘플로도 사용되었다. 4.5 μL의 정제된 T. acidophilum 20S 프로테아좀 샘플을 글로우 배출된 200-메쉬 R2/1 구리 그리드 상에 첨가함으로써 그리드를 제조하였다. 샘플을 4°C 및 100% 습도로 설정된 완전 자동화된 유리화 시스템을 사용하여 액체 에탄/프로판 혼합물에서 20의 블롯 힘과 4.5s의 블롯 시간을 사용하여 유리화하였다.
에너지 필터의 상이한 슬릿 폭을 순서대로 사용하여 유사한 그리드 사각형을 갖는 동일한 cryo-EM 그리드로부터 세 개의 상이한 데이터 세트가 수집되었다: i) 슬릿 완전 개방(슬릿 삽입 없음), ii) 20eV 슬릿 및 iii) 10eV 슬릿. 그리드 사각형은 분석 소프트웨어 내에서 얼음 품질 필터를 사용하여 선택되었습니다. 데이터 수집 및 데이터 처리를 위한 다른 모든 파라미터는 동일하게 유지되었다. 총 4000편의 영화로 15시간 동안 데이터 세트를 수집하고, Relion 3.1을 사용하여설명된 11과 같은 방법을 사용하여 처리되었으며, 전체 데이터 세트에서 참조 기반 입자 채취를 위한 초기 2D 클래스 평균을 생성하기 위해 Laplacian-of-Gaussian 입자 채취 알고리즘이 사용되었다는 수정이 적용되었습니다. 무작위로 선택된 입자의 동일한 수(102,200)가 선택되어 각 데이터 세트의 최종 반복 및 3D 재구성에 사용되었습니다. 데이터 처리 변수는 보충 그림 9에 표시된 FSC 곡선과 함께 도 6에 도시된 최종 재구성된 EM 밀도 맵을 달성하기 위해 아래의 표(표 3)에 설명되어 있습니다. 광학 그룹화 및 Ewald 영역 보정은 이러한 데이터 세트에 대해서도 수행되지 않았습니다.
표 3: T. acidophilum 20S 프로테아좀의 3D 재구성에 사용되는 데이터 수집 및 이미지 처리 파라미터. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 4: 상이한 에너지 슬릿 폭을 갖는 데이터 세트를 사용하여 T. acidophilum 20S 프로테아좀의 cryo-EM 재구성을 위한 달성된 분해능 및 B 인자의 요약. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: cryo-EM 이미지에 대한 에너지 필터링의 영향 . (A) 10eV 슬릿 유무에 관계없이 수집된 다양한 디포커스 값에서의 Cryo-EM 이미지. (B) 분할된 서브유닛을 갖는 20S 프로테아좀 cryo-EM 맵의 개요. (C) 원자 모델이 장착된 20S 프로테아좀 지도에서 확대/축소 보기. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1: 100x에서 165,000x 사이의 전체 배율 범위에서 볼 수 있는 육각형 얼음의 수정을 사용하여 분석 소프트웨어에서 서로 다른 광학 사전 설정(빨간색 타원) 간에 이미지 이동을 정렬하는 이미지 이동 작업(노란색 타원)의 보정. (상단) 데이터 수집과 구멍/유중심 높이 사전 설정 간의 보정, 구멍/유중심 높이와 그리드 정사각형 사전 설정 간의 (중간) 교정, 그리드 사각형과 아틀라스 사전 설정 간의 (하단) 보정. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 2: 분석 소프트웨어에서 자동 낙인 찍기 기능(노란색 타원). (왼쪽 이미지) 획득한 이미지. (오른쪽 이미지) 방사형 빔에 표시된 동심원 Thon 링과 CTF 핏을 보여주는 획득 된 이미지의 푸리에 전송. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 3: 혼수 상태 정렬을 위한 분석 소프트웨어(노란색 타원)에서 Autocoma 함수의 사용자 인터페이스. 이미지 패널은 서로 다른 빔 기울기에서 획득한 푸리에 전송 이미지와 혼수 상태 계산에 사용되는 CTF 핏을 보여줍니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 4: 에너지 필터 튜닝의 사용자 인터페이스. 