Un modèle murin hétérotopique pour étudier la transplantation laryngée
Summary
Le but de ce manuscrit est de décrire les étapes microchirurgicales nécessaires pour réaliser une greffe de larynx hétérotopique chez la souris. Les avantages de ce modèle murin par rapport à d’autres modèles animaux de transplantation laryngée sont son rapport coût-efficacité et la disponibilité de tests et de données immunologiques.
Abstract
La transplantation hétérotopique laryngée, bien qu’il s’agisse d’une procédure techniquement difficile, offre plus d’analyses scientifiques et d’avantages en termes de coûts par rapport à d’autres modèles animaux. Bien que décrite pour la première fois par Shipchandler et al. en 2009, cette technique n’est pas largement utilisée, peut-être en raison des difficultés d’apprentissage de la technique microchirurgicale et du temps nécessaire pour la maîtriser. Cet article décrit en détail les étapes chirurgicales, ainsi que les pièges potentiels à éviter, afin d’encourager une utilisation efficace de cette technique.
Dans ce modèle, les artères carotides bilatérales du larynx donneur sont anastomosées à l’artère carotide receveuse et à la veine jugulaire externe, ce qui permet le flux sanguin à travers la greffe. Le flux sanguin peut être confirmé en peropératoire par la visualisation du remplissage sanguin dans les artères carotides bilatérales du greffon, la rougeur des glandes thyroïdes du greffon et le saignement des microvaisseaux dans le greffon. Les éléments cruciaux du succès comprennent la préservation délicate des vaisseaux du greffon, la fabrication d’artériotomie et de veinotomie de taille correcte et l’utilisation du nombre approprié de sutures sur les anastomoses artério-artérielles et artério-veineuses pour sécuriser les vaisseaux sans fuite et prévenir l’occlusion.
N’importe qui peut devenir compétent dans ce modèle avec une formation suffisante et effectuer la procédure en environ 3 heures. S’il est réalisé avec succès, ce modèle permet d’effectuer des études immunologiques facilement et à faible coût.
Introduction
Pour les patients souffrant de lésions irréparables du larynx ou d’un cancer du larynx, une laryngectomie totale est souvent la seule option1. La laryngectomie totale laisse les patients sans la capacité de respirer et de parler par eux-mêmes, en plus d’éprouver une détresse sociale et psychologique2. Les patients atteints d’un cancer du larynx qui ont besoin d’une laryngectomie totale sont d’excellents candidats potentiels pour la transplantation laryngée. Alors qu’une transplantation laryngée humaine dans le cadre de lésions laryngées irréparables a été effectuée, l’allotransplantation du larynx est actuellement évitée chez ces patients en raison de la crainte d’une récidive tumorale, de la possibilité d’un rejet chronique et d’infections dérivées du donneur3. L’immunosuppression est la principale cause de ces préoccupations. La perte dramatique du premier patient transplanté laryngé partiel en raison d’une récidive tumorale après un traitement immunosuppresseur conventionnel est la preuve qu’un schéma immunosuppresseur approprié doit être conçu avant que d’autres tentatives de transplantation ne soient faites chez les patients atteints d’un cancer du larynx 4,5.
Pour mieux comprendre la réponse immunitaire de l’hôte à un larynx transplanté, le premier modèle de greffe de larynx chez le rat a été développé en 1992 par Strome, et des améliorations ont été apportées à la technique chirurgicale en 2002 6,7. Bien que ce modèle soit efficace pour étudier la transplantation laryngée, le manque d’agents immunologiques spécifiques aux rats et le coût plus élevé associé aux modèles de rats ont conduit à la mise au point d’un nouveau modèle murin pour étudier la transplantation laryngée en 20098.
La principale application de la technique décrite est d’étudier différents schémas thérapeutiques immunosuppresseurs dans la transplantation laryngée. L’amélioration des traitements immunosuppresseurs actuels pourrait élargir le bassin de candidats et conduire à une transplantation sûre chez les patients atteints de cancer. Les avantages de ce modèle murin sont sa rentabilité et la grande disponibilité des données immunologiques et des réactifs.
