光ピンセットとデフォーカス顕微鏡を用いた赤血球の粘弾性特性の定量的解析
Summary
ここでは、細胞のレオロジー特性を測定するための光ピンセットとデフォーカス顕微鏡に基づく統合プロトコルについて説明します。このプロトコルは、さまざまな生理病理学的条件下での赤血球の粘弾性特性の研究に広く適用できます。
Abstract
赤血球の粘弾性特性は、さまざまな技術によって研究されています。ただし、報告されている実験データはさまざまです。これは、細胞の正常な変動性だけでなく、細胞応答の方法とモデルの違いにも起因します。ここでは、光ピンセットとデフォーカス顕微鏡を使用した統合プロトコルを使用して、1Hz〜35Hzの周波数範囲で赤血球のレオロジー的特徴を取得します。光ピンセットは赤血球複合体弾性定数の測定に使用されますが、デフォーカス顕微鏡は、複雑な弾性定数を複雑なせん断弾性率に変換できるパラメータである細胞の高さプロファイル、体積、およびそのフォームファクターを取得できます。さらに、軟質ガラス状レオロジーモデルを適用すると、両方の弾性率に対するスケーリング指数が得られる。開発された方法論は、いくつかの生理学的および病理学的条件について、明確に定義された実験条件下で得られたそれらの粘弾性パラメータを特徴付ける、赤血球の機械的挙動を探索することを可能にする。
Introduction
赤血球としても知られる成熟赤血球(RBC)は、人体の最も狭い毛細血管を通過するときに、そのサイズが2倍以上伸びることができます1。そのような能力は、外部負荷を受けたときに変形するそれらの独特の能力に起因する。
近年、さまざまな研究がRBC表面2,3でこの特徴を特徴付けています。外部荷重による材料の弾性応答と粘性応答を記述する物理学の分野は、レオロジーと呼ばれます。一般に、外力が加えられると、結果として生じる変形は材料の特性に依存し、エネルギーを蓄える弾性変形とエネルギーを放散する粘性変形に分けることができます4。赤血球を含むすべての細胞は粘弾性挙動を示します。言い換えれば、エネルギーは蓄えられ、散逸されます。したがって、セルの粘弾性応答は、その複素せん断弾性率G*(ω)= G'(ω)+ iG“(ω)によって特徴付けることができ、ここでG’(ω)は弾性挙動に関連する貯蔵弾性率であり、G”(ω)はその粘度4に関連する損失弾性率である。さらに、現象論的モデルは細胞応答を記述するために使用されており、最も使用されているものの1つは、負荷周波数に対する複素せん断弾性率のべき乗則依存性を特徴とする軟質ガラス状レオロジーモデル5と呼ばれる。
単細胞ベースの方法は、力を加え、課せられた荷重の関数として変位を測定することにより、RBCの粘弾性特性を特徴付けるために採用されています2,3。しかし、複素せん断弾性率については、文献にはほとんど結果がありません。動的光散乱を用いて、RBC貯蔵および損失弾性率の値は、1〜100Hzの周波数範囲で0.01〜1Paの範囲で変化して報告された6。光磁気ツイストサイトメトリーを用いることにより、見かけの複素弾性率が得られ7、比較のために、おそらく不一致を明らかにするために乗法係数が主張されました。
最近では、時間依存的な負荷に対するヒト赤血球のせん断弾性率の貯蔵と損失を定量的にマッピングするための統合ツールとして、光ピンセット(OT)とデフォーカス顕微鏡(DM)に基づく新しい方法論が確立されました8,9。さらに、柔らかいガラス状のレオロジーモデルを使用して結果を適合し、赤血球8,9を特徴付けるべき乗則係数を取得しました。
全体として、以下に詳細に説明するプロトコルである開発された方法論8,9は、力と変形をRBC表面の応力とひずみに関連付けるフォームファクターFfの測定値を使用して以前の不一致を明らかにし、異なる血液を持つ個人から得られたRBCの粘弾性パラメータと柔らかいガラスの特徴を定量的に決定できる新しい診断方法として利用できます病理。以下に説明するプロトコルを用いたこのような特性評価は、メカノバイオロジーの観点から赤血球の挙動を理解するための新しい可能性を開く可能性があります。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルでは、赤血球の粘弾性特性を定量的にマッピングするために、光ピンセットとデフォーカス顕微鏡に基づく統合方法が提示されます。 貯蔵および損失せん断弾性率の結果は、RBCの柔らかいガラス状レオロジーを特徴付けるスケーリング指数とともに決定される。生理学的状況8 または 熱帯熱マラリア原虫 赤血球内サイクル9 の各段階…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、CENABIOの高度な顕微鏡施設のすべてのメンバーに、すべての重要な支援に感謝したいと思います。この作業は、ブラジルの機関であるコンセリョ・ナシオナル・デ・デセンボルビメント・シエンティフィコ・エ・テクノロジコ(CNPq)、COORDENAÇÃO de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) – Financial Code 001、Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ)、Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Fluidos Complexos(INCT-FCx)とFundação de Amparo de Pesquisa do Estado de São Paulo(FAPESP)の支援を受けました。B.P.はFAPERJからのJCNE助成金によって支援されました。
Materials
| 35mm culture dishes | Corning | 430165 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Coverslips | Knittel Glass | VD12460Y1A.01 and VD12432Y1A.01 | |
| Glass-bottom dishes | MatTek Life Sciences | P35G-0-10-C | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Immersion oil | Nikon | MXA22165 | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TE300 | |
| KaleidaