Summary
דיסרגולציה פרוטאומית ממלאת תפקיד חשוב בהתפשטות של גליומות המסתננות באופן מפוזר, אך מספר חלבונים רלוונטיים נותרו בלתי מזוהים. עיבוד מרחבי דיגיטלי (DSP) מציע גישה יעילה בעלת תפוקה גבוהה לאפיון הביטוי הדיפרנציאלי של חלבונים מועמדים שעשויים לתרום לפלישה ולנדידה של גליומות מסתננות.
Abstract
גליומות מסתננות באופן מפוזר קשורות לתחלואה ותמותה גבוהות בשל האופי המסתנן של התפשטות הגידול. הם גידולים מורכבים מבחינה מורפולוגית, עם רמה גבוהה של שונות פרוטאומית הן על פני הגידול עצמו והן על פני המיקרו-סביבה ההטרוגנית שלו. הפוטנציאל הממאיר של גידולים אלה מועצם על ידי דיסרגולציה של חלבונים המעורבים במספר מסלולים מרכזיים, כולל תהליכים השומרים על יציבות התאים ושומרים על השלמות המבנית של המיקרו-סביבה. אף על פי שהיו מספר רב של ניתוחי גליומה בתפזורת וחד-תאית, יש מיעוט יחסי של ריבוד מרחבי של נתונים פרוטאומיים אלה. הבנת ההבדלים בהתפלגות המרחבית של גורמי הגידול ואוכלוסיות תאי מערכת החיסון בין הגידול הפנימי, הקצה הפולשני והמיקרו-סביבה מציעה תובנה רבת ערך לגבי המנגנונים העומדים בבסיס התפשטות והתפשטות הגידול. פרופיל מרחבי דיגיטלי (DSP) מייצג טכנולוגיה רבת-עוצמה שיכולה להוות את הבסיס לניתוחים רב-שכבתיים חשובים אלה.
DSP היא שיטה המכמתת ביעילות ביטוי חלבונים בתוך אזורים מרחביים שצוינו על ידי המשתמש בדגימת רקמה. DSP אידיאלי לחקר הביטוי הדיפרנציאלי של חלבונים מרובים בתוך ובין אזורי הבחנה, ומאפשר רמות מרובות של ניתוח כמותי ואיכותי. פרוטוקול DSP הוא שיטתי וידידותי למשתמש, ומאפשר ניתוח מרחבי מותאם אישית של נתונים פרוטאומיים. בניסוי זה, מיקרו-מערכים של רקמות בנויים מביופסיות ליבה של גליובלסטומה בארכיון. לאחר מכן, נבחר פאנל של נוגדנים, המכוונים לחלבונים בעלי עניין בתוך הדגימה. הנוגדנים, אשר מצומדים מראש לאוליגונוקלאוטידים של דנ"א הניתנים לפוטו-קלאוטידים, מודגרים לאחר מכן עם דגימת הרקמה למשך הלילה. תחת הדמיה מיקרוסקופית פלואורסצנטית של הנוגדנים, אזורי עניין (ROIs) שבתוכם ניתן לכמת את ביטוי החלבון מוגדרים עם הדגימות. לאחר מכן, אור UV מופנה לכל החזר על ההשקעה, ומבקע את האוליגונוקלאוטידים של הדנ"א. האוליגונוקלאוטידים עוברים מיקרו-אספירציה ונספרים בתוך כל החזר השקעה, מה שמכמת את החלבון המתאים על בסיס מרחבי.
Introduction
גליומות מסתננות מפוזרות הן הסוג הנפוץ ביותר של גידול מוח ממאיר במבוגרים והן תמיד קטלניות. הנטייה של תאי גליומה לנדוד באופן נרחב במוח היא אתגר טיפולי גדול. המנגנון שבאמצעותו הם מתפשטים כרוך בהגירה מכוונת ובפלישה לא מבוקרת. תאי גליומה פולשניים הוכחו כמפגינים טרופיזם והגירה לאורך דרכי החומר הלבן1, כאשר מחקרים אחרונים מצביעים על דה-מיאלינציה של דרכי אלה כתכונה פעילה ופרוטומוריגנית2. הפלישה מתווכת על ידי מעבר אפיתליאלי למזנכימלי, שבו תאי גליומה רוכשים תכונות מזנכימליות על ידי הפחתת הביטוי של גנים המקודדים חלבוני מטריצה חוץ-תאית ומולקולות הידבקות תאים, הגברת הנדידה והקלה על התפשטות דרך המיקרו-סביבה של הגידול 3,4,5.
ברמה המולקולרית, הודגם שיבוש של מספר חלבונים המעניקים יציבות תאית וממשק עם רכיבים אימונוגניים6. גליומות מסתננות ידועות כעוברות דיכוי של חלבונים בעלי תכונות אנטי-אפופטוטיות (למשל, PTEN)7. הם גם מבטאים יתר על המידה חלבונים המקדמים התחמקות מהתגובה החיסונית של המארח (למשל, PD1/PDL1)8. הדיסרגולציה של מסלולים מורכבים אלה משפרת את הגידוליות ומגדילה את הפוטנציאל הממאיר.
בדגימות של גליומה פולשנית, המטרה הייתה להעריך את הביטוי הדיפרנציאלי של חלבונים המפתח לגדילה, הישרדות ושגשוג של תאים, ולשלמות מבנית של מיקרו-סביבה בין מרכיבים פולשניים ולא פולשניים. בנוסף, ביקשנו לחקור את הוויסות הדיפרנציאלי של חלבונים בעלי תפקיד אימונוגני פעיל, ולהציע תובנה לגבי המנגנון שבאמצעותו הגנות חיסוניות של פונדקאי שנפגעות עשויות להגביר את הפוטנציאל השגשוג והפולשני של גליומות. זה רלוונטי במיוחד בהתחשב ברוחב המחקרים האחרונים המדגימים כיצד סמנים חיסוניים ומניעים של חוסר ויסות בממאירות יכולים לשמש כמטרות של אימונותרפיה. זיהוי מטרות טיפוליות ברות קיימא מבין החלבונים הרבים המעורבים במעקב חיסוני ובתגובתיות דורש גישה רגישה ומקיפה ביותר.
