Um fluxo de trabalho integrado de identificação e quantificação no metabolome não-alvo baseado em controle FDR
Summary
Construímos um fluxo de trabalho metabolômico não-acompanhado que integrou XY-Meta e metaX juntos. Neste protocolo, exibimos como usar o XY-Meta para gerar uma biblioteca espectral chamariz a partir da referência de espectro de acesso aberto e, em seguida, executamos o controle FDR e usamos o metaX para quantificar os metabólitos depois de identificar o espectro metabolômico.
Abstract
Técnicas de metabolômica não-alvo estão sendo amplamente utilizadas nos últimos anos. No entanto, o rápido aumento do rendimento e o número de amostras criam uma enorme quantidade de espectros, estabelecendo desafios para o controle de qualidade do espectrometria de massa. Para reduzir os falsos positivos, é necessário um controle de qualidade da taxa de descoberta falsa (FDR). Recentemente, desenvolvemos um software para controle FDR de identificação metabolome não direcionada que é baseado em uma estratégia de isca alvo chamada XY-Meta. Aqui, demonstramos um pipeline de análise completo que integra XY-Meta e metaX juntos. Este protocolo mostra como usar o XY-meta para gerar um banco de dados de isca a partir de um banco de dados de referência existente e executar o controle FDR usando a estratégia Target-Decoy para identificação metabolome em larga escala em um conjunto de dados de acesso aberto. A análise diferencial e a anotação dos metabólitos foram realizadas após a execução do metaX para picos metabólitos de detecção e quantitação. Para ajudar mais pesquisadores, também desenvolvemos uma plataforma de análise baseada em nuvem para essas análises, sem a necessidade de habilidades bioinformáticas ou qualquer linguagem de computador.
Introduction
Os metabólitos desempenham papéis importantes nos processos biológicos. Metabólitos são frequentemente reguladores de vários processos como transferência de energia, regulamentos hormonais, regulação de neurotransmissores, comunicações celulares e modificações pós-translacionais de proteínas, etc 1,2,3,4. Metabolômica não-alvo fornece uma visão global de numerosos metabólitos 5,6. Com os avanços nas tecnologias de espectrometria de massa e cromatografia, o rendimento dos espectros metabolome MS/MS está aumentando rapidamente nos últimos anos 7,8,9,10,11. Para identificar metabólitos desses enormes conjuntos de dados, vários softwares de anotação foram desenvolvidos11, como MZmine12, MS-FINDER13, CFM-ID14, MetFrag15 e SLAW16. No entanto, essas identificações muitas vezes contêm muitos falsos positivos. As razões incluem: (1) Os espectros MS/MS contêm ruído aleatório, o que pode enganar a correspondência de pico. (2) Isômeros e diferenças nas energias de fragmentação causam múltiplas impressões digitais de espectro e, assim, aumentam o volume da biblioteca de referência. (3) A qualidade das bibliotecas de referência varia. É necessário um padrão adequado para construir uma boa biblioteca espectral de referência. Portanto, um controle sistemático de falsas taxas de descoberta (FDR) para metabolômica não-alvo é essencial para a pesquisa de metabolome funcional 7,8,9,17.
Tanto a abordagem empírica de Bayes quanto a estratégia target-decoy resolveram o problema de controle FDR em geral. Kerstin Scheubert et al. mostraram que a estratégia target-decoy no banco de dados de isca gerada a partir do método baseado em árvores de fragmentação é o melhor método para o controle FDR9. Xusheng Wang et al. projetaram um método para a geração de isca com base na regra do octeto em química e melhoraram a precisão da estimativa de FDR17. A biblioteca espectral para geração de banco de dados de isca foi demonstrada para melhor desempenho18. Aqui, melhoramos o método baseado em biblioteca espectral e desenvolvemos um software chamado XY-Meta19 que pode melhorar ainda mais a precisão da estimativa do FDR. Ele usa a biblioteca espectral de referência existente para gerar uma biblioteca de isca para o controle FDR sob o esquema Target-Decoy. XY-Meta suporta seus próprios algoritmos de correspondência de espectros e similaridade cossino. Permite modos convencionais de pesquisa e pesquisa iterativa. Na etapa de avaliação do FDR, ele suporta o modo concateado Target-Decoy e o modo separado. Para uma melhor flexibilidade, o XY-Meta aceita bibliotecas de isca externas.
A detecção e quantificação de picos de metabólitos também é um passo importante da análise metabolome não alvo. A detecção de picos é o principal método de identificação metabolome. Em geral, a precisão da detecção de pico de metabólitos foi afetada por múltiplos fatores, como sinais sonoros de espectrometria de massa, baixa abundância de metabólitos, contaminantes e produtos de degradação de metabólitos20. Quando o número de amostras é muito grande ou a coluna de cromatografia líquida foi substituída em experimentos de metabolome não-alvo, podem aparecer efeitos notáveis em lote, o que é um grande desafio para a quantitação metabolome 21,22,23. Atualmente, softwares como XCMS24, Workflow4Metabolomic25, iMet-Q26 e metaX19 podem realizar detecção de pico e quantitação de metabolome não-alvo, mas sugerimos que o pipeline de metaX é mais completo e fácil de usar. Aqui, demonstramos o processo de identificação e controle de FDR para um conjunto de dados disponível publicamente msv000084112 usando XY-Meta, e o pico de detecção e quantificação de metabólitos usando metaX. Este fluxo de trabalho requer apenas dois grupos, e cada grupo precisa de pelo menos duas amostras. Os dados de espectro de MS/MS são necessários, independentemente da plataforma de espectrômetro de massa, modo de ionização, modo de carga e tipo de amostra, e podem suportar a normalização baseada em amostras e a normalização baseada em picos. Seguindo este exemplo, os pesquisadores podem realizar a identificação e quantificação metabolômica de forma fácil de lidar. O uso deste pipeline requer capacidade de programação R. Para ajudar o pesquisador sem qualquer conhecimento de programação, também desenvolvemos uma plataforma de análise em nuvem para análise metabolômica. Demonstramos essa plataforma de análise de nuvem em Material Suplementar 5.
Protocol
Representative Results
Discussion
O controle fdr de metabólitos não-alvo tem sido um grande desafio. Aqui, demonstramos um pipeline completo de análise metabolômica não-alvo em larga escala (qualitativa e quantitativa) com controle FDR. Isso reduz efetivamente os falsos positivos, que são muito comuns na análise de ESM.
Preparar uma biblioteca espectral de referência apropriada para o seu estudo é um ponto-chave. Uma identificação de MS/MS bem-sucedida e sensível requer não apenas algoritmos adequados de correspon…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho é apoiado pelo Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento de Chaves (2018YFC0910200/2017YFA0505001) e pelo Programa de P&D De Chaves de Guangdong (2019B0226001).
Materials
| GNPS | open source | n/a | https://gnps.ucsd.edu/ProteoSAFe/static/gnps-splash.jsp |
| XY-Meta | open source | n/a | https://github.com/DLI-ShenZhen/XY-Meta |
| metaX | open source | n/a | https://github.com/wenbostar/metaX |
| ProteoWizard | Free Download | 3.0.22116.18c918b-x86_64 | https://proteowizard.sourceforge.io/download.html |
| CHI.Client | Free Download | ndp48-x86-x64-allos-enu | http://www.chi-biotech.com/technology.html?ty=ypt |
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