Système de culture tridimensionnel sans sérum pour cellules souches de la glande lacrymale
Summary
La méthode de culture tridimensionnelle sans sérum pour les cellules souches de la glande lacrymale adulte (LG) est bien établie pour l’induction de la formation d’organoïdes LG et la différenciation en cellules acineuses ou canalaires.
Abstract
La thérapie à base de cellules souches de la glande lacrymale (LG) est une stratégie prometteuse pour les maladies de la glande lacrymale. Cependant, l’absence d’une méthode de culture fiable et sans sérum pour obtenir un nombre suffisant de cellules souches LG (LGSC) est un obstacle à la poursuite de la recherche et de l’application. La méthode de culture tridimensionnelle (3D) sans sérum pour les LGSC de souris adultes est bien établie et montrée ici. Les LGSC pourraient être continuellement passés et induits à se différencier en cellules acineuses ou canalaires.
Pour la culture primaire lgsc, les LG de souris âgées de 6 à 8 semaines ont été digérées avec de la dispase, de la collagénase I et de la trypsine-EDTA. Au total, 1 × 104 cellules uniques ont été ensemencées dans 80 μL de matrice gel-milieu de cellules souches de glande lacrymale (LGSCM) dans chaque puits d’une plaque de 24 puits, prélaquée avec 20 μL de matrice gel-matrice LGSCM. Le mélange a été solidifié après incubation pendant 20 min à 37 °C, et 600 μL de LGSCM ajoutés.
Pour l’entretien des LGSC, les LGSC cultivés pendant 7 jours ont été désagrégés en cellules individuelles par dispase et trypsine-EDTA. Les cellules individuelles ont été implantées et cultivées selon la méthode utilisée dans la culture primaire LGSC. Les LGSC pourraient être passés plus de 40 fois et exprimer en continu les marqueurs de cellules souches / progénitrices Krt14, Krt5, P63 et nestin. Les LGSC cultivés dans LGSCM ont une capacité d’auto-renouvellement et peuvent se différencier en cellules acineuses ou canalaires in vitro et in vivo.
Introduction
Les cellules souches des glandes lacrymales (LGSC) maintiennent le renouvellement cellulaire des glandes lacrymales (LG) et sont la source de cellules acineuses et canalaires. Par conséquent, la transplantation de LGSC est considérée comme une approche alternative pour traiter les lésions inflammatoires graves et la sécheresse oculaire aqueusement déficiente (ADD)1,2,3. Plusieurs méthodes de culture ont été appliquées pour enrichir les LGSC. Tiwari et al. ont séparé et cultivé des cellules LG primaires à l’aide de collagène I et de gel matriciel complété par plusieurs facteurs de croissance; cependant, les cellules LG n’ont pas pu être cultivées en continu4. En utilisant une culture bidimensionnelle (2D), des cellules souches dérivées de LG de souris ont été isolées par You et al.5 et Ackermann et al. 6, qui exprime les gènes marqueurs des cellules souches /progénitrices, Oct4, Sox2, Nanog et nestin, et pourrait être sous-cultivé. Cependant, il n’y a pas d’indication claire que ces cellules peuvent se différencier en cellules acineuses ou canalaires, et il n’y a pas d’expérience de transplantation pour vérifier le potentiel de différenciation in vivo.
Récemment, des cellules c-kit+ dim/EpCAM+/Sca1–/CD34–/CD45– ont été isolées à partir de LG de souris par cytométrie en flux, s’exprimant des marqueurs de cellules progénitrices LG, tels que Pax6 et Runx1, et différenciées en canaux et acini in vitro. Chez les souris atteintes d’ADD, l’injection orthotopique avec ces cellules pourrait réparer les LG endommagés et restaurer la fonction sécrétoire des LG2. Cependant, le nombre de cellules souches isolées par cette méthode était faible et il n’existe pas de conditions de culture appropriées pour l’expansion des LGSC isolés. En résumé, un système de culture approprié doit être mis en place pour isoler et cultiver efficacement les LGSC adultes avec une expansion stable et continue pour l’étude des LGSC dans le traitement de l’ADD.
Les organoïdes dérivés de cellules souches ou de cellules souches pluripotentes sont un groupe de cellules qui sont histologiquement similaires aux organes apparentés et peuvent maintenir leur propre renouvellement. Après que l’organoïde de l’intestin de souris a été cultivé avec succès par Sato et al. en 20097, des organoïdes d’autres organes ont été cultivés successivement, sur la base du système de culture de Sato, tels que la vésicule biliaire8, le foie9, le pancréas10, l’estomac11, le sein12, le poumon13, la prostate14 et la glande salivaire15 . En raison de la forte proportion de cellules souches adultes avant la différenciation cellulaire en culture organoïde, la méthode de culture organoïde tridimensionnelle (3D) est considérée comme optimale pour l’isolement et la culture de cellules souches adultes de LG.
Un système de culture LGSC de souris adultes a été établi dans la présente étude en optimisant la méthode de culture 3D sans sérum. Il est prouvé que les LGSC cultivés à partir de souris normales et ajoutées ont montré une capacité stable d’auto-renouvellement et de prolifération. Après la transplantation dans les LG de souris ADDED, les LGSC ont colonisé les LG altérés et amélioré la production de larmes. De plus, des LGSC fluorescents rouges ont été isolés à partir de souris ROSA26mT/mG et cultivés. Ce travail fournit une référence fiable pour l’enrichissement en LGSC in vitro et l’autogreffe LGSC en application clinique pour la thérapie ADDED.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il existe des méthodes bien établies pour l’isolement et la culture in vitro de cellules souches lacrymales pour la culture de cellules souches lacrymales et la réparation des lésions LG. Shatos et al.17 et Ackermannet al. 6 cellules souches lacrymales cultivées et sous-cultivées avec succès de rats et de souris par des méthodes de culture 2D, respectivement, permettant de transplanter des cellules souches lacrymales pour le traitement de l’ADD…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par une subvention de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n ° 31871413) et deux programmes de science et technologie du Guangdong (2017B020230002 et 2016B030231001). Nous sommes vraiment reconnaissants aux chercheurs qui nous ont aidés pendant l’étude et aux membres du personnel travaillant dans le centre animalier pour leur soutien dans les soins aux animaux.
Materials
| Animal(Mouse) | |||
| Bal B/C | Model Animal Research Center of Nanjing University | ||
| C57 BL/6J | Laboratory Animal Center of Sun Yat-sen University | ||
| NOD/ShiLtJ | Model Animal Research Center of Nanjing University | ||
| ROSA26mT/mG | Model Animal Research Center of Nanjing University | ||
| Equipment | |||
| Analytical balance | Sartorius | ||
| Automatic dehydrator | Thermo | ||
| Blood counting chamber | BLAU | ||
| Cell Counter | CountStar | ||
| CO2 constant temperature incubator | Thermo | ||
| ECL Gel imaging system | GE healthcare | ||
| Electric bath for water bath | Yiheng Technology | ||
| Electrophoresis apparatus | BioRad | ||
| Fluorescence quantitative PCR instrument | Roche | ||
| Frozen tissue slicer | Lecia | ||
| Horizontal centrifuge | CENCE | ||