사양 내에서 모든 매개 변수 (녹색 텍스트로 표시)가있는 에너지 필터 등색도에 대한 좋은 튜닝 보고서의 예입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 5: 에너지 필터 튜닝의 사용자 인터페이스. 사양 내의 모든 매개 변수 (녹색 텍스트로 표시)가있는 에너지 필터 배율 왜곡에 대한 양호한 튜닝 보고서의 예. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 6: 에너지 필터 튜닝의 사용자 인터페이스. 사양 내에서 모든 매개 변수 (녹색 텍스트로 표시됨)를 사용하여 에너지 필터 색채 왜곡을 잘 조정한 예. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 7: 수집된 cryo-EM 데이터 세트의 데이터 품질에 대한 개요가 있는 EPU 품질 모니터의 DataViz 패널. 수집된 모든 이미지/동영상의 집계된 데이터가 있는 그래프는 CTF 적합도 신뢰도(파란색), 초점 해제(주황색) 및 난시(녹색)와 같은 선택된 중요 품질 지표의 값(점도표) 및 분포(막대 그림)를 보여 줍니다. 수집된 이미지/동영상의 하위 집합은 DataViz 패널 상단에서 매개 변수 필터를 설정하여 선택할 수 있습니다. 필터를 적용한 후 선택한 이미지/동영상을 내보내 Relion 또는 CryoSpark와 같은 다른 이미지 처리 패키지에서 추가 처리를 수행할 수 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 8 : Relion 4-beta에 의해보고 된 바와 같이 apoF의 최종 재구성의 FSC 곡선을 1.6 Å 해상도로 조정했습니다. 파란색 곡선은 두 개의 상호 배타적인 하프 데이터 세트에서 독립적으로 정제된 두 개의 3D 재구성에서 마스크된 3D 맵의 FSC를 보여줍니다. 0.143의 금 표준 FSC에 따르면 전체 데이터 세트에서 재구성 된 최종 3D 맵의 해상도는 1.6 Å에 해당합니다. 주황색 곡선은 무작위 위상을 갖는 마스크된 3D 재구성의 FSC를 보여줍니다. FSC 곡선의 급격한 하락은 사용 된 마스크가 ~ 2 Å 해상도를 초과하는 원래 재구성 된 맵 (파란색 곡선)의 관찰 된 FSC에 기여하지 않았 음을 나타냅니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 9 : Relion 3.1에 의해보고 된 바와 같이 에너지 필터의 다른 슬릿 폭을 사용하는 T. acidophilum 20S 프로테아좀의 최종 재구성의 FSC 곡선. 파란색 곡선은 각각 각 데이터 세트의 두 개의 절반 데이터 세트에서 독립적으로 정제된 두 개의 재구성에서 마스크된 3D 맵의 FSC를 보여줍니다. 0.143의 금 표준 FSC는 각각의 전체 데이터 세트(각각 2.3 Å, 2.2 Å 및 2.1 Å 해상도)에서 재구성된 최종 3D 맵의 달성된 해상도를 나타냅니다. 빨간색 곡선은 무작위 위상이 있는 마스크된 맵의 FSC를 보여줍니다. 빨간색 FSC 곡선의 급격한 하락은 사용 된 마스크가 ~ 3 Å 해상도를 넘어 원래 재구성 된지도의 FSC에 기여하지 않았 음을 나타냅니다. 녹색 곡선은 마스크되지 않은 3D 맵의 FSC를 보여 주며, 이는 재구성된 전체 3D 볼륨의 노이즈의 영향을 받아 마스크된 3D 맵의 FSC보다 더 빨리 떨어집니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
데이터의 가용성: cryo-EM 밀도지도는 EM 데이터 뱅크에 수탁 번호 인 apoferritin: EMD 14173, EMPIAR-10973으로 기탁되었습니다. 20S 프로테아좀: EMD 14467, EMPIAR-10976.
