Infrapatellaire vetkussen mesenchymale stamcellen (IFP-MSC’s) kunnen gemakkelijk worden geïsoleerd uit de infrapatellaire vetschijf van het kniegewricht. Ze vermenigvuldigen zich goed in vitro, vormen CFU-F-kolonies en differentiëren in adipogene, chondrogene en osteogene afstammingslijnen. Hierin wordt de methodologie gegeven voor de isolatie, uitbreiding en differentiatie van IFP-MSC’s van geitenstikselgewricht.
De IFP, aanwezig in het kniegewricht, dient als een veelbelovende bron van MSC’s. De IFP is een gemakkelijk toegankelijk weefsel omdat het routinematig wordt gereseceerd en weggegooid tijdens artroscopische procedures en knievervangende operaties. Bovendien wordt de verwijdering ervan geassocieerd met minimale morbiditeit op de donorplaats. Recente studies hebben aangetoond dat IFP-MSC’s hun proliferatiecapaciteit niet verliezen tijdens in vitro expansie en een leeftijdsonafhankelijk osteogene differentiatiepotentieel hebben. IFP-MSC’s bezitten een superieur chondrogene differentiatiepotentieel in vergelijking met van beenmerg afgeleide MSC’s (BMSCs) en van vetweefsel afgeleide stamcellen (ADSC’s). Hoewel deze cellen gemakkelijk te verkrijgen zijn bij oudere en zieke patiënten, is hun effectiviteit beperkt. Daarom is het gebruik van IFP-MSC’s van gezonde donoren belangrijk om hun werkzaamheid in biomedische toepassingen te bepalen. Omdat de toegang tot een gezonde menselijke donor een uitdaging is, kunnen diermodellen een beter alternatief zijn om fundamenteel begrip mogelijk te maken. Grote dieren zoals honden, paarden, schapen en geiten spelen een cruciale rol in translationeel onderzoek. Onder deze zou de geit een voorkeursmodel kunnen zijn, omdat het verstikkingsgewricht van de geit de dichtstbijzijnde anatomie heeft bij het menselijke kniegewricht. Bovendien kan goat-IFP voldoen aan de hogere MSC-aantallen die nodig zijn voor weefselregeneratietoepassingen. Bovendien maken lage kosten, beschikbaarheid en naleving van de 3R-principes voor dieronderzoek ze een aantrekkelijk model. Deze studie toont een eenvoudig protocol voor het isoleren van IFP-MSC’s van het verstikkingsgewricht van geiten en in vitro kweekomstandigheden voor hun expansie en differentiatie. De aseptisch geïsoleerde IFP van de geit werd gewassen, gehakt en enzymatisch verteerd. Na filtratie en centrifugatie werden de verzamelde cellen gekweekt. Deze cellen waren adherent, hadden MSC-achtige morfologie en vertoonden een opmerkelijk clonogene capaciteit. Verder onderscheidden ze in adipogene, chondrogene en osteogene afstammingslijnen, wat hun multipotentie aantoonde. Concluderend toont de studie de isolatie en uitbreiding van MSC’s, die potentieel tonen in weefseltechnologie en regeneratieve geneeskundetoepassingen.
Mesenchymale stamcellen (MSC’s) zijn een aantrekkelijke kandidaat voor celgebaseerde therapieën in de regeneratieve geneeskunde 1,2. Ze kunnen worden geoogst uit verschillende weefselbronnen zoals beenmerg, navelstreng, placenta, tandpulp en onderhuids vetweefsel3. Aangezien de beschikbaarheid van stamcellen bij volwassenen echter beperkt is en hun isolatieprocedure vaak invasief is (wat resulteert in morbiditeit op de donorplaats), is het wenselijk om een alternatieve stamcelbron te hebben die deze uitdagingen kan omzeilen.