בהתחשב במגוון הרחב של חלבונים מועמדים שניתן לחקור, חיפשנו שיטה הדומה לאימונוהיסטוכימיה אך עם יעילות עיבוד נתונים משופרת. בתחום הביולוגיה של הסרטן, DSP התפתחה כטכנולוגיה רבת עוצמה עם יתרונות חשובים על פני כלים חלופיים לניתוח וכימות פרוטאומי. סימן ההיכר של DSP הוא יכולת הריבוב שלו בתפוקה גבוהה, המאפשרת מחקר סימולטני של מספר חלבונים שונים בתוך דגימה, מה שמסמן הבדל חשוב מטכנולוגיות סטנדרטיות אך בעלות פלקס נמוך יותר כגון אימונוהיסטוכימיה (IHC)9,10. תכונת המולטיפלקס של DSP אינה פוגעת בנאמנותו ככלי כמותי ואנליטי, כפי שמודגם על ידי מחקרים המשווים את DSP ל- IHC. כאשר משתמשים בו לכימות פרוטאומי של דגימות סרטן ריאה של תאים לא קטנים, למשל, הוכח כי DSP משיג תוצאות דומות ל-IHC11. בנוסף, DSP מציעה מפרט אזורי הניתן להתאמה אישית, שבו משתמשים יכולים להגדיר באופן ידני אזורים שבתוכם ניתן לבצע ניתוח פרוטאומי. זה מציג יתרון על פני שיטות מולטיפלקס של מקטע שלם10,12. בסבב אחד של עיבוד, DSP מציעה אפוא שכבות מרובות של ניתוח על ידי סקר מספר מטרות חלבון על פני אזורי עניין מרובים.
DSP יש יישומים במספר הגדרות פתולוגיות שונות. DSP הוא יתרון במיוחד בניתוח אונקולוגי, שכן שונות מרחבית יכולה להיות בקורלציה עם טרנספורמציה תאית וביטוי חלבונים דיפרנציאליים. לדוגמה, DSP שימש להשוואת הפרופיל הפרוטאומי של סרטן השד למיקרו-סביבה של הגידול הסמוך. לכך השלכות חשובות על הבנת ההיסטוריה הטבעית של גידול זה והתקדמותו, כמו גם על התגובה הפוטנציאלית לטיפול13. הקשרים נוספים הממחישים את הרבגוניות של DSP כוללים כימות מרחבי של מגוון החלבונים בסרטן הערמונית14, קשר של ביטוי סמן תאי חיסון עם התקדמות המחלה בקרצינומה של תאי קשקש בראש ובצוואר15, והדגמה של שיפוע אפיתל-מזנכימלי של ביטוי חלבונים המבחין בין סרטן שחלות גרורתי לסרטן שחלות ראשוני צלול16 . על ידי יישום DSP, אנו מאפיינים את הטופוגרפיה המרחבית של חלבונים שיכולים להשפיע על גידולים ופלישה של גליומות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הפרוטוקול המפורט להלן תואם את ההנחיות של ועדת האתיקה למחקר אנושי של דארטמות'-היצ'קוק. הסכמה מדעת התקבלה מהמטופלים שדגימות הרקמה שלהם נכללו במחקר זה. עיין בסעיף טבלת חומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים, הריאגנטים, הציוד והתוכנות המשמשים בפרוטוקול זה.
1. הכנת שקופיות17
- שלפו או הכינו רקמה קבועה בפורמלין, משובצת פרפין, מגליומות מסוג מבוגר אנושי שחודרות באופן מפוזר.
הערה: בניסוי זה נעשה שימוש בבלוקים משובצים פרפין של ביופסיות משלושה חולים עם גליובלסטומה. - צור בלוק מיקרו-מערך רקמות (TMA). קחו כמה ליבות בקוטר 2 מ"מ מכל ביופסיה והכניסו אותן לבלוק TMA יחיד (איור 1, למעלה). חותכים קטעים מבלוק TMA ב-4 מיקרומטר ועולים על מגלשות זכוכית. הניחו כל שקופית בתוך אטם מחזיק השקופיות. לדגום את המגלשה בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
2. הכנת מערכת IHC אוטומטית למחצה ותצורת תוכנה (לטעינה והפעלה של שקופיות)17
- הגדר את הריאגנטים. לחץ על כפתור הגדרת מגיב . לחץ על הוסף בכרטיסייה הגדרה .
- רשום מאגר כביסה על-ידי הקלדת שם עבורו בשדה שם . בחר עזר בשדה סוג . לחץ על שמור.
- רשום פתרון חסימה על-ידי חזרה על אותם שלבים כמו לעיל (השתנה בהתאם לישים, לדוגמה, בשדה שם ), אך בחירה בנוגדן ראשי בשדה סוג . בחר את הפרוטוקולים הרצויים בתיבות הנפתחות עבור פרוטוקול צביעת ברירת מחדל ופרוטוקול HIER המוגדר כברירת מחדל. בחר באפשרות Default Enzyme Protocol אם תרצה בכך (תיבה זו נותרה ריקה בפרוטוקול הנוכחי). לחץ על שמור.
- רשום את מערכת הזיהוי, המורכבת ממגש מיכל מגיב ברקוד. סרוק את הברקוד.
- התחל להזין פרטי מערכת מגיבים בחלון הוספת מערכת מגיבי מחקר . הקלד שם עבור מערכת הזיהוי.
- הקלד תאריך תפוגה. סמן את השורה הראשונה בתרשים ריאגנטים וסרוק את הברקוד של גורם מכיל חדש של ריאגנטים בגודל 30 מ"ל, ואז הברקוד יאכלס את שורה 1.
- הנח את הגורם המכיל במיקום 1 של מערכת האיתור. בחר את שם מאגר הכביסה בתיבה הנפתחת של העמודה מגיב ולחץ על הוסף. חזור על שלבים אלה כדי להוסיף ריאגנטים נוספים בשורות הבאות, כולל פתרון החסימה.
- הגדר את פרוטוקול החלבון עבור IHC. לחץ על הגדרת פרוטוקול. סמן את השורה המתאימה לפרוטוקול הרצוי ולחץ על העתק. הזן את השם ומלא שדות רלוונטיים אחרים בחלון עריכת מאפייני פרוטוקול .
- בחר את התיבה עבור הצג שלבי כביסה. ודא שהשדות Inc (min) ו- DispenseType נכונים עבור כל מגיב (10 דקות עבור פתרון החסימה, 0 דקות עבור מאגר הכביסה ו- 150 μL עבור כל DispenseType). לחץ על שמור.