Discussion
기술된 프로토콜은 사용된 TEM 현미경의 광학이 잘 정렬된 상태에 있다고 가정한다. 이 프로토콜에 사용된 200kV TEM의 경우, 이러한 컬럼 정렬은 현미경 설치 또는 중요한 서비스 개입 후 숙련된 서비스 엔지니어에 의해 수행, 검증 및 저장됩니다. 이러한 정렬 설정은 현미경 UI에서 언제든지 불러올 수 있습니다. 사용자는 현미경 UI의 직접 정렬 절차를 사용하여 중요한 매개 변수를 다시 조정할 수 있습니다. 총 기울기 및 총 이동과 같은 일부 정렬은 안정적이며 사용자가 매일 조정할 필요가 없습니다. 현미경 감독관에 의한 총 기울기 및 교대의 점검 및 재 정렬 (필요한 경우)은 일년에 두 번 권장됩니다. 반면에 일부 정렬은 중요하며 위의 프로토콜에 설명 된대로 각 데이터 수집 전에 정렬되어야합니다 (예 : 객관적인 난시 및 혼수 상태가없는 정렬). 분석 소프트웨어의 Autocoma 기능이 수렴되지 않으면 빔 틸트 피벗 포인트 및/또는 회전 중심의 정렬을 확인 및 조정하고 C2 조리개의 올바른 중심을 확인해야 합니다. 그 후, 자동 낙인 찍기 기능은 객관적인 낙인이 혼수 상태 교정에도 사용되기 때문에 실행되어야합니다. 이러한 정렬은 Autostigmate와 Autocomafunctions가 첫 번째 반복에서 성공할 때까지 반복되어야합니다. 필요하다면, 획득된 이미지들에서의 신호-대-잡음비를 최적화하기 위해 다른 영역(예를 들어, 얼음 없이 탄소 호일 지지), 영상화된 디포커스 조정, 또는 이미지 획득 시간 증가, 및 획득된 이미지들의 푸리에 변환에서 다수의 톤 링들의 가시성이 선택될 수 있다.
최신 cryo-EM 현미경은 특히 대칭성이 낮은 단백질에 대해 고해상도 3D 재구성을 달성하기 위해 데이터 세트당 1TB를 초과하는 방대한 양의 데이터를 생성합니다. Cryo-EM 데이터 및 결과는 일반적으로 각 과학 프로젝트의 구조 - 기능 관계를 완전히 이해하기 위해 직교 방법의 데이터 및 결과로 보완됩니다. 수집된 데이터의 조직, 이미지 처리 파이프라인으로의 전송, 공동 작업자 간의 결과 cryo-EM 재구성 공유는 cryo-EM 방법론의 새로운 채택자에게 로컬 IT 인프라를 설정하는 데 추가적인 요구 사항을 적용합니다. Athena와 같은 데이터 관리 소프트웨어는 등록된 사용자가 운영하는 연결된 기기 또는 소프트웨어에 의해 획득된 데이터의 중앙 집중식 저장을 용이하게 합니다. 저장된 데이터 및 메타데이터는 실험 설정의 로그인 자격 증명 및 데이터 공유 정의에 따라 서로 다른 액세스 권한(소유자, 공동 작업자 또는 뷰어)을 사용하여 프로젝트에서 서로 다른 역할을 수행할 수 있는 여러 사용자가 간단한 웹 브라우저 인터페이스를 사용하여 액세스할 수 있습니다. 이러한 실험 워크플로의 디지털화는 불필요한 중복 없이 공동 작업자 간에 데이터 및 메타데이터를 공유할 수 있는 수단을 제공하고 사용된 워크플로의 생산성과 추적성을 향상시킵니다. 데이터 관리 소프트웨어에서 프로젝트, 실험 및 워크플로의 일반적이고 사용자 정의 가능한 구조를 구현하는 것은 보편적이며 보완적인 방법을 사용하여 직교 실험을 단일 프로젝트 데이터베이스에 사용자 정의하고 통합할 수 있습니다.
cryo-EM 그리드에서 데이터 수집을 위한 영역을 선택하는 것은 고해상도 데이터 세트를 성공적으로 획득하는 데 매우 중요합니다. Vitrobot(완전 자동화된 유리화 시스템)과 같은 기존의 급락 냉동 장치로 생산된 Cryo-EM 그리드는 일반적으로 그리드 표면에 얼음 두께의 기울기를 표시합니다(그림 4). 이것은 그리드에 얼음 두께가 다른 영역이 포함되어 있기 때문에 유용 할 수 있습니다. 그러나 데이터 수집에 이상적인 얼음 두께를 가진 영역은 위의 프로토콜에 설명 된대로 식별되어야합니다. 최적의 cryo-EM 그리드는 가능한 한 적은 이송 얼음 오염을 포함해야하며 구멍이 뚫린 지지 호일이있는 충분한 그리드 사각형을 포함해야합니다. 균열이나 깨진 영역이있는 그리드 사각형에 대한 데이터 수집은 수집 된 이미지가 손상되지 않은지지 호일을 가진 그리드 사각형과 비교하여 전자 빔에 의한 조명시 훨씬 강한 전반적인 드리프트의 영향을받기 때문에 권장되지 않습니다. 과도한 결정질 얼음은 대부분의 호일 구멍을 막거나 자동 초점을 방해 할 수 있으며 이러한 그리드 사각형도 피해야합니다. 얇은 얼음이 있는 격자 사각형은 일반적으로 큰 유리체 영역과 아틀라스 사전 설정을 사용하여 촬영한 이미지에서 볼 수 있는 많은 밝은 호일 구멍을 나타냅니다. 그리드 막대에 가까운 더 두꺼운 얼음의 발생은 구멍 선택 절차 중에 그리드 사각형의 이러한 영역에 있는 호일 구멍이 제외되므로 중요하지 않을 것으로 예상됩니다. 그리드 사각형에 여러 개의 빈 구멍이 있다는 것은 주변 구멍의 유리체 얼음이 매우 얇고 손상된 입자를 포함하거나 입자가 전혀 없을 수 있음을 나타낼 수 있습니다. 일반적으로 초기 스크리닝 및 평가를 위해 그리드의 여러 영역에서 다양한 얼음 두께를 가진 그리드 사각형을 선택하여 고해상도 데이터 수집에 가장 적합한 조건을 가진 영역을 이해하고 이상적인 입자 밀도 및 방향 분포를 나타내는 것이 좋습니다. 이 연구에 사용된 apoF 및 20S 프로테아좀 샘플의 경우, 관찰 가능한 얼음이 가장 얇은 영역에는 이러한 샘플의 고해상도 이미징을 위한 최상의 조건이 포함되어 있습니다.
데이터 수집 소프트웨어를 사용하여 선택된 모든 격자 사각형에서 자동으로 구멍을 선택할 때는 각 격자 사각형의 대표 구멍에 대해 템플릿 실행 작업을 수행하여 데이터 수집을 위해 지나치게 두껍거나 지나치게 얇거나 예기치 않게 비유리체 사각형이 선택되지 않았는지 확인하는 것이 좋습니다. 데이터 수집 중에 EQM을 사용하여 이미지 드리프트 및 CTF 피팅과 같은 수집된 이미지의 주요 품질 지표를 모니터링할 수 있습니다. 그런 다음 품질이 좋지 않은 이미지를 생성하는 영역을 건너 뛰면 데이터 수집을 최적화 할 수 있습니다. 그러나 고해상도 CTF 핏을 가진 이미지는 여전히 몇 가지 바람직한 방향의 입자 또는 너무 얇은 얼음 층에서 변성 된 입자가있는 이미지를 포함 할 수 있습니다. 수집된 이미지로부터의 실시간 입자 채집 및 2D 분류는 이미지화된 입자의 구조 데이터의 품질에 대한 추가 정보를 제공할 것이고, 얼음에서 손상되지 않은 입자의 선호되는 배향 또는 (부분적으로) 변성된 입자의 일관성 없는 구조를 모두 드러낼 것이다. 따라서 클래스 평균의 계산은 다른 소프트웨어 패키지(23,28)에 이미 구현되고 도시된 바와 같이, 데이터 수집을 위한 적절한 영역을 더욱 구체화하는 데 도움이 될 수 있다.
