Infrapatellar fedtpude mesenkymale stamceller (IFP-MSC’er) kan let isoleres fra knæleddets infrapatellære fedtpude. De formerer sig godt in vitro, danner CFU-F-kolonier og differentierer sig til adipogene, kondrogene og osteogene slægter. Heri gives metoden til isolering, udvidelse og differentiering af IFP-MSC’er fra gedekvælningsled.
IFP, der findes i knæleddet, fungerer som en lovende kilde til MSC’er. IFP er et let tilgængeligt væv, da det rutinemæssigt resekteres og kasseres under artroskopiske procedurer og knæudskiftningsoperationer. Derudover er dens fjernelse forbundet med minimal morbiditet på donorstedet. Nylige undersøgelser har vist, at IFP-MSC’er ikke mister deres spredningskapacitet under in vitro-ekspansion og har aldersuafhængigt osteogent differentieringspotentiale. IFP-MSC’er har overlegen kondrogen differentieringspotentiale sammenlignet med knoglemarvsafledte MSC’er (BMSC’er) og fedtafledte stamceller (ADSC’er). Selvom disse celler let kan fås fra ældre og syge patienter, er deres effektivitet begrænset. Derfor er det vigtigt at bruge IFP-MSC’er fra raske donorer for at bestemme deres effektivitet i biomedicinske applikationer. Da adgang til en sund menneskelig donor er udfordrende, kan dyremodeller være et bedre alternativ til at muliggøre grundlæggende forståelse. Store dyr som hunde, heste, får og geder spiller en afgørende rolle i translationel forskning. Blandt disse kunne geden være en foretrukken model, da gedens kvæleled har den nærmeste anatomi til det menneskelige knæled. Desuden kan gede-IFP opfylde de højere MSC-numre, der er nødvendige for vævsregenereringsapplikationer. Desuden gør lave omkostninger, tilgængelighed og overholdelse af 3R-principperne for dyreforsøg dem til en attraktiv model. Denne undersøgelse demonstrerer en simpel protokol til isolering af IFP-MSC’er fra gedens kvæleled og in vitro-kulturbetingelser for deres ekspansion og differentiering. Den aseptisk isolerede IFP fra geden blev vasket, hakket og fordøjet enzymatisk. Efter filtrering og centrifugering blev de opsamlede celler dyrket. Disse celler var klæbende, havde MSC’er-lignende morfologi og viste bemærkelsesværdig klonogen evne. Endvidere differentierede de sig i adipogene, kondrogene og osteogene slægter, hvilket demonstrerede deres multipotens. Afslutningsvis viser undersøgelsen isolering og udvidelse af MSC’er, som viser potentiale inden for vævsteknik og regenerativ medicin.
Mesenkymale stamceller (MSC’er) er en attraktiv kandidat til cellebaserede terapier inden for regenerativ medicin 1,2. De kan høstes fra en række vævskilder såsom knoglemarv, navlestreng, placenta, tandmasse og subkutant fedtvæv3. Da tilgængeligheden af stamceller hos voksne imidlertid er begrænset, og deres isolationsprocedure ofte er invasiv (hvilket resulterer i sygelighed på donorstedet), er det ønskeligt at have en alternativ stamcellekilde, der kan omgå disse udfordringer.
Knæleddet er et depot af forskellige celletyper, såsom infrapatellar fedtpudeafledte MSC’er, synoviale membranafledte MSC’er, synovialvæskeafledte MSC’er, ligamentfibroblaster, artikulære chondrocytter osv. 4,5,6. Disse celler har potentiale til at blive bredt udforsket i muskuloskeletale vævsteknologibaserede undersøgelser. Derfor kan knæleddet være en mulig og pålidelig kilde til flere typer MSC’er. Fedtdepot placeret i knæleddet, kendt som den infrapatellar fedtpude (IFP) eller Hoffas fedtpude, er et lovende og alternativt valg af MSC-depot. IFP er en relativt let tilgængelig og klinisk tilgængelig kilde til MSC’er, da den rutinemæssigt resekteres og kasseres som kirurgisk affald under knæartroskopi eller åben knæoperation. Fjernelse af IFP er forbundet med minimal morbiditet på donorstedet, hvilket også gør det til en attraktiv vævskilde. MSC’er fra IFP (IFP-MSC’er) har en lignende fænotypisk profil, men har forbedret klonogent potentiale sammenlignet med knoglemarvsafledte mesenkymale stamceller (BM-MSC’er)6 og bedre proliferativ kapacitet sammenlignet med subkutane fedtafledte stamceller (ADSC’er)7. Interessant nok mister IFP-MSC’er sammenlignet med synovialvæskeafledte MSC’er (SF-MSC’er) ikke deres proliferative kapacitet ved sene passager, og fordoblingstiden øges heller ikke ved sene passager. Dette tyder på, at IFP-MSC’er under celleekspansion kan opnå et tilstrækkeligt stort antal celler til in vitro-vævstekniske applikationer uden at gå på kompromis med deres spredningshastighed8. Nylige undersøgelser har også antydet, at IFP-MSC’er har overlegen kondrogen differentieringspotentiale sammenlignet med knoglemarvsafledte MSC’er (BMSC’er) og fedtafledte MSC’er (ADSC’er), sandsynligvis på grund af deres anatomiske nærhed til ledbrusk, hvilket indikerer deres egnethed til bruskvævsteknik 6,7,9,10. Desuden har de også aldersuafhængigt osteogent differentieringspotentiale11. Intraartikulær injektion af IFP-MSC’er har vist sig at reducere smerter og forbedre knæledsfunktioner hos patienter med slidgigt (OA)12,13. Endvidere er der også rapporteret stærke immunsuppressive reaktioner og forbedrede immunmodulerende egenskaber af IFP-MSC’er i nærvær af inflammatoriske cytokiner under patologiske tilstande6.
IFP-MSC’er er en lovende og alternativ kilde til MSC’er; Imidlertid er deres terapeutiske fordel inden for vævsteknik og regenerativ medicin relativt mindre udforsket. De eksisterende undersøgelser af IFP-MSC’er har hovedsageligt udnyttet celler fra menneskelige donorer. Blandt disse har nogle få nylige undersøgelser undersøgt IFP-MSC’er fra raske humane donorer (ikke-gigtpatienter, i alderen 17-60 år)6,14, mens de fleste af undersøgelserne har brugt IFP-MSC’er fra ældre patienter, der gennemgår total knæalloplastik (syge patienter, alder 70-80 år). Da både alder og sygdom vides at ændre stamcellernes normale funktion (reduceret antal og tab af funktionelt potentiale), kan dette potentielt føre til uoverensstemmelser i resultatet af de MSC-baserede studier 7,15,16,17. Derudover giver brugen af IFP-MSC’er fra patienter med patofysiologiske tilstande (f.eks. arthritis og fedme) også svært ved at forstå de grundlæggende egenskaber ved sunde celler in vitro og fungerer dermed som en begrænsende faktor i udviklingen af MSC-baserede terapier. For at overvinde disse problemer er brugen af IFP-MSC’er fra raske donorer afgørende. Da adgang til en sund menneskelig donor er udfordrende, kan dyremodeller være et bedre alternativ. I denne henseende er der et par undersøgelser, hvor IFP er blevet isoleret fra mus18. På grund af fedtpudens lille størrelse i normale mus er fedtvæv fra flere dyr imidlertid blevet kombineret for at få nok væv til at udføre detaljerede eksperimentelle procedurer19. Derfor er der behov for en stor dyremodel, der kan opfylde kravet om det højere antal celler og samtidig overholde 3R-principperne (forfine, erstatte og reducere) i dyreforsøg20. Brugen af store dyr har betydelige konsekvenser i translationel forskning. Specifikt inden for muskuloskeletal vævsteknik er en række store dyr som hunde, svin, får, geder og heste blevet undersøgt21. Geder (Capra aegagrus hircus) er et glimrende valg af store dyr, da dets kvæleled har den nærmeste anatomi til det menneskelige knæled22,23,24. Den subchondral knogletrabekulære struktur og subchondral knogletykkelse hos geder ligner mennesker, og andelen af brusk til knogle rapporteres også at være tæt på mennesker21. Derudover er geder blevet bredt tæmmet over hele verden, hvilket gør dem let tilgængelige, når de er skeletmodne. Desuden har lave vedligeholdelsesomkostninger og nem håndtering gjort dem til en attraktiv dyremodel til forskning22.
I denne undersøgelse demonstreres en simpel protokol til isolering af IFP-MSC’er fra kvæleleddet af Capra aegagrus hircus (ged) og in vitro-dyrkningsbetingelser for deres ekspansion og differentiering. De isolerede celler er klæbende, har MSC-lignende morfologi, danner CFU-F (kolonidannende enhedsfibroblast) kolonier og besidder adipogen, kondrogene og osteogene differentieringspotentialer. Derfor viser IFP-MSC’er potentiale som en alternativ kilde til MSC’er til biomedicinske applikationer.