Les équipes travaillant sur des schémas thérapeutiques immunosuppresseurs pour la transplantation laryngée peuvent utiliser cette méthode pour recueillir un grand volume de données immunologiques, et différents schémas thérapeutiques peuvent être rapidement testés et comparés. D’autres modalités de traitement potentielles pouvant moduler la réponse immunitaire à la greffe, telles que les injections de cellules souches, peuvent également être testées à l’aide de ce modèle. Enfin, des expériences peuvent être conçues pour observer les effets systémiques à long terme de la transplantation laryngée en prolongeant la période de suivi.
La technique décrite ici utilise des anastomoses de bout en bout pour fournir un flux artériel et veineux à une greffe de larynx hétérotopique. Le greffon est un complexe laryngotrachéo-œsophagien (LTE) comprenant le larynx, les glandes thyroïdes, les glandes parathyroïdes, la trachée et l’œsophage du donneur, avec des artères carotides bilatérales et des pédicules intacts. Une artère carotide du donneur est anastomosée à l’artère carotide receveuse et fournit le flux sanguin artériel, tandis que l’autre artère carotide du donneur est anastomosée à la veine jugulaire externe du receveur et fournit le flux sanguin veineux (Figure 1).
Plusieurs modifications ont été apportées à la technique chirurgicale du modèle de rat pour assurer le succès du modèle murin. Par exemple, un agent anesthésique inhalé a été utilisé à la place d’un agent injectable pour augmenter le contrôle de la profondeur de l’anesthésie et réduire les complications. La suture continue est utilisée dans l’anastomose artério-artérielle chez le rat; Cependant, en raison de la plus petite taille des vaisseaux de souris, cela est techniquement difficile et peut provoquer un rétrécissement de la lumière du vaisseau7. En conséquence, des sutures interrompues sont utilisées dans le modèle murin et améliorent la perméabilité des vaisseaux. De plus, dans le modèle du rat, le pédicule supérieur de l’artère thyroïdienne (STA) est disséqué et visualisé. Étant donné la plus petite taille de la STA chez la souris, cette dissection pourrait entraîner des dommages et même une transsection du STA. Par conséquent, il n’est pas disséqué dans le modèle murin. Au lieu de cela, le fascia à proximité est préservé pour s’assurer que le STA est maintenu intact.
Les principaux pièges potentiels de cette technique comprennent l’endommagement des pédicules complexes LTE du donneur, la réalisation d’une artériotomie ou d’une veinotomie de taille incorrecte, l’occlusion des vaisseaux aux sites d’anastomose ou le fait de laisser des espaces aux sites de l’anastomose pouvant provoquer des saignements. Pour éviter ces faux pas, des précautions doivent être prises lors de l’obtention de la greffe de donneur en laissant une brassard de tissu autour du pédicule STA. L’artériotomie et la veinotomie doivent être assez grandes pour permettre la circulation sanguine, mais assez petites pour éviter les fuites. Un nombre approprié de sutures doit être utilisé pour les anastomoses afin de combler les lacunes, mais pas trop pour obstruer les vaisseaux.
Si vous vous familiarisez avec les techniques microchirurgicales, cette procédure peut être effectuée en environ 3 heures. Ce modèle de transplantation laryngée peut être réalisé de manière fiable chez la souris et utilisé pour étudier la réponse immunitaire de l’hôte après une allotransplantation composite vascularisée.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’incidence et la prévalence du cancer du larynx ont augmenté respectivement de 12 % et 24 % au cours des trois dernières décennies, et bon nombre de ces patients subissent une laryngectomie pour le traitement10. Cette procédure aggrave considérablement la qualité de vie d’une personne et, par conséquent, un traitement alternatif est souhaité. L’allotransplantation composite vascularisée du larynx peut améliorer la capacité d’un patient à respirer et à parler; Cependant, des …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Randall Raish pour son excellente vidéographie et son aide au montage.