배율, 전자 선량 비율 및 디포커스 범위와 같은 데이터 수집을 위한 이미징 설정의 선택은 표적 분해능, 단백질의 크기, 샘플 농도, 원하는 현미경 처리량 등과 같은 몇 가지 기준에 따라 달라집니다. 이 실험에 사용 된 직접 전자 검출기 카메라의 경우 병렬 조명을 유지하기 위해 적절한 SPOT 크기와 강도를 선택하여 전자 선량 속도를 4-5 e / pix / s 범위에서 선택했습니다. 표 1에 도시된 바와 같이, 홀/유센트릭 높이 프리셋에서 상이한 SPOT 사이즈를 사용하여 데이터 수집 동안 홀을 센터링하기 위한 이미지에서 충분한 신호-잡음비를 보장할 수 있다. 배율은 픽셀 크기가 cryo-EM 재구성을위한 목표 해상도보다 적어도 2-3 배 작도록 선택해야합니다. 그러나, 더 높은 배율(즉, 더 작은 픽셀 크기)이 사용되고, 더 작은 시야각이 이미지에서 캡처되고, 이미지당 더 적은 입자들이 존재하며, 이는 궁극적으로 3D 맵을 고해상도로 재구성하기에 충분한 입자를 갖는 이미지를 수집하기 위해 더 긴 데이터 수집 시간을 유도한다. apoF 샘플의 경우, 이미지에서 고밀도의 입자에 대한 충분한 샘플 농도를 가지며 재구성의 하위 2 Å 해상도를 목표로 삼았 기 때문에 0.43 Å의 픽셀 크기를 사용했습니다. 20S 프로테아좀 샘플의 경우, 0.68 Å의 픽셀 크기를 사용하여 획득한 이미지에서 더 큰 시야각을 커버했습니다. 일반적으로 200kV TEM 현미경의 경우 cryo-EM 이미지는 0.8 ~ 2.0μm의 디포커스 범위에서 수집됩니다. 그러나 에너지 필터를 사용하여 향상된 명암비 및 신호 대 잡음비를 통해 데이터 수집은 더 작은 수차와 그에 따라 CTF 엔벨로프 기능의 감쇠를 줄임으로써 획득 된 이미지에서 고해상도 정보를보다 잘 보존하기 위해 초점을 맞추기 위해 훨씬 더 가깝게 수행 될 수 있습니다. 또한 조리개가 추가 이미지 수차를 발생시킬 수 있지만 이미지 대비는 이미 에너지 필터를 사용하여 충분히 향상될 수 있으므로 대물 조리개를 사용하지 않습니다. apoF 및 20S 프로테아좀 샘플의 경우 0.5μm, 0.7μm 및 0.9μm의 디포커스 설정을 사용했습니다. 더 작은 단백질 (<200 kDa)의 경우 -0.5 μm, -0.7 μm 및 -0.9 μm의 디포커스 설정을 사용하여 입자의 대비를 개선하고 3D 재구성의 3D 정제 단계에서 입자 채취 및 초기 거친 정렬을 용이하게하여 ~ 2.5 Å 해상도 3D 맵 (게시되지 않은 결과)을 이끌어 냈습니다.