- הכינו את המחקר. מלאו את המיכל במצב 1 במאגר שטיפה. למלא 150 μL לכל שקופית ו 5 מ"ל של נפח מת; השאירו את המכסה פתוח. חזור על שלבים אלה עבור הגורם המכיל במצב 2, שבו יש למלא בפתרון חסימה. מיכל זה צריך להיות 150 μL לכל שקופית ו 350 μL של נפח מת.
- טען את מגש מיכל הריאגנט על המכשיר. אפשר למערכת לבצע זיהוי מכולה ואמצעי אישור עוצמת קול. לחץ על הגדרת שקופית | הוסף מחקר. הזן את מזהה המחקר ואת שם המחקר ובחר 150 μL תחת חלוקת נפח | הפרוטוקול הרצוי בתפריט הנפתח פרוטוקול הכנה (אפייה ו Dewax מוצע). הדגש את המחקר ולחץ על הוסף שקופית.
- בחר רקמת בדיקה תחת סוג רקמה | 150 μL תחת נפח חלוקה | יחיד ושגרתי מהתיבות הנפתחות ' מצב צביעה' . בחר תהליך (IHC עבור המחקר הנוכחי) | שם הפתרון החוסם בתיבה הנפתחת של השדה 'סמן ' | פרוטוקול IHC DSP בשדה מכתים בכרטיסייה פרוטוקולים | * אפייה ועיבוי להכנה | * HIER 20 דקות עם ER1 עבור HIER. השאר את השדה אנזים ריק.
- חזור על תהליך זה עבור כל שקופית. לחץ על סגור לאחר שתסיים ולאחר מכן לחץ על הדפס תוויות. בדוק את כל תוויות השקופיות שעדיין לא הודפסו למחקר הנוכחי ולחץ על הדפס. הדבק תוויות לחלק העליון של השקופיות.
- טען והפעל שקופיות. טען את השקופיות על מגש השקופיות, כדי להבטיח את פני הדגימה והתווית כלפי מעלה. מקם את אריחי הכיסוי מעל השקופיות, ודא שהשקופיות מכוונות עם לשוניות בתחתית. טען את מגשי השקופיות על המכשיר.
- לחץ על לחצן ה-LED כדי להנמיך את המגש ולאפשר למכשיר להתחיל בסריקה ובזיהוי של שקופיות. לחץ על כפתור התחל כדי להתחיל את הניסוי.
- סיים את הניסוי. לחץ על לחצן ה-LED כאשר הוא מהבהב בירוק, המציין את השלמת הריצה. הסר את המגש מהמכשיר והרם בזהירות את אריחי הכיסוי מכל שקופית. הניחו את השקופיות בתמיסת מלח (PBS) אחת, הסירו את עודפי החיץ ושרטטו כל מקטע רקמה בעט הידרופובי ליצירת מחסום הידרופובי.
3. דגירה של נוגדנים וכתמים של גרעינים17
- בחר פאנל של נוגדנים כדי למקם את האנטיגנים המעניינים (ראה טבלה 1 עבור נוגדנים ששימשו בניסוי זה).
הערה: כל נוגדן כבר הוצמד לאוליגונוקלאוטיד דנ"א עם מקטע הניתן לצילום UV (PC-oligo) שמזהה אותו באופן ייחודי (אינדקס אוליגוס, איור 2). - צור פתרון נוגדן-PC-oligo עובד על ידי הוספת, עבור כל שקופית, 8 μL של כל נוגדן (מדולל 1:40) בלוח. השתמש במגיב החוסם כדילול כדי להגיע לנפח הסופי של 200 μL עבור כל שקופית. דגירה למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס (איור 3, שלב 1).
הערה: סמנים מורפולוגיים, צבעים ביולוגיים או נוגדנים המסומנים באופן פלואורסצנטי יכולים גם הם להתווסף לתמיסה בשלב זה. - למחרת, הניחו את המגלשה בצנצנת קופלין ושטפו 3 x 10 דקות ב-TBS-T אחד. Postfix ב 4% paraformaldehyde במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, ואחריו 2 x 5 דקות ב 1x TBS-T.
- הוסף כתם גרעיני SYTO13 (מדולל 1:10 ב-1x TBS) למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו 2x עם 1x TBS-T, ולאחר מכן אחסן את השקופית ב-TBS-T אחד.
4. הדמיה פלואורסצנטית, זיהוי ROI וצילום UV במכשיר DSP17
- לאחר ריחוף העכבר מעל איסוף נתונים במרכז הבקרה, בחר חדש/המשך הפעלה.
- מקם את השקופית במחזיק השקופית, עם התווית לכיוון המשתמש. הנמיכו את מהדק מגש ההחלקות, וודאו שהרקמה נראית בחלון המוארך . הוסף 6 מ"ל של מאגר S.
- פעלו בהתאם להנחיות ב'מרכז הבקרה'. התקרב בין צירים שונים באמצעות המחוונים X ו - Y כדי לתחום אזור לסריקה. בחר סרוק. אפשרו לסריקה להמשיך עד שכל אזור היעד שהוגדר צולם.
- צור תמונה של 20x. הגדר את ההחזר על ההשקעה באופן אוטומטי או ידני (איור 3, שלב 2). כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה, בחר שלושה ROIs עגולים בגודל שווה (קוטר של 250 מיקרומטר) עבור כל ליבת רקמה (איור 4, למטה).
הערה: ROIs ניתנים להתאמה אישית בגודל ובצורה. ניתן לבחור מספר ROIs בתוך כל מקטע. בניסוי זה, ROIs מעגליים מוגדרים באופן ידני. - אשר את ה- ROIs על-ידי לחיצה על לחצן יציאה מסביבת עבודה של סריקה . המתן לאור UV כדי לבקע את האוליגוס מהנוגדנים.
- לאחר השלמת תהליך מכשיר הניקוי , בחר איסוף נתונים חדש כדי להמשיך עם השקופיות או הלוח הנוכחיים. אחרת, בחר הסר שקופיות ומיקרו-לוחית.
- פתחו את החלון 'צלחת גמר ' על-ידי לחיצה כפולה על אזור סמל הצלחת בפינה השמאלית התחתונה של מרכז הבקרה. אם מספר הלוט של ערכת קוד היברידיזציה (Hyb ) (#) ידוע, הזן את המספר ולחץ על עדכן (אופציונלי בשלב זה). לחץ על סיום.
- נתק את מחזיק השקופיות ואת לוח האיסוף על-ידי ביצוע ההנחיות. אחסן את השקופיות ב- TBS-T. אם השקופיות לא ישמשו במשך זמן רב, לכסות אותם עם מדיום מימי להחליק.