Materials
| #1 Paperclips | Staples | OP-7404 | Clips are shaped manually to be used as retractors |
| 1 cc Insulin Syringes | BD | 329412 | 27 G 5/8 |
| 10-0 Ethilon Nylon Suture | Ethicon | 2870G | |
| 25 G Precision Glide Needle | BD | 305125 | 1 in |
| 3 mL Luer-Lok Tip Syringe | BD | 309657 | |
| 30 G Sterile Standard Blunt Needles | Cellink | NZ5300505001 | |
| 5-0 Monocryl Suture | Ethicon | Y822G | |
| 8-0 Ethilon Nylon Suture | Ethicon | 2815G | |
| Adson Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | Straight, 1 x 2 teeth |
| Adventitia scissors | S&T | SAS-10 | 19 mm, 10 cm, straight |
| Angled Forceps | Fine Science Tools | 00109-11 | 45/11 cm |
| Artifical Tears Lubricant Opthalmic Ointment | Akorn Animal Health | 59399-162-35 | |
| Bandaid Fabric Fingertip | Cardinal Healthcare | 299399 | |
| Betadine Solution Swabsticks | Purdue Products | 67618-153-01 | |
| Buprenex Injection | CIII | 12495-0757-1 | 0.3 mg/mL |
| Clamp applying forceps without lock | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.CAF5 | 14 cm |
| Cotton Swabs | Puritan | 10806-001-PK | |
| DeBakey forceps | |||
| Dermabond Mini | Cardinal Healthcare | 315999 | |
| Dissecting Boards | Mopec | 22-444-314 | |
| Falcon Sterile Disposable Petri Dish | Corning | 25373-041 | 35 mm |
| Fine Scisssors | Fine Science Tools | 14029-10 | Curved Sharp-Blunt 10 cm |
| Golden A5 2-Speed Blade Clipper | Oster | 008OST-78005-140 | #10 |
| Hair Remover Sensitive Formula | Nair | 2260000033 | |
| Heparin | Meitheal Pharmaceuticals | 71288-4O2-10 | 10,000 USP units per 10 mL |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | 66794-013-25 | |
| Low-Temp Micro Fine Tip Cautery | Bovie Medical | AA90 | |
| Mercian Visibility Background Material | Synovis Micro Companies | VB3 | Green |
| Microvascular Approximator Clamp without Frame | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.ABB11V | 0.4-1 mm Vessel Diameter |
| Mouse face mask kit | Xenotec | XRK-S | Small |
| Needle holder | S&T | C-14 W | 5.5", 8 mm, 0.4 mm |
| Press n' Seal | Glad | 70441 | |
| Scalpel | Braun | BA210 | 10 blade |
| Single Mini Vessel Clamp | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.ABB11M | .31 (8 mm), 3 x 1 mm Rnd. Bl., Black Pair |
| Stereomicroscope | Olympus | SZ61 | |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Fisherbrand | 06-669-62 | |
| Sterile Disposable Drape Sheets | Dynarex | DYN4410-CASE | |
| Sterile Gauze Pads | Dukal | 1212 | |
| Sterile Saline | Hospira | 236173 | NaCl 0.9% |
| Sterile Surgical Gloves | Gammex | 851_A | |
| Straight Forceps | Fine Science Tools | 00108-11 | 11 cm |
| Tissue forceps | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.JFLP3 | 13.5 cm, 8 mm, 0.3 mm |
| Vannas Pattern Scissors | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.SDC15RV | 15 cm, 8 mm, curved 7mm blade |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-10 | 3 mm cutting edge, curved |
| Vessel Dilator Tip | Fine Science Tools | 00126-11 | Diameter 0.1 mm/Angled 10/11 cm |
| Vessel Dilator, Classic line | S&T | D-5a.3 W | 9 mm, 0.3 mm, angled 10 |
Riferimenti
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