| Inverted fluorescence microscope | Nikon | ||
| Inverted microscope | Olympus | ||
| Laser lamellar scanning micrograph | Carl Zeiss | ||
| Liquid nitrogen container | Thermo | ||
| Low temperature high speed centrifuge | Eppendorf | ||
| Micropipettor | Gilson | ||
| Microwave oven | Panasonic | ||
| Nanodrop ultraviolet spectrophotometer | Thermo | measure RNA concentration | |
| Paraffin slicing machine | Thermo | ||
| PCR Amplifier | Eppendorf | ||
| pH value tester | Sartorius | ||
| 4 °C Refrigerator | Haier | ||
| Thermostatic culture oscillator | ZHICHENG | ||
| Tissue paraffin embedding instrument | Thermo | ||
| -80°C Ultra-low temperature refrigerator | Thermo | ||
| -20°C Ultra-low temperature refrigerator | Thermo | ||
| Ultra pure water purification system | ELGA | ||
| Reagent | |||
| Animal Experiment | |||
| HCG | Sigma | 9002-61-3 | |
| PMSG | Sigma | 14158-65-7 | |
| Pentobarbital Sodium | Sigma | 57-33-0 | |
| Cell Culture | |||
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| Collagenase I | Gibco | 17018029 | |
| Dispase | BD | 354235 | |
| DMEM | Sigma | D6429 | |
| DMEM/F12 | Sigma | D0697 | |
| DMSO | Sigma | 67-68-5 | |
| EDTA | Sangon Biotech | A500895 | |
| Foetal Bovine Serum | Gibco | 04-001-1ACS | |
| GlutaMax | Gibco | 35050087 | |
| Human FGF10 | PeproTech | 100-26 | |
| Matrigel (Matrix gel) | BD | 356231 | |
| Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Murine Wnt3A | PeproTech | 315-20 | |
| Murine EGF | PeproTech | 315-09 | |
| NEAA | Gibco | 11140050 | |
| N2 | Gibco | 17502048 | |
| R-spondin 1 | PeproTech | 120-38 | |
| Trypsin Inhibitor (TI) | Sigma | T6522 | Derived from Glycine max; can inhibit trypsin, chymotrypsin, and plasminase to a lesser extent. One mg will inhibit 1.0-3.0 mg of trypsin. |
| Trypsin | Sigma | T4799 | |
| Y-27632 | Selleck | S1049 | |
| HE staining & Immunostaining | |||
| Alexa Fluor 488 donkey anti-Mouse IgG | Thermo | A-21202 | Used dilution: IHC) 2 μg/mL, (IF) 0.2 μg/mL |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-Rabbit IgG | Thermo | A-21206 | Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL |
| Alexa Fluor 568 donkey anti-Mouse IgG | Thermo | A-10037 | Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL |
| Alexa Fluor 568 donkey anti-Rabbit IgG | Thermo | A-10042 | Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 4 μg/mL |
| Anti-AQP5 rabbit antibody | Abcam | ab104751 | Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 0.1 μg/mL |
| Anti-E-cadherin Rat antibody | Abcam | ab11512 | Used dilution: (IF) 5 μg/mL |
| Anti-Keratin14 rabbit antibody | Abcam | ab181595 | Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 2 μg/mL |
| Anti-Ki67 rabbit antibody | Abcam | ab15580 | Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 1 μg/mL |
| Anti-mCherry mouse antibody | Abcam | ab125096 | Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL |
| Anti-mCherry rabbit antibody | Abcam | ab167453 | Used dilution: (IF) 2 μg/mL |
| C6H8O7 | Sangon Biotech | A501702-0500 | |
| Citric Acid | Sangon Biotech | 201-069-1 | |
| DAB Kit (20x) | CWBIO | CW0125 | |
| DAPI | Thermo | 62248 | |
| Eosin | BASO | 68115 | |
| Fluorescent Mounting Medium | Dako | S3023 | |