우리는 이미 에너지 필터로 이미징하면 하이엔드 300kV TEM 현미경(11)에서 수집된 cryo-EM 이미지에서 신호 대 잡음비(SNR)가 향상된다는 것을 보여주었습니다. 사실, 전자가 샘플을 통과 할 때, 두 가지 주요 유형의 상호 작용이 발생합니다 : i) 탄력적으로 산란 된 전자는 에너지를 유지하고 위상 대비 메커니즘을 통해 비 산란 입사 빔과의 간섭에 의해 이미지 형성에 기여합니다 ii) 비탄력적으로 산란 된 전자는 샘플에서 일부 에너지를 잃고 주로 이미지의 노이즈에 기여합니다. 따라서, SNR은 좁은 에너지 슬릿을 사용하여 입사 빔 및 탄성적으로 산란된 전자보다 낮은 에너지를 갖는 비탄성적으로 산란된 전자를 필터링함으로써 상당히 개선될 수 있다. 그러나 Selectris 또는 Selectris-X와 같이 충분히 안정적인 에너지 필터를 사용하여 고해상도 cryoEM 데이터 세트의 장기간(12시간 이상)에 걸쳐 매우 좁은(10eV 이하) 슬릿을 사용할 수 있어야 합니다.
300kV TEM 현미경과 동일한 조건에서 200kV TEM 현미경으로 획득한 Cryo-EM 이미지는 CTF 엔벨로프 기능의 빠른 감쇠로 인해 고해상도(특히 <4Å)에서 더 작은 SNR을 나타냅니다. 결과적으로, 200kV TEM을 사용할 때 특정 분해능을 달성하기 위해서는 더 많은 수의 입자(따라서 더 많은 수의 수집된 이미지)가 요구된다. 추가적으로, 피사계 심도(2-3 Å 해상도 범위에서 10-25nm)도 200kV 이미지(35)에서 약 20% 더 작으며, 이는 얼음층 내의 더 적은 입자(전형적으로 20-50nm 두께)가 완전히 초점이 맞춰지고 3D 재구성 절차의 후반 단계에서 각 입자에 대해 디포커스 값이 독립적으로 정제되지 않는 한 계산된3D 재구성의 모든 고해상도 특징에 건설적으로 기여한다는 것을 의미한다. 더 큰 입자(예를 들어 이코사헤드랄 비리온 또는 다른 거대분자 어셈블리)의 경우, 입자 크기는 고해상도에서 피사계 심도를 초과할 수 있고, 표준 3D 재구성 알고리즘(36)에서 Ewald 구체의 평면 근사화로 인한 위상 에러를 도입할 수 있다. 이러한 오류는 일반적인 cryo-EM 이미지 처리 패키지(37,28,39)에서 이미 구현된 고급 알고리즘에 의해 개선될 수 있다. Ewald 구는 300kV 데이터보다 200kV 데이터에서 더 큰 곡률을 가지므로 Ewald 구 보정은 200kV TEM을 사용할 때 상대적으로 낮은 분해능 및/또는 상대적으로 작은 거대분자 어셈블리에서 필요합니다. 한편, 200kV 이미지는 200-300keV 전자 평균 자유 경로(220-280nm)보다 상당히 얇은 얇은 얼음(20-50nm)에서 입자의 콘트라스트가 더 높음을 나타냅니다. 콘트라스트가 높을수록 개별 입자의 올바른 전역 정렬을 개선하는 데 도움이되며, 특히 구조가 아직 알려지지 않은 작은 단백질을 약하게 산란시키는 경우 3D 참조 모델이 아직 잘 확립되지 않았습니다.