5. קריאת חלבון17
- השתמשו באטם חדיר ויבשו את השואפות בטמפרטורה של 65°C במתקן תרמי כשהחלק העליון פתוח. מוסיפים 7 μL של מים שטופלו בפיתיל פירוקרבונט ומערבבים. דגירה ב-RT למשך 10 דקות, ולאחר מכן הסתובב במהירות.
- בחר את משוואות הבדיקה R ו- Probe U המתאימות מטבלה 2 כדי להנחות את יצירת תערובת הבדיקה/חיץ. בהתבסס על מספר קודי Hyb הדרושים להכלאה בניסוי הנוכחי, החל את משוואה (1) כמפורט להלן. מערבבים ומסתובבים במהירות.
# Hyb Codes Probe R Working Pool Probe U Working Pool Hybridization Buffer n = _______ (n × 8 μL) = _____ μL + (n × 8 μL) = ______ μL + (n × 80 μL) = _____ μL (1) - הוסף 84 μL של תערובת בדיקה/מאגר לכל חבילת קוד Hyb לשימוש. החלק כדי לערבב ולסובב כלפי מטה. בלוח הכלאה טרי של 96 בארות, הוסף 8 μL מכל תערובת מאסטר של Hyb Code לכל 12 הבארות של השורה המצוינת.
- העבר 7 μL מלוח האיסוף DSP לבאר המתאימה בלוח ההכלאה. מערבבים בעדינות. אטמו בחום ובצעו סיבוב מהיר. לאחר מכן, לדגור לילה ב 67 מעלות צלזיוס. מצננים את הצלחת על הקרח ומבצעים סיבוב מהיר.
- איחד את מוצרי ה-hyb מכל באר לתוך צינור רצועה, תוך צנרת עדינה של כל באר פי 5 לערבוב. כסו את צינור הרצועה והסתובבו מטה. הקפיאו את כל מוצרי ה-Hyb הנותרים שאינם מצופים בטמפרטורה של -80°C. טען את צינורות הרצועה למערכת הניתוח.
- שמור את קובץ ה- CDF בכונן USB ולאחר מכן העבר את הנתונים ממכשיר ה- DSP למנתח הדיגיטלי. השלם את ההגדרה על-ידי ביצוע השלבים הבאים.
- העמיסו חומרים מתכלים ודגימות מרוכזות לתחנת ההכנה. על המסך, לחץ על התחל עיבוד. בחר רגישות גבוהה, ואחריו הבא. לחץ על בחר הכל עבור מספר הבארות עם דוגמאות | סיום | הבא בהודעת דוא"ל | התחל.
- לאחר סיום תחנת ההכנה, אטם את המחסנית והעבר למנתח הדיגיטלי. לחץ על התחל לספור, בחר מיקום שלב, לחץ על טען קובץ CDF קיים ובחר קובץ שהועלה בעבר. לחץ/י על ״סיום״, בחר/י שוב את מיקום השלב, לחץ/י על ״סיום״ | התחל להפעיל את התוכנית.
- שמור את הקובץ המכווץ של קבצי ההמרה של ספירת הכתבים ממערכת הניתוח לכונן USB ולאחר מכן הכנס את הכונן למחשב DSP. במרכז הבקרה של DSP, רחף מעל איסוף נתונים ולאחר מכן לחץ על העלה ספירות. בחר את הקובץ המכווץ הרלוונטי.
6. ניתוח נתונים17
- לחץ על רשומות במרכז הבקרה של DSP. כדי להציג סריקות בתור, בחר הוסף סריקות נבחרות לתור | תור הניתוח שלי. בחר מחקר חדש מהתור לאחר ריחוף מעל האפשרות ניתוח נתונים במרכז הבקרה.
- בחר QC מתוך אפשרויות שורת המשימות. המשך עם ערכי ברירת המחדל או התאם אם תרצה בכך. בחר הפעל QC וסקור את רשת התוצאות. לחץ על הפעל QC כדי להמשיך וליצור ערכת נתונים חדשה, תוך נרמול הערכים לפקדי ההכלאה החיוביים.
- יבא את התגים החדשים לקובץ XLSX. בחר נהל ביאורים בחלונית סריקות ולאחר מכן הורד תבנית, הוסף את התגים וייבא את הקובץ.
- אופציונלי: לאחר הפעלת QC, התאם את הנתונים עוד יותר באמצעות אפשרויות אחרות בסרגל הכלים. השתמש בכלים בחלונית תצוגות חזותיות כדי להתוות את הנתונים שעברו שינוי צורה.
- נווט בתיבה הנפתחת האפורה של פרמטרים כדי לחבר כל חלקה בחלונית תצוגות חזותיות . בחר אזור מסוים בתוך חלקה כדי להציג באופן חזותי את המקטעים המסומנים המתאימים בחלונית סריקות ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי ליצור תגים או קבוצות. בתוך סיכום ערכת נתונים, סקור מתוות מ'נורמליזציה', ' שינוי קנה מידה' ואפשרויות אחרות לניתוח ולהצגה.
- שמור פריט חזותי על-ידי בחירת הסמל לשמירה; סקור פריטים חזותיים שכבר נשמרו תחת סיכום. בחר בלחצן ייצוא (.svg) כדי לייצא פריט חזותי בתבנית .svg. ייצא נתונים שעליהם מבוססת תצוגה חזותית על-ידי לחיצה על לחצן ייצוא (.xlsx). ייצא את כל הנתונים הכלולים בערכת נתונים ספציפית על-ידי ריחוף הסמן מעל שם ערכת הנתונים בחלונית השנייה ולחיצה על סמל הייצוא .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 4 מציג את התוצאות המייצגות מניסוי DSP שבוצע על דגימות של גליובלסטומה. מוצגת מפת חום, הממחישה את אחת השיטות שבאמצעותן ניתן ללכוד נתונים באופן חזותי באמצעות תוכנת DSP. שורות מייצגות מטרות חלבון, וכל עמודה מתאימה לאזור עניין. טווח צבעים של כחול עד אדום מציין הבעה נמוכה עד גבוהה, בהתאמה. השתנות הצבע בתוך שורה משקפת הטרוגניות של חלבונים אזוריים ומציעה קשר מרחבי אפשרי עם ביטוי חלבון דיפרנציאלי. לדוגמה, בניסוי הנוכחי, S100 ו- CD56 גבוהים באופן אוניברסלי מכיוון שהם סמנים עצביים.
סמנים עם השונות הרבה ביותר כללו B7-H3, Ki-67, CD44 ופיברונקטין. לסמנים אלה יש קשרים חשובים עם התפשטות הגידול, נדידה וגרורות, בהתאמה. לכן סביר שהם יפגינו שונות אזורית בין דגימות של ליבה ממאירה, פלישה ממאירה ורקמה לא ממאירה. ייצוג נתונים מספריים אפשרי גם כן; ניתן לייצא קובץ המכיל את ערך הביטוי של כל סמן חלבון בתוך ROI בצורת טבלה לצורך ניתוח מתמטי וסטטיסטי. ערך ביטוי זה מופק על-ידי תכונת הספירה הדיגיטלית הזמינה באמצעות DSP, אשר מכמתת את אוליגו ה-PC המיקרו-אספירטיבי בתוך כל החזר השקעה (איור 1 ואיור 2).
איור 1: הגדרת אזורי עניין במיקרו-מערך רקמות מביופסיות גליובלסטומה. החלק העליון, המטוקסילין ומוכתם אאוזין של מיקרו-מערך רקמות המכיל מספר ביופסיות ליבה בקוטר 2 מ"מ משלושה חולי גליובלסטומה. למטה, אזורי עניין המוגדרים בתמונת פלואורסצנציה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: אוליגונוקלאוטידים הניתנים לצילום. בדיקות נוגדנים או נוגדנים אוליגונוקלאוטידים למטרות חלבון או RNA, בהתאמה, קשורות באופן קוולנטי לאוליגונוקלאוטידים עם מקשרים הניתנים לפוטו-קלאבציה. קטעי רקמות מוכתמים עם בדיקות. לאחר מכן, אור UV מופנה אל ROIs כדי לשחרר את ה-PC-oligos, אשר נספרים באופן דיגיטלי. נתון זה שונהמ-9, באישור Springer Nature (זכויות יוצרים 2020). קיצורים: PC-oligos = אוליגונוקלאוטידים פוטו-קליאוויים; ROIs = אזורי עניין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: הליך DSP. 1) עיבוד רקמות: מגלשת רקמה מוכתמת בנוגדן מצומד אוליגו או בבדיקות RNA. 2) בחירת ROI: שקופית הרקמה מצולמת, ו- ROIs מוגדרים, באופן ידני או אוטומטי על סמך תבניות פלואורסצנטיות מסוימות. 3) ביקוע של אוליגונוקלאוטידים מצומדים: אור UV מופנה אל ה-ROIs, וכתוצאה מכך נוצר ביקוע של האוליגונוקלאוטידים הניתנים לפוטו-קליאוויטידים. 4) אוסף PC-oligo: ה-PC-oligos שואפים לתוך צינור מיקרו-קפילרי. 5) ציפוי: אוליגוס PC שאפתניים מופקדים לתוך צלחת microtiter. 6) חזור: שלבים 3-5 חוזרים על עצמם עבור כל החזר השקעה; בין כל מחזור מתבצעת שטיפה קפדנית. 7) כימות: ניתן להכליא מאגרים מרחביים של PC-oligos לברקודים פלואורסצנטיים; זה מאפשר ספירה דיגיטלית של עד כמיליון אירועים מחייבים לכל ROI. לחלופין, ניתן לכמת PC-oligos באמצעות NGS, שבו צלחת המיקרוטיטר כולה מאוספת לצינור יחיד ומרוצפת. לאחר מכן מתורגמים הקריאות לספירות דיגיטליות וממופות בחזרה להחזר ההשקעה המקורי שלהן, תוך יצירת מפה חזותית של ביטוי חלבון או RNA בתוך כל מקטע רקמה. נתון זה שונהמ-9, באישור Springer Nature (זכויות יוצרים 2020). קיצורים: DSP = עיבוד מרחבי דיגיטלי; PC-oligos = אוליגונוקלאוטידים פוטו-קליביים; ROIs = אזורי עניין; NGS = ריצוף מהדור הבא. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: מפת חום מייצגת מניסוי DSP. עמודות מייצגות אזורי עניין בודדים. שורות מייצגות מטרה חלבונית. הבעה נמוכה מוצגת בכחול, וביטוי גבוה מוצג באדום. קיצור: DSP = עיבוד מרחבי דיגיטלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
| פרופיל תאי חיסון של GeoMx - אנושי | מודול פאן-גידול |
| PD-1 | מרץ1 |
| CD68 | NY-ESO-1 |
| HLA-DR | S100B |
| Ki-67 | BCL-2 |
| בטא-2 מיקרוגלובולין | EpCAM |
| CD11c | Her2 |
| תקליטור20 | פטן |
| תקליטור3 | אר-אלפא |
| תקליטור4 | יחסי ציבור |
| CD45 | |
| CD56 | |
| תקליטור8 | |
| CTLA4 | |
| GZMB | |
| PD-L1 | |
| פאנק קיי | |
| SMA | |
| פיברונקטין | |
| Rb IgG | |
| גב 'IgG1 | |
| גב 'IgG2a | |
| היסטון H3 | |
| S6 | |
| גאפדה |
טבלה 1: מדגם מייצג של חלבונים שניתן להעריך באמצעות לוחות נוגדנים מתוכננים מראש.
| בדיקה U בריכת עבודה | ||||||
| מודול 2 בדיקה R | מודולים אחרים | מים מטופלים DEPC (מיקרוליטר) | נפח כולל (מיקרוליטר) | גשושית U מאסטר סטוק (מיקרוליטר) | מים מטופלים DEPC (מיקרוליטר) | נפח כולל |
| 2 | ... | 16.5 | 2 | 14.5 | 16.5 | |
| 4 | ... | 33 | 4 | 29 | 33 | |
| 6 | ... | 49.5 | 6 | 43.5 | 49.5 | |
| 8 | ... | 66 | 8 | 58 | 66 |
טבלה 2: קודי הכלאה ובריכות עבודה של Probe R ו- Probe U. קיצור: hyb = הכלאה; DEPC = דיאתיל פירוקרבונט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בהתחשב במגוון החלבונים שעשויים להשפיע על האגרסיביות של גליומות והרעיון שכמה מהחלבונים האלה עדיין לא התגלו, שיטת כימות חלבונים בתפוקה גבוהה היא גישה טכנולוגית אידיאלית. בנוסף, בהתחשב בכך שנתונים מרחביים בדגימות אונקולוגיות מתואמים לעתים קרובות עם ביטוי דיפרנציאלי18, שילוב פרופיל מרחבי בגישת כימות החלבונים מאפשר ניתוח יעיל יותר.
גישת התפוקה הגבוהה של DSP מאפשרת גם להשתמש בו בגישה דמוית רובה ציד, שהיא אידיאלית לגילוי סמנים ביולוגיים פוטנציאליים חדשים של מחלות ותגובה לטיפול. בשני מחקרים על מלנומה, DSP שימש להערכת התגובות לטיפול משולב עם ipilimumab ו nivolumab לעומת nivolumab מונותרפיה19 ולטיפול משולב neoadjuvant עם ipilimumab ו nivolumab לעומת טיפול אדג'ובנטי סטנדרטי20. בשני המחקרים, פרופיל DSP של מגוון מטרות חלבונים לאחר הטיפול הדגים ביטוי יחסי דיפרנציאלי של סמנים אימונולוגיים מרכזיים, מה שמרמז על תפקיד לסמנים ביולוגיים פוטנציאליים של תגובה טיפולית.
DSP גם מקל על קביעת המשמעות הפתולוגית האולטימטיבית של תהליכים מורכבים ברמה המולקולרית. לדוגמה, תכונה ייחודית של גליומות פולשניות היא הנטייה שלהן לנדוד ישירות דרך המטריצה החוץ-תאית (ECM), ונתיב הנדידה שלהן מונחה לעתים קרובות על ידי דרכי כלי דם וחומר לבן 1,2. השתנות בביטוי החלבון של מיקרו-הסביבה של הרקמה היא סימן ההיכר של המעבר האפיתליאלי למזנכימלי המניע פלישה. מספר מחקרים בחנו כיצד גליומות יכולות לווסת מטריצת מטאלופרוטאינאזות (MMPs), וכתוצאה מכך פירוק של ECM שמסביב והגברת הפולשנות21,22,23. על ידי הדמיה וכימות של ההשפעה המצטברת במורד הזרם של רגולציה דיפרנציאלית זו, DSP מספק ניתוח הוליסטי רחב היקף.
גורם מרכזי בפוטנציאל הממאיר של גליומות הוא היכולת שלהן לתקשר עם הגנות החיסון של המארח ולתפעל אותן. בדומה לגידולים מוצקים אחרים, גליומות משתמשות במגוון מנגנונים כדי להתחמק מחיסון המארח ולשבש את הפעלת החלבונים החיוניים להגברת התגובה החיסונית. ההתקדמות האחרונה באימונו-אונקולוגיה התמקדה בזיהוי חלבונים אימונוגניים המתבטאים או מנוצלים על ידי גידולים. בחזית ההתפתחויות הללו נמצאים השימוש בתאי T לאיתור אנטיגנים סרטניים פעילים מבחינה אימונולוגית שכנגדם ניתן לכוון נגיפים אונקוליטיים 24,25, ופיתוח מעכבי מחסום כנגד חלבונים מעכבי תאי T (למשל, PD1/PDL1 ו-CTLA4) לחיזוק חסינות המארח נגד גידולים 26,27 . אוכלוסיות סטרומליות אחרות המשתלבות באופן בולט במיקרו-סביבה של גליומה כוללות מקרופאגים, תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים, תאי מערכת החיסון, ותת-אוכלוסייה שזוהתה לאחרונה בשם 'תאים סטרומליים הקשורים לגליומה' (GASCs)28. לאינטראקציות של תאים אלה עם כימוקינים, ציטוקינים ורכיבים של ECM יש השלכות חשובות על התפשטות הגידול, פלישתו ותגובתו לטיפול, ולכן הן משמשות מטרות חשובות לכימות אזורי ולהשוואה באמצעות טכנולוגיות כגון DSP.
פרוטוקול DSP ידידותי למשתמש ומאפשר שכבות מרובות של התאמה אישית. מכיוון שחלק גדול מתהליך הכימות הוא אוטומטי, השלבים העיקריים התלויים במשתמש מכוונים להשגת הרגישות והספציפיות הגבוהות ביותר האפשריות של זיהוי מטרות. שלבים מרכזיים בפרוטוקול כוללים אפוא קביעת כתם להדמיה פלואורסצנטית ראשונית של הדגימה, תיחום של ROIs ובחירת לוחות הנוגדנים.
בעת תכנון פרוטוקול צביעה, חשוב לזהות תחילה מטרה שעשויה להדגים הבדלים הניתנים לכימות בין אזורים שונים בדגימה, בהתאם למאפיין או התנהגות קריטיים של רקמת המקור. לאחר מכן, יש לבחור סוכן שיקשור ביעילות את היעד. לדוגמה, אם מישהו מקווה לדמיין אזורים של היפרפלזיה או אטיפיה גרעינית, H&E או כתם גרעיני עשוי להיבחר; לחלופין, אם שואפים לדמיין שינויים בביטוי של גן הידוע כקשור לרקמות ממאירות או טרום-ממאירות, ניתן לבחור נוגדן מצומד פלואורופור. תאי הגידול עצמם יכולים להיות מסומנים באופן ספציפי במקרה של גידולים מוטנטיים IDH1-R132H. ניתן לשנות את הפרוטוקול הנוכחי על ידי הוספת IDH1-R132H המסומן באופן פלואורסצנטי כסמן מורפולוגי (שלב פרוטוקול 3.2). ניתן להשתמש בעד ארבעה כתמים לכל דגימה. לאחר הדמיה של הרקמה המוכתמת התרחשה, ROIs מיועדים. בחירת ה-ROIs צריכה לשקף היכן צפויים להתרחש הבדלים משמעותיים בביטוי המטרה של חלבונים. שיקולים מרכזיים בבחירת ROIs כוללים גודל (קוטר של 10-600 מיקרומטר), צורה (עיגול, מלבן או ציור על ידי המשתמש) וסגמנטציה (תיחום נוסף של אזורי משנה בתוך ROI יחיד, המציע שכבת ניתוח פוטנציאלית נוספת). יש למטב משתנים אלה כדי ללכוד בצורה היעילה ביותר וריאציה מרחבית בביטוי המטרה הצפויה בהתבסס על לוח הנוגדנים שנבחר.
בחירת פאנל הנוגדנים היא בעלת חשיבות קריטית, שכן ביטוי נוגדנים דיפרנציאלי משמש בסופו של דבר כנקודת הסיום של המחקר. בעת ביצוע שלב זה, חשוב לשקול אילו סמנים עשויים להפגין ביטוי המתואם באופן חיובי או שלילי עם שלבים לאורך הספקטרום של התפתחות הגידול, משפיר, לטרום פולשני, פולשני או ממאיר. כמו כן חשוב לשקול היטב את המאפיינים של רקמת המוצא ואת סוג הגידול, שכן שתי התכונות הללו עשויות להשפיע על הביטוי של סמנים מסוימים.
מכיוון שחלק גדול מהתהליך הוא אוטומטי, כל הפגמים בהליך נובעים בדרך כלל מתקלה בחומרה או בתוכנה, מה שמציע יכולת מוגבלת לפתרון בעיות למשתמש. בעיות שעלולות להתעורר כוללות שיבוש של מדד בקרת האיכות המובנה (QC) (שנועד לסמן ולהשמיט נתונים המרמזים על יחס אות לרעש נמוך, ספירות נמוכות וזיהוי מטרה לא מספק), עדכוני תוכנה חריגים ובעיות פרוצדורליות (למשל, סיום מוקדם של שלבים שונים). עבור בעיות אלה, מומלץ למשתמש לפנות ליצרן לקבלת תמיכה מרחוק. לחלופין, אם המשתמש נתקל בבעיות נתונים מהותיות (למשל, ספירת גרעינים נמוכה באופן כללי, שונות נמוכה בביטוי בין ROIs), הוא עשוי לשקול לחזור על שלבים קודמים בהליך (לדוגמה, איגום מחדש של נתונים מה- TMA המקורי, הגדרה מחדש של ROIs). חשוב גם לשקול שינויים בצפיפות הרקמות כבלבול פוטנציאלי של ייצור אנטיגני ובכך ביטוי נוגדנים; לפיכך, רקמות בעלות צפיפות דומה צריכות לשאוף להיבחר לניתוח.
אמצעי בקרה מובנים בפרוטוקול. התוכנית מספקת הן בקרה חיובית פנימית והן שלילית המסבירה וריאציות בהכלאה של PC-oligos לברקודים הפלואורסצנטיים. חלבוני משק הבית מציעים שליטה חיובית נוספת שיכולה לשמש בנוסף כגורם נורמליזציה על בסיס התא.
היכולת להגדיר ROIs שבתוכם מתרחש כימות היא הבסיס ליכולת הפרופיל המרחבי של DSP. תיחום זה של ROIs הניתן להתאמה אישית מסמן שלב קריטי וייחודי בתוך הפרוטוקול. האפשרות ליצור ROI קטן כמו תא בודד מאפשרת דיוק אזורי בכימות חלבונים או חומצות גרעין, והיכולת להגדיר ROIs מרובים ולכמת את תוכנם במקביל באמצעות ניתוח מולטיפלקס מניבה גישה של תפוקה גבוהה.
כאשר ROIs נבחרים לייצג אזורים מובחנים פתולוגית בתוך דגימת גליומה (למשל, נמק, פריווסקולרי), פרופיל פרוטאומי והשוואה אזורית עשויים לחשוף מנגנונים של התפשטות הגידול והתקדמותו. לדוגמה, IHC שימש לכימות אזורי של ביטוי גורם היפוקסיה-אינדוקציה (HIF-1α) בדגימות גליובלסטומה וחשף ביטוי גבוה יותר ליד אזורים נמקיים בהשוואה לאזורים פריווסקולריים29. זה עולה בקנה אחד עם מספר מחקרים המצביעים על תפקיד היפוקסיה בגידול של גליומה.
שונות אזורית נחקרה באופן נרחב גם בקרב מרכיבי תאי החיסון של המיקרו-סביבה של הגידול. מקרופאגים/מיקרוגליה מהווים את אוכלוסיית תאי החיסון השולטת בגליומות ונחקרו באופן מקיף על בסיס אזורי. תת-אוכלוסיות של מקרופאגים הקשורים לגידול (TAMs) הוכחו כממלאות תפקידים שונים בהתקדמות הגידול בהתאם למיקומם בתוך הגידול ולמיקרו-סביבה. אלה בתוך הקצה הפולשני של הגידול מפרקים את קרום המרתף, ומקדמים התפשטות; אלה באזורים היפוקסיים מפעילים אפקט אנגיוגני, המקל על הצמיחה; אלה הנמצאים בקרבת כלי הדם של הגידול מפרישים EGF וגורמים הקשורים אליהם כדי לכוון את תאי הגידול הסטרומליים לכיוון כלי הדם, מה שמניע גרורות30. תכונות קריטיות אלה, התלויות מרחבית, מדגימות את הערך של נתונים פרוטאומיים אזוריים בביולוגיה של סרטן ומייצגות יישום חשוב נוסף של DSP לאפיון אוכלוסיות תאי חיסון בתוך הגידול והמיקרו-סביבה שלו.
לטכניקה יש כמה מגבלות, כולל עלות ומספר קטן יחסית של מטרות הזמינות בלוחות נוגדני הליבה. בנוסף, למרות שרזולוציה תת-תאית אינה אפשרית עם DSP, זה יהיה אפשרי עם טכנולוגיות חדשות עתידיות31. למרות מגבלות אלה, DSP היא טכניקה רבת עוצמה לסוגים מסוימים של שאלות ממוקדות, שבעבר לא ניתן היה לענות עליהן בביולוגיה של תאי גליומה. טכנולוגיה חדשנית זו מהווה הזדמנות יוצאת דופן לחשיפת נקודות מבט ביולוגיות חדשות באמצעות הערכה מדויקת של מטרות חלבונים שונות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מודים על תמיכת המעבדה לגנומיקה קלינית וטכנולוגיה מתקדמת במחלקה לפתולוגיה ורפואה מעבדתית של מערכת הבריאות של דארטמות' היצ'קוק. המחברים גם מכירים במשאב המשותף לפתולוגיה במרכז הסרטן של דארטמות' עם מענק תמיכה של מרכז הסרטן של NCI 5P30 CA023108-37.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BOND Research Detection System | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | DS9455 | Open detection system containing open containers in a reagent tray |
| BOND Wash | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | AR950 | 10X concentrated buffer solution for washing fixed tissue |
| Buffer W | NanoString, Seattle, WA | contact company | Blocking reagent |
| Cy3 conjugation kit | Abcam, Cambridge, UK | AB188287 | Cy3 fluorescent antibody conjugation kit |
| GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) | NanoString, Seattle, WA | contact company | System for imaging and characterizing protein and RNA targets |
| GeoMx DSP Instrument BufferKit | NanoString, Seattle, WA | 100471 | Buffer kit for GeoMX DSP (including buffers for sample processing and preparation) |
| GeoMx Hyb Code Pack_Protein | NanoString, Seattle, WA | 121300401 | Controls for running GeoMX DSP experiemtns |
| GeoMx Immune Cell Panel (Imm Cell Pro_Hs) | NanoString, Seattle, WA | 121300101 | Protein module with targets for human immune cells and immuno-oncologic targets |
| GeoMx Pan-Tumor Panel (Pan-Tumor_Hs) | NanoString, Seattle, WA | 121300105 | Protein module with targets for multiple human tumor types and for markers of epithelial-mesenchymal transition |
| GeoMx Protein Slide Prep FFPE | NanoString, Seattle, WA | 121300308 | Sample preparation reagents for GeoMX DSP protein analysis |
| LEICA Bond RX | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | contact company | Fully automated IHC stainer |
| Master Kit--12 reactions | NanoString, Seattle, WA | 100052 | Materials and reagents for use with the nCounter Analysis system |
| nCounter Analysis System | NanoString, Seattle, WA | contact company | Automated system for multiplex target expression quantification (to be used with GeoMx DSP) |
| TMA Master II | 3DHistech Ltd., Budapest, Hungary | To create the tissue microarray block |
References
- Pedersen, P. H., et al. Migratory patterns of lac-z transfected human glioma cells in the rat brain. International Journal of Cancer. 62 (6), 767-771 (1995).
- Wang, J., et al. Invasion of white matter tracts by glioma stem cells is regulated by a NOTCH1-SOX2 positive-feedback loop. Nature Neuroscience. 22 (1), 91-105 (2019).
- Iwadate, Y.
- Tao, C., et al. Genomics and prognosis analysis of epithelial-mesenchymal transition in glioma. Frontiers in Oncology. 10, 183 (2020).
- Cuddapah, V. A., Robel, S., Watkins, S., Sontheimer, H. A neurocentric perspective on glioma invasion. Nature Reviews Neuroscience. 15 (7), 455-465 (2014).
- Barthel, L., et al. Glioma: molecular signature and crossroads with tumor microenvironment. Cancer and Metastasis Reviews. 1 (1), 53-75 (2021).
- Ziegler, D. S., Kung, A. L., Kieran, M. W.
- Berghoff, A. S., et al. Programmed death ligand 1 expression and tumor-infiltrating lymphocytes in glioblastoma. Neuro-Oncology. 17 (8), 1064-1075 (2015).
- Merritt, C. R., et al. Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue. Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).
- Van, T. M., Blank, C. U. A user's perspective on GeoMxTM digital spatial profiling. Immuno-Oncology Technology. 1, 11-18 (2019).
- Garcia-Pardo, M., Calles, A. ROS-1 NSCLC therapy resistance mechanism. Precision Cancer Medicine. , Online (2021).
- Ye, L., et al. Digital spatial profiling of individual glomeruli from patients with anti-neutrophil cytoplasmic autoantibody-associated glomerulonephritis. Frontiers in Immunology. 13, 831253 (2022).
- Bergholtz, H., et al. Best practices for spatial profiling for breast cancer research with the GeoMx digital spatial profiler. Cancers. 13 (17), 4456 (2021).
- Brady, L., et al. Inter- and intra-tumor heterogeneity of metastatic prostate cancer determined by digital spatial gene expression profiling. Nature Communications. 12 (1), 1426 (2021).
- Kulasinghe, A., et al. Highly multiplexed digital spatial profiling of the tumor microenvironment of head and neck squamous cell carcinoma patients. Frontiers in Oncology. 10, 607349 (2021).
- Wang, D. Y. -T., et al. Case study: Digital spatial profiling of metastatic clear cell carcinoma reveals intra-tumor heterogeneity in epithelial-mesenchymal gradient. bioRxiv. , (2021).
- GeoMx DSP. Automated slide preparation user manual. GeoMx DSP. , nanoString Technologies. Seattle, Washington. (2022).
- Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics. NPJ Precision Oncology. 4, 11 (2020).
- Wolchok, J. D., et al. Overall survival with combined nivolumab and ipilimumab in advanced melanoma. New England Journal of Medicine. 377 (14), 1345-1356 (2017).
- Blank, C. U., et al. Neoadjuvant versus adjuvant ipilimumab plus nivolumab in macroscopic stage III melanoma. Nature Medicine. 24 (11), 1655-1661 (2018).
- Matthews, R. T., et al. Brain-enriched hyaluronan binding (BEHAB)/brevican cleavage in a glioma cell line is mediated by a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs (ADAMTS) family member. Journal of Biological Chemistry. 275 (30), 22695-22703 (2000).
- Paganetti, P. A., Caroni, P., Schwab, M. E. Glioblastoma infiltration into central nervous system tissue in vitro: involvement of a metalloprotease. Journal of Cell Biology. 107, 2281-2291 (1988).
- Beliën, A. T., Paganetti, P. A., Schwab, M. E. Membrane-type 1 matrix metalloprotease (MT1-MMP) enables invasive migration of glioma cells in central nervous system white matter. Journal of Cell Biology. 144 (2), 373-384 (1999).
- Coulie, P. G., Vanden Eynde, B. J., vander Bruggen, P., Boon, T. Tumour antigens recognized by T lymphocytes: At the core of cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 14 (2), 135-146 (2014).
- Finn, O. J. Vaccines for cancer prevention: a practical and feasible approach to the cancer epidemic. Cancer Immunology Research. 2 (8), 708-713 (2014).
- Sharma, P., Allison, J. P. The future of immune checkpoint therapy. Science. 348 (6230), 56-61 (2015).
- Chen, L., Han, X. Anti-PD-1/PD-L1 therapy of human cancer: past, present, and future. Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3384-3391 (2015).
- Cai, X., et al. Glioma-Associated stromal cells stimulate glioma malignancy by regulating the tumor immune microenvironment. Frontiers in Oncology. 11, 672928 (2021).
- Ishii,, et al. Histological characterization of the tumorigenic "peri-necrotic niche" harboring quiescent stem-like tumor cells in glioblastoma. PLoS One. 11 (1), 0147366 (2016).
- Lewis, C. E., Pollard, J. W. Distinct role of macrophages in different tumor microenvironments. Cancer Research. 66 (2), 605-612 (2006).
- NanoString. CosMx Spatial Molecular Imager: True Single-Cell In Situ Solution. NanoString. , (2022).