| Formalin | Sangon Biotech | A501912-0500 | |
| Goat anti-Mouse IgG antibody (HRP) | Abcam | ab6789 | Used dilution: 2 μg/mL |
| Goat anti-Rabbit IgG antibody(HRP) | Abcam | ab6721 | Used dilution: 2 μg/mL |
| Hematoxylin | BASO | 517-28-2 | |
| Histogel (Embedding hydrogel) | Thermo | HG-400-012 | |
| 30% H2O2 | Guangzhou Chemistry | KD10 | |
| 30% Hydrogen Peroxide Solution | Guangzhou Chemistry | 7722-84-1 | |
| Methanol | Guangzhou Chemistry | 67-56-1 | |
| Na3C6H5O7.2H2O | Sangon Biotech | A501293-0500 | |
| Neutral balsam | SHANGHAI YIYANG | YY-Neutral balsam | |
| Non-immunized Goat Serum | BOSTER | AR0009 | |
| Paraffin | Sangon Biotech | A601891-0500 | |
| Paraformaldehyde | DAMAO | 200-001-8 | |
| Saccharose | Guangzhou Chemistry | 57-50-1 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sangon Biotech | 200-675-3 | |
| Sucrose | Guangzhou Chemistry | IB11-AR-500G | |
| Tissue-Tek O.T.C. Compound | SAKURA | SAKURA.4583 | |
| Triton X-100 | DINGGUO | 9002-93-1 | |
| Xylene | Guangzhou Chemistry | 128686-03-3 | |
| RT-PCR & qRT-PCR | |||
| Agarose | Sigma | 9012-36-6 | |
| Alcohol | Guangzhou Chemistry | 64-17-5 | |
| Chloroform | Guangzhou Chemistry | 865-49-6 | |
| Ethidium Bromide | Sangon Biotech | 214-984-6 | |
| Isopropyl Alcohol | Guangzhou Chemistry | 67-63-0 | |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix | Roche | 488735200H | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | TOYOBO | – | |
| Taq DNA Polymerase | TAKARA | R10T1 | |
| Goldview (nucleic acid stain) | BioSharp | BS357A | |
| TRIzol | Magen | R4801-02 | |
| Vector Construction & Cell Transfection | |||
| Agar | OXID | – | |
| Ampicillin | Sigma | 69-52-3 | |
| Chloramphenicol | Sigma | 56-75-7 | |
| Endotoxin-free Plasmid Extraction Kit | Thermo | A36227 | |
| Kanamycin | Sigma | 25389-94-0 | |
| Lipo3000 Plasmid Transfection Kit | Thermo | L3000015 | |
| LR Reaction Kit | Thermo | 11791019 | |
| Plasmid Extraction Kit | TIANGEN | DP103 | |
| Trans5α Chemically Competent Cell | TRANSGEN | CD201-01 | |
| Trytone | OXID | – | |
| Yeast Extract | OXID | – | |
| Primers and Sequence | Company | ||
| Primer: AQP5 Sequence: F: CATGAACCCAGCCCGATCTT R: CTTCTGCTCCCATCCCATCC |
Synbio Tech | ||
| Primer: β-actin Sequence: F: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT R: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT |
Synbio Tech | ||
| Primer: Epcam Sequence: F: CATTTGCTCCAAACTGGCGT R: TGTCCTTGTCGGTTCTTCGG |
Synbio Tech | ||
| Primer: Krt5 Sequence: F: AGCAATGGCGTTCTGGAGG R: GCTGAAGGTCAGGTAGAGCC |
Synbio Tech | ||
| Primer: Krt14 Sequence: F: CGGACCAAGTTTGAGACGGA R: GCCACCTCCTCGTGGTTC |
Synbio Tech | ||
| Primer: Krt19 Sequence: F: TCTTTGAAAAACACTGAACCCTG R: TGGCTCCTCAGGGCAGTAAT |
Synbio Tech | ||
| Primer: Ltf Sequence: F: CACATGCTGTCGTATCCCGA R: CGATGCCCTGATGGACGA |
Synbio Tech | ||
| Primer: Nestin Sequence: F: GGGGCTACAGGAGTGGAAAC R: GACCTCTAGGGTTCCCGTCT |
Synbio Tech | ||
| Primer: P63 Sequence: F: TCCTATCACGGGAAGGCAGA R: GTACCATCGCCGTTCTTTGC |
Synbio Tech | ||
| Vector | |||
| pLX302 lentivirus no-load vector | Addgene | ||
| pENRTY-mCherry | Xiaofeng Qin laboratory, Sun Yat-sen University |
Riferimenti
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