Het kniegewricht is een depot van verschillende celtypen, zoals infrapatellaire vetkussen-afgeleide MSC’s, synoviale membraan-afgeleide MSC’s, synoviale vloeistof-afgeleide MSC’s, ligament fibroblasten, gewrichts chondrocyten, enz. 4,5,6. Deze cellen hebben het potentieel om op grote schaal te worden onderzocht in musculoskeletale weefseltechnologie-gebaseerd onderzoek. Daarom zou het kniegewricht een mogelijke en betrouwbare bron kunnen zijn van meerdere soorten MSC’s. Vetdepot in het kniegewricht, bekend als de infrapatellar fat pad (IFP) of Hoffa’s fat pad, is een veelbelovende en alternatieve keuze van MSC depot. De IFP is een relatief gemakkelijk toegankelijke en klinisch haalbare bron van MSC’s, omdat het routinematig wordt gereseceerd en weggegooid als chirurgisch afval tijdens knieartroscopie of open kniechirurgie. Verwijdering van de IFP wordt geassocieerd met minimale morbiditeit op de donorplaats, waardoor het ook een aantrekkelijke weefselbron is. Hoewel ze een vergelijkbaar fenotypisch profiel hebben, hebben MSC’s van IFP (IFP-MSC’s) een verbeterd clonogene potentieel in vergelijking met van beenmerg afgeleide mesenchymale stamcellen (BM-MSC’s)6 en een betere proliferatieve capaciteit in vergelijking met subcutane adipose-afgeleide stamcellen (ADSC’s)7. Interessant is dat in vergelijking met synoviale vloeistof-afgeleide MSC’s (SF-MSC’s), IFP-MSC’s hun proliferatieve capaciteit niet verliezen bij late passages, noch neemt de verdubbelingstijd toe bij late passages. Dit suggereert dat IFP-MSC’s tijdens celexpansie een voldoende groot aantal cellen kunnen bereiken voor in vitro weefselmanipulatietoepassingen zonder hun proliferatiesnelheid in gevaar te brengen8. Recente studies hebben ook gesuggereerd dat IFP-MSC’s een superieur chondrogene differentiatiepotentieel bezitten in vergelijking met van beenmerg afgeleide MSC’s (BMSCs) en van vetweefsel afgeleide MSC’s (ADSC’s), waarschijnlijk vanwege hun anatomische nabijheid tot gewrichtskraakbeen, wat wijst op hun geschiktheid voor kraakbeenweefseltechnologie 6,7,9,10. Bovendien bezitten ze ook leeftijdsonafhankelijk osteogene differentiatiepotentiaal11. Intra-articulaire injectie van IFP-MSC’s heeft aangetoond dat het pijn vermindert en de functies van het kniegewricht verbetert bij patiënten met artrose (OA)12,13. Verder zijn sterke immunosuppressieve reacties en verbeterde immunomodulerende eigenschappen van IFP-MSC’s in aanwezigheid van inflammatoire cytokines tijdens pathologische aandoeningen ook gemeld6.
IFP-MSC’s zijn een veelbelovende en alternatieve bron van MSC’s; hun therapeutische voordeel in tissue engineering en regeneratieve geneeskunde wordt echter relatief minder onderzocht. De bestaande studies over IFP-MSC’s hebben voornamelijk gebruik gemaakt van cellen van menselijke donoren. Onder deze, een paar recente studies hebben IFP-MSC’s van gezonde menselijke donoren (niet-artritis patiënten, leeftijd 17-60 jaar)6,14 onderzocht, terwijl de meeste studies IFP-MSC’s hebben gebruikt van oudere patiënten die een totale knievervangende operatie ondergaan (zieke patiënten, leeftijd 70-80 jaar). Aangezien bekend is dat zowel leeftijd als ziekte de normale werking van stamcellen veranderen (verminderd aantal en verlies van functioneel potentieel), kan dit mogelijk leiden tot inconsistenties in de uitkomst van de op MSC gebaseerde studies 7,15,16,17. Daarnaast vormt het gebruik van IFP-MSC’s van patiënten met pathofysiologische aandoeningen (bijv. artritis en obesitas) ook problemen om de basiskenmerken van gezonde cellen in vitro te begrijpen, waardoor het een beperkende factor is bij de ontwikkeling van op MSC’s gebaseerde therapieën. Om deze problemen op te lossen, is het gebruik van IFP-MSC’s van gezonde donoren van vitaal belang. Omdat de toegang tot een gezonde menselijke donor een uitdaging is, kunnen diermodellen een beter alternatief zijn. In dit opzicht zijn er een paar studies waarbij IFP is geïsoleerd uit muizen18. Vanwege de kleine omvang van het vetkussen bij normale muizen, zijn vetweefsels van meerdere dieren echter gecombineerd om voldoende weefsel te krijgen om uitgebreide experimentele procedures uit te voeren19. Daarom is er behoefte aan een groot diermodel, dat zou kunnen voldoen aan de eis voor het hogere aantal cellen en tegelijkertijd zou kunnen voldoen aan de 3R-principes (verfijnen, vervangen en verminderen) in dieronderzoek20. Het gebruik van grote dieren heeft belangrijke implicaties in translationeel onderzoek. Specifiek, in musculoskeletale weefseltechnologie, is een reeks grote dieren zoals honden, varkens, schapen, geiten en paarden onderzocht21. Geit (Capra aegagrus hircus) is een uitstekende keuze van grote dieren omdat het verstikkingsgewricht de dichtstbijzijnde anatomie heeft bij het menselijke kniegewricht 22,23,24. De subchondrale bottrabeculaire structuur en subchondrale botdikte van geiten zijn vergelijkbaar met mensen, en het aandeel van het kraakbeen tot bot is ook gemeld dat het dicht bij de mensligt 21. Bovendien zijn geiten over de hele wereld op grote schaal gedomesticeerd, waardoor ze gemakkelijk beschikbaar zijn als ze skeletachtig volwassen zijn. Verder hebben lage onderhoudskosten en eenvoudige bediening ze tot een aantrekkelijk diermodel voor onderzoek gemaakt22.
In deze studie wordt een eenvoudig protocol voor de isolatie van IFP-MSC’s uit het verstikkingsgewricht van Capra aegagrus hircus (geit) en in vitro kweekomstandigheden voor hun expansie en differentiatie aangetoond. De geïsoleerde cellen zijn adherent, hebben MSC-achtige morfologie, vormen CFU-F (kolonievormende eenheid-fibroblast) kolonies en bezitten adipogene, chondrogene en osteogene differentiatiepotentialen. Daarom tonen IFP-MSC’s potentieel als een alternatieve bron van MSC’s voor biomedische toepassingen.
In dit protocol is een eenvoudige, betrouwbare en reproduceerbare methode voor de isolatie van MSC’s van geiten-IFP opgenomen. Cellen geïsoleerd met behulp van deze methode zijn met succes gebruikt in onze eerdere studies voor in vitro weefselregeneratie. Er werd waargenomen dat de geïsoleerde cellen proliferatief waren, reageerden op verschillende groeifactoren en hun biologische activiteit behielden wanneer ze werden gezaaid op elektrospunvezels en steigers25,26<sup class="…
The authors have nothing to disclose.
SH erkent de steun van de Institute Post-Doctoral Fellowship van IIT Kanpur en SYST-subsidie van DST (SEED Division) (SP / YO / 618/ 2018). AM erkent het Indian Institute of Technology-Kanpur (IIT-Kanpur) voor een Instituut fellowship. DSK erkent Gireesh Jankinath Chair Professorship en Department of Biotechnology, India, voor financiering (BT / PR22445 / MED / 32/571/2016). AM, SH en DSK bedanken het Mehta Family Centre for Engineering in Medicine bij IIT-Kanpur voor hun genereuze steun.
β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422-10G | 10 mM |
0.25% Trypsin- 0.02% EDTA | Hi-Media | TCL049 | |
15-mL centrifuge tube | Corning | ||
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt | Sigma | 49752-10G | 50 µg/mL |
2-Propanol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | HiMedia | TCL021-50ml | 10 mM |
50-mL centrifuge tube | Corning | ||
Alcian Blue | Hi-Media | RM471 | For sufated gycosaminoglycans staining |
Alizarin Red S | S D Fine-Chem Limited | 26048-25G | For calcium deposition |
Amphotericin B | HiMedia | A011 | 2.5 µg/mL |
Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Sino Biologicals | 10014-HNAE | 5 ng/mL |
BCIP/NBT ALP Substrate | Sigma | B5655-5TAB | For ALP staining |
Biological safety cabinet | |||
BSA | HiMedia | MB-083 | Long name: Bovine Serum Albumin (1.25 mg/mL ) |
Cell strainer | HiMedia | TCP-182 | 70 µm |
Centrifuge | REMI | ||
Ciprofloxacin | RANBAXY LAB. Limited | B17407T1 | 2.5 µg/mL |
Crystal Violet | S D Fine-Chem Limited | 42555 | |
D(+)-glucose | Merck | 1.94925.0521 | 25 mM |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D2915 | 1 µM |
DMEM LG | SIGMA | D5523 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagle’s Media Low Glucose |
Ethanol | Merck | 100983 | |
FBS | Gibco | 10270 | Long name: Fetal Bovine Serum |
Formaldehyde solution 37%-41% | Merck | 61780805001730 | |
Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | 100 µM |
Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | 10 µg/mL |
Inverted microscope | Nikon Eclipse TS 100 | ||
ITS + 1 | Sigma-Aldrich | I2521-5mL | Long name: insulin, transferrin, sodium selenite + linoleic-BSA |
L-Proline | HiMedia | TO-109-25G | 1 mM |
Magnesium chloride | Merck | 61751605001730 | For lysis buffer |
Methanol | Meck | 1.07018.2521 | |
Micropipettes and sterile tips (20 µL, 200 µL, 1000 µL) | Thermoscientific | ||
MUSE Cell analyser | Merck Millipore | For cell counting | |
OCT compound | Tissue-Tek | 4583 | Long name: Optimal Cutting Temperature |
Oil Red O dye | S D Fine-Chem Limited | 54304 | For lipid vacuole staining |
Penicillin-Streptomycin | HiMedia | A007 | 100 U/mL |
Petri dishes (150 mm and 90 mm) | NEST | ||
Safranin O | S D Fine-Chem Limited | 50240 | For sufated gycosaminoglycans staining |
Sodium citrate | Sigma-Aldrich | C3434 | 3.4 % (w/v) |
Sterile scissors, forceps and scalpels | For isolation of IFP-MSC | ||
Sucrose | Merck | 1.94953.0521 | 35 % (w/v) |
TGF-β1 | Sino Biologicals | Long name: Transforming growth factor- β1 (10 ng/mL) | |
Tissue culture incubator 37 °C, 5% CO2 | Thermoscientific | ||
Tris buffer | Merck | 61771405001730 | For lysis buffer |
Triton X100 | S D Fine-Chem Limited | 40632 | For lysis buffer |
Type II collagenase | Gibco | 17101015 | 1.5 mg/mL |
Vitamin D3 | Sigma | C9756-1G | 10 nM |
Well plates (6 -WP and 24-WP) | NEST |