I denne protokol er der tilvejebragt en enkel, pålidelig og reproducerbar metode til isolering af MSC’er fra ged IFP. Celler isoleret ved hjælp af denne metode er blevet anvendt med succes i vores tidligere undersøgelser til in vitro vævsregenerering. Det blev observeret, at de isolerede celler var proliferative, reagerede på forskellige vækstfaktorer og bevarede deres biologiske aktivitet, når de blev podet på elektrospundne fibre og stilladser25,26</…
The authors have nothing to disclose.
SH anerkender støtte fra Institute Post-Doctoral Fellowship of IIT Kanpur og SYST grant fra DST (SEED Division) (SP/YO/618/2018). AM anerkender Indian Institute of Technology-Kanpur (IIT-Kanpur) for et institutstipendium. DSK anerkender Gireesh Jankinath Chair Professorship og Institut for Bioteknologi, Indien, for finansiering (BT/PR22445/MED/32/571/2016). AM, SH og DSK takker The Mehta Family Center for Engineering in Medicine ved IIT-Kanpur for deres generøse støtte.
β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422-10G | 10 mM |
0.25% Trypsin- 0.02% EDTA | Hi-Media | TCL049 | |
15-mL centrifuge tube | Corning | ||
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt | Sigma | 49752-10G | 50 µg/mL |
2-Propanol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | HiMedia | TCL021-50ml | 10 mM |
50-mL centrifuge tube | Corning | ||
Alcian Blue | Hi-Media | RM471 | For sufated gycosaminoglycans staining |
Alizarin Red S | S D Fine-Chem Limited | 26048-25G | For calcium deposition |
Amphotericin B | HiMedia | A011 | 2.5 µg/mL |
Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Sino Biologicals | 10014-HNAE | 5 ng/mL |
BCIP/NBT ALP Substrate | Sigma | B5655-5TAB | For ALP staining |
Biological safety cabinet | |||
BSA | HiMedia | MB-083 | Long name: Bovine Serum Albumin (1.25 mg/mL ) |
Cell strainer | HiMedia | TCP-182 | 70 µm |
Centrifuge | REMI | ||
Ciprofloxacin | RANBAXY LAB. Limited | B17407T1 | 2.5 µg/mL |
Crystal Violet | S D Fine-Chem Limited | 42555 | |
D(+)-glucose | Merck | 1.94925.0521 | 25 mM |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D2915 | 1 µM |
DMEM LG | SIGMA | D5523 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagle’s Media Low Glucose |
Ethanol | Merck | 100983 | |
FBS | Gibco | 10270 | Long name: Fetal Bovine Serum |
Formaldehyde solution 37%-41% | Merck | 61780805001730 | |
Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | 100 µM |
Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | 10 µg/mL |
Inverted microscope | Nikon Eclipse TS 100 | ||
ITS + 1 | Sigma-Aldrich | I2521-5mL | Long name: insulin, transferrin, sodium selenite + linoleic-BSA |
L-Proline | HiMedia | TO-109-25G | 1 mM |
Magnesium chloride | Merck | 61751605001730 | For lysis buffer |
Methanol | Meck | 1.07018.2521 | |
Micropipettes and sterile tips (20 µL, 200 µL, 1000 µL) | Thermoscientific | ||
MUSE Cell analyser | Merck Millipore | For cell counting | |
OCT compound | Tissue-Tek | 4583 | Long name: Optimal Cutting Temperature |
Oil Red O dye | S D Fine-Chem Limited | 54304 | For lipid vacuole staining |
Penicillin-Streptomycin | HiMedia | A007 | 100 U/mL |
Petri dishes (150 mm and 90 mm) | NEST | ||
Safranin O | S D Fine-Chem Limited | 50240 | For sufated gycosaminoglycans staining |
Sodium citrate | Sigma-Aldrich | C3434 | 3.4 % (w/v) |
Sterile scissors, forceps and scalpels | For isolation of IFP-MSC | ||
Sucrose | Merck | 1.94953.0521 | 35 % (w/v) |
TGF-β1 | Sino Biologicals | Long name: Transforming growth factor- β1 (10 ng/mL) | |
Tissue culture incubator 37 °C, 5% CO2 | Thermoscientific | ||
Tris buffer | Merck | 61771405001730 | For lysis buffer |
Triton X100 | S D Fine-Chem Limited | 40632 | For lysis buffer |
Type II collagenase | Gibco | 17101015 | 1.5 mg/mL |
Vitamin D3 | Sigma | C9756-1G | 10 nM |
Well plates (6 -WP and 24-WP) | NEST |