여기에서는 20S 프로테아좀의 예에서 200kV TEM 현미경을 사용할 때 에너지 필터로 이미지 대비와 품질을 유사하게 향상시킬 수 있음을 시연했습니다. 동일한 수의 입자를 사용하여 20eV 슬릿을 사용하여 수집된 데이터는 완전히 개방된 에너지 슬릿으로 수집된 데이터와 비교하여 2.34 Å 분해능으로만 재구성되었습니다. 최상의 재구성은 2.14 Å 분해능으로 재구성된 10eV 슬릿을 사용하여 수집된 데이터로부터 달성되었습니다. 이러한 결과는 비탄성적으로 산란된 전자의 필터링이 수집된 이미지에서 SNR을 증가시키고 표 4에 요약된 바와 같이 주어진 입자 수로부터 cryo-EM 재구성에서 더 높은 분해능을 촉진한다는 이론적 예측과 일치한다. 이러한 결과는 에너지 필터링된 데이터 세트에서 더 높은 이미지 품질을 나타내는 이러한 데이터 세트에서 계산된 B-요인에 의해 추가로 확인되었습니다.
따라서 300kV TEM 현미경은 cryo-EM 재구성에서 가장 높은 처리량과 가능한 가장 높은 분해능을 제공하지만 200kV TEM 현미경은 고해상도 cryo-EM 재구성을 위한 고품질 데이터 세트를 제공한다는 결론을 내릴 수 있습니다. 우리는 여기서 획득 한 이미지의 품질, 따라서 전반적인 구조 시간이 에너지 필터와 직접 전자 검출기가 장착 된 200kV TEM을 사용하여 더욱 향상 될 수 있음을 보여주었습니다. 제시된 프로토콜은이 설정을 사용하여 고해상도 cryo-EM 데이터를 일상적으로 얻는 방법에 대한 모든 필요한 단계를 설명하고 구조 생물학 및 구조 기반 약물 설계의 주요 구조 - 기능 관계를 이해하는 데 필수적인 거대 분자 3D 구조의 미세한 구조적 세부 사항을 공개합니다.
Disclosures
Sagar Khavnekar는 이해 상충을보고하지 않습니다. 다른 저자는 MSD-EM 부서 인 Thermo Fisher Scientific의 직원입니다.
Acknowledgments
없음.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AutoGrid rings | Thermo Fisher Scientific | 1036173 | Package of 100x AutoGrid rings for the standard EM grids. |
| C-Clip | Thermo Fisher Scientific | 1036171 | Package of 100 clips that secure the standard EM grids inside the AutoGrid rings. |
| Data Management Platform | Thermo Fisher Scientific | 1160939 | Part of the Glacios base configuraiton; includes Athena Software |
| EPU Quality Monitor | Thermo Fisher Scientific | 1179770 | |
| EPU Software | Thermo Fisher Scientific | 1025080 | Part of the Glacios base configuration |
| Ethane 3.5 | Westfalen | A06010110 | Ethane gas used for making liquid ethane (puritiy at least N35, i.e. 99.95% vol) |
| Falcon 4 200kV | Thermo Fisher Scientific | 1166936 | Direct electron detector |
| Glacios | Thermo Fisher Scientific | 1149551 | 200 kV TEM |
| GloQube Plus Glow Discharge System for TEM Grids and surface modification | Quorum | N/A | also available via Thermo Fisher Scientific (PN 1160602) |
| QuantiFoil grids | Quantifoil | N/A | R-2/1, 300 mesh; carbon foil grid |
| Relion | MRC Laboratory of Molecular Biology | N/A | open source software: https://relion.readthedocs.io/en/release-3.1/ |
| Selectris with Falcon 4 for 200 kV |
Thermo Fisher Scientific | 1191753 | Energy filter |
| Selectris X with Falcon 4 for 200 kV |
Thermo Fisher Scientific | 1191755 | Energy filter |
| UltrAuFoil grids | Quantifoil | N/A | R-1.2/1.2, 300 mesh; gold foil grids |
| Vitrobot Mk. IV | Thermo Fisher Scientific | 1086439 | Automated vitrification system |
| Whatman 595 filter paper | Thermo Fisher Scientific | AA00420S |
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