조절된 세포 배양 배지에서 세포외 소포를 분리하기 위한 크기 배제 크로마토그래피
Summary
여기서 프로토콜은 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 세포외 소포가 컨디셔닝 세포 배양 배지로부터 적절하게 분리될 수 있음을 보여줍니다.
Abstract
세포외 소포(EV)는 모든 세포에서 방출되고 모든 생체 유체에 존재하며 단백질, 핵산 및 이들이 유래한 모 세포를 반사하는 지질을 포함하는 나노 크기의 지질막 결합 구조입니다. 샘플의 다른 구성 요소에서 EV를 적절하게 분리하면 관련 화물의 특성을 분석할 수 있으며 수많은 질병에 대한 세포 간 통신기 및 비침습적 바이오마커로서의 잠재력에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 현재 연구에서 희소돌기아교세포 유래 EV는 다른 세포외 단백질 및 단백질 복합체에서 EV를 분리하기 위해 한외여과 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 포함한 최첨단 기술의 조합을 사용하여 세포 배양 배지에서 분리되었습니다. 시판되는 SEC 컬럼을 사용하여, EV는 대조군 및 소포체(ER) 스트레스 조건 모두에서 인간 희소돌기아교종 세포로부터 방출된 세포외 단백질로부터 분리되었다. 표준 EV 마커 CD9, CD63 및 CD81은 분획 1-4에서 관찰되었지만 분획 5-8에서는 관찰되지 않았습니다. 골지체의 단백질인 GM130과 ER의 필수 단백질인 칼넥신을 음성 EV 마커로 사용하였으며, 어떤 분획에서도 관찰되지 않았다. 또한, 분획 1-4를 EV 분획으로, 분획 5-8을 단백질 분획으로 풀링하여 농축하였을 때, EV 분획물에서 CD63, CD81, 및 CD9의 발현이 관찰되었다. GM130 또는 칼넥신의 발현은 분획 유형 중 어느 것에서도 관찰되지 않았다. 대조군 및 ER 스트레스 조건 모두에서 풀링된 분획을 투과 전자 현미경으로 시각화하고 소포는 EV 분획에서 관찰되었지만 단백질 분획에서는 관찰되지 않았습니다. 두 조건의 EV 및 단백질 분획의 입자도 나노입자 추적 분석으로 정량화하였다. 이러한 데이터는 SEC가 컨디셔닝 된 세포 배양 배지에서 EV를 분리하는 효과적인 방법임을 보여줍니다.
Introduction
세포외 소포(EV) 연구에 대한 관심의 폭발은 이러한 나노 크기의 이질적인 입자를 분리하고 연구하는 데 사용되는 기술과 기술의 주요 발전을 동반했습니다. 거의 40년 전에 발견된 이후1,2, 이 작은 막 구조는 생리활성 지질, 핵산 및 단백질을 포함하고 세포간 통신에서 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌습니다3,4. EV는 모든 세포 유형에서 방출되므로 혈장과 혈청, 타액 및 소변을 포함한 모든 생물학적 체액에 존재합니다. 이러한 유체 내의 EV는 신경 염증 및 신경 퇴행성 질환, 암 및자가 면역 질환 5,6,7을 포함한 다양한 질병에 대한 비 침습적 바이오 마커 역할을 할 큰 가능성을 가지고 있습니다. 또한, 배양액(3,8,9)으로 방출된 EV를 분리하여 세포 배양 기술을 통해 체외 기계론적 연구를 수행할 수 있다.
질병 병태생리학에서 EV의 역할을 이해하려면 EV가 발견되는 유체에서 적절한 분리가 가장 중요합니다. EV 분리의 황금 표준은 오랫동안 차동 초원심분리(dUC)10였지만 다른 세포 외 구성 요소에서 EV를 더 잘 분리하기 위해 보다 정교한 기술이 등장했습니다. 이러한 기술 중 일부에는 밀도 구배, 비대칭 유동 계장 유동 분획(A4F), 유세포분석, 면역포획, 폴리에틸렌 글리콜 침전 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC)11,12,13이 포함됩니다. 각 기술에는 고유 한 장점과 단점이 있습니다. 그러나, SEC는 특히 EV를 생물학적 유체 및 세포 배양 상청액 둘 다로부터 매우 효과적으로 분리하는 것으로 나타났다 8,14,15. SEC는 또한 비교적 간단하고 사용자 친화적이라는 추가 보너스를 가지고 있습니다.
SEC는 크기에 따라 유체의 구성 요소를 분리하는 방법입니다. 이 기술을 사용하면 수지 컬럼 (자체 제작 또는 상업적으로 구매)을 사용하여 샘플을 분획합니다. 샘플의 작은 입자는 수지 내의 비드 사이에 갇히는 반면, 큰 입자는 수지를 더 자유롭게 통과할 수 있으므로 공정 초기에 용리됩니다. EV는 많은 세포외 단백질 및 단백질 응집체보다 크기가 크기 때문에 EV는 컬럼을 더 빨리 통과하고 세포외 단백질보다 초기 분획에서 용리됩니다14.
이 방법 논문에서는 제어 및 소포체(ER) 스트레스 조건 모두에서 인간 희소돌기아교세포로부터 세포 배양 배지(CCM)로부터 EV를 분리하기 위한 SEC의 사용에 대해 설명합니다. 이 프로토콜을 사용하면 이 기술로 분리된 EV가 함께 풀링되고 다운스트림 특성화를 위해 농축될 수 있는 특정 분획 내에서 발견되며, 분리된 EV는 CCM을 보충하는 데 사용되는 태아 소 혈청(FBS)과 같은 외인성 공급원이 아닌 세포에서 파생되는 것으로 나타났습니다. EV 분획에서 표준 EV 마커 CD63, CD81 및 CD9 16,17,18,19의 존재와 단백질 분획에서의 이들의 부재는 웨스턴 블로팅으로 입증된다. 투과 전자 현미경(TEM)을 사용하여 EV를 시각화하고 예상 형태를 표시하며 EV 분획에서만 관찰됩니다. 입자는 또한 대조군 및 ER 스트레스 조건 모두에서 EV 및 단백질 분획에서 계수되며, EV 샘플에서 직경 50-200nm의 예상 크기 범위 내의 많은 수의 입자가 관찰됩니다. 이러한 데이터는 SEC가 세포 배양 배지에서 EV를 분리하는 효율적이고 효과적인 방법이라는 개념을 뒷받침합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
SEC는 컨디셔닝 CCM에서 EV를 적절하게 분리하기 위한 사용자 친화적인 방법입니다. 세포 유래 EV를 특이적으로 분리하기 위해서는 CCM의 유형과 보충제를 신중하게 고려해야 합니다. 많은 세포 배양 배지에는 혈청을 수확한 동물에서 추출한 EV가 포함된 FBS가 보충되어야 합니다. 이들 혈청 EV는 배양물(26)에서 세포로부터 유래된 EV에 의해 생성된 임의의 신호를 포화시키고 마스킹할…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 Penn State Behrend와 Hamot Health Foundation의 자금 지원과 펜실베이니아 주 유니버시티 파크에있는 Penn State Microscopy Facility에 감사드립니다.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | VWR | 97064-588 | |
| 4X Laemmli Sample Buffer | BioRad | 1610747 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit, Ultracel, 3 KDa, 15mL | Sigma-Aldrich | UFC900308 | 3 kDa cutoff |
| Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-3 membrane | Sigma-Aldrich | UFC200324 | 3 kDa cutoff |
| Ammonium Persulfate | Sigma-Aldrich | A3678-100G | |
| Anti rabbit IgG, HRP linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074V | 1:1000 Dilution |
| Anti-Calnexin antibody | Abcam | ab22595 | 1:500 Dilution |
| Anti-CD9 Mouse Monoclonal Antibody | BioLegend | 312102 | 1:500 Dilution |
| Anti-GM130 antibody [EP892Y] – cis-Golgi Marker | Abcam | ab52649 | 1:500 Dilution |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7076V | 1:1000 Dilution |
| Automatic Fraction Collector | Izon Science | ||
| BCA assay Kit | Bio-Rad | ||
| CCD camera | Gatan Orius SC200 | ||
| Cd63 Mouse anti Human | BD | 556019 | 1:1000 Dilution |
| CD81 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-23962 | 1:1000 Dilution |
| Cellstar Filter Cap Cell Culture Flasks | Greiner Bio-One | 660175 | |
| ChemiDoc MP Imager | BioRad | ||
| Clarity Western ECL Substrate | BioRad | 1705061 | |
| deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750-10G | |
| dithiothreitol | Sigma | 3483-12-3 | |
| DMEM/High glucose with L-glutamine; without sodium | Cytiva | SH300022.FS | |
| Fetal Bovine Serum Premium grade | VWR | 97068-085 | |
| Fetal Bovine Serum, exosome-depleted | Thermo Scientific | A2720801 | |
| Glycine | BioRad | 1610718 | |
| Great Value Nonfat Dry Milk | Amazon | B076NRD2TZ | |
| HOG Human Oligodendroglioma Cell Line | Sigma-Aldrich | SCC163 | |
| Izon Science Usa Ltd qev Size Exclusion Columns 5pk | Izon Science | ||
| Methanol >99.8% ACS | VWR | BDH1135-4LP | |
| Mini-PROTEAN Glass plates | BioRad | 1653310 | with 0.75mm spacers |
| Mini-PROTEAN Short plates | BioRad | 1653308 | |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | 492016 | |
| Penicillin-Streptomycin,Solution | Sigma-Aldrich | P4458-100mL | |
| Phosphate Buffered Saline PBS | Fisher Scientific | BP66150 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kits and Reagents | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Pierce PVDF Transfer Membranes | Thermo Scientific | 88518 | |
| Pierce Western Blotting Filter Paper | Thermo Scientific | 84783 | |
| Polyoxyethylene-20 (TWEEN 20), 500mL | Bio Basic | TB0560 | |
| Protease/phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Cell Signaling Technology | 5872S | |
| Recombinant Anti-TSG101 antibody [EPR7130(B)] | ABCam | ab125011 | 1:1000 dilution |
| Slodium hydroxide | Sigma-Aldrich | SX0603 | |
| Sodium azide | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888-500G | |
| Sodium dodecyl sulfate,≥99.0% (GC), dust-free pellets | Sigma-Aldrich | 75746-1KG | |
| Tetramethylethylenediamine | Sigma-Aldrich | T9281-25ML | |
| TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 10% | BioRad | 1610183 | |
| Transmission Electron Microscope | FEI Tecnai 12 Biotwin | ||
| Tris | BioRad | 1610716 | |
| Trypsin 0.25% protease with porcine trypsin, HBSS, EDTA; without calcium, magnesium | Cytiva | SH30042.01 | |
| Tunicamycin | Tocris | 3516 | |
| Zeta View software | Analytik | NTA software |
Riferimenti
- Pan, B. T., Teng, K., Wu, C., Adam, M., Johnstone, R. M. Electron microscopic evidence for externalization of the transferrin receptor in vesicular form in sheep reticulocytes. The Journal of Cell Biology. 101 (3), 942-948 (1985).
- Harding, C., Heuser, J., Stahl, P. Receptor-mediated endocytosis of transferrin and recycling of the transferrin receptor in rat reticulocytes. The Journal of Cell Biology. 97 (2), 329-339 (1983).
- Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nature Cell Biology. 9 (6), 654-659 (2007).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Rontogianni, S., et al. Proteomic profiling of extracellular vesicles allows for human breast cancer subtyping. Communications Biology. 2 (1), 1-13 (2019).
- Lane, R. E., Korbie, D., Hill, M. M., Trau, M. Extracellular vesicles as circulating cancer biomarkers: opportunities and challenges. Clinical and Translational Medicine. 7 (1), 14 (2018).
- Thompson, A. G., et al. Extracellular vesicles in neurodegenerative disease-pathogenesis to biomarkers. Nature Reviews Neurology. 12 (6), 346-357 (2016).
- O’Brien, K., Ughetto, S., Mahjoum, S., Nair, A. V., Breakefield, X. O. Uptake, functionality, and re-release of extracellular vesicle-encapsulated cargo. Cell Reports. 39 (2), 110651 (2022).
- Joshi, B. S., de Beer, M. A., Giepmans, B. N. G., Zuhorn, I. S. Endocytosis of extracellular vesicles and release of their cargo from endosomes. ACS Nano. 14 (4), 4444-4455 (2020).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. 30 (1), 3-22 (2006).
- Willms, E., Cabañas, C., Mäger, I., Wood, M. J. A., Vader, P. Extracellular vesicle heterogeneity: Subpopulations, isolation techniques, and diverse functions in cancer progression. Frontiers in Immunology. 9, 738 (2018).
- Tzaridis, T., et al. Extracellular vesicle separation techniques impact results from human blood samples: Considerations for diagnostic applications. International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9211 (2021).
- Liangsupree, T., Multia, E., Riekkola, M. L. Modern isolation and separation techniques for extracellular vesicles. Journal of Chromatography A. 1636, 461773 (2021).
- Gámez-Valero, A., et al. Size-exclusion chromatography-based isolation minimally alters extracellular vesicles’ characteristics compared to precipitating agents. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
- Mol, E. A., Goumans, M. J., Doevendans, P. A., Sluijter, J. P. G., Vader, P. Higher functionality of extracellular vesicles isolated using size-exclusion chromatography compared to ultracentrifugation. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 13 (6), 2061-2065 (2017).
- Campos-Silva, C., et al. High sensitivity detection of extracellular vesicles immune-captured from urine by conventional flow cytometry. Scientific Reports. 9 (1), 2042 (2019).
- Norman, M., et al. L1CAM is not associated with extracellular vesicles in human cerebrospinal fluid or plasma. Nature methods. 18 (6), 631-634 (2021).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Mathieu, M., et al. Specificities of exosome versus small ectosome secretion revealed by live intracellular tracking of CD63 and CD9. Nature Communications. 12 (1), 1-18 (2021).
- Guo, J., et al. Establishment of a simplified dichotomic size-exclusion chromatography for isolating extracellular vesicles toward clinical applications. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (11), 12145 (2021).
- Benedikter, B. J., et al. Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2359 (2010).
- Grassucci, R. A., Taylor, D. J., Frank, J. Preparation of macromolecular complexes for cryo-electron microscopy. Nature Protocols. 2 (12), 3239 (2007).
- Williams, R. L., Urbé, S. The emerging shape of the ESCRT machinery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (5), 355-368 (2007).
- Willms, E., et al. Cells release subpopulations of exosomes with distinct molecular and biological properties. Scientific Reports. 6 (1), 1-12 (2016).
- Lehrich, B. M., Liang, Y., Fiandaca, M. S. Foetal bovine serum influence on in vitro extracellular vesicle analyses. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12061 (2021).
- Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1422674 (2018).
- Böing, A. N., et al. Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).
- Zhang, X., Borg, E. G. F., Liaci, A. M., Vos, H. R., Stoorvogel, W. A novel three step protocol to isolate extracellular vesicles from plasma or cell culture medium with both high yield and purity. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1791450 (2020).
- Guerreiro, E. M., et al. Efficient extracellular vesicle isolation by combining cell media modifications, ultrafiltration, and size-exclusion chromatography. PLoS ONE. 13 (9), 02024276 (2018).
- Onódi, Z., et al. Isolation of high-purity extracellular vesicles by the combination of iodixanol density gradient ultracentrifugation and bind-elute chromatography from blood plasma. Frontiers in Physiology. 9, 1479 (2018).
- Yuana, Y., Levels, J., Grootemaat, A., Sturk, A., Nieuwland, R. Co-isolation of extracellular vesicles and high-density lipoproteins using density gradient ultracentrifugation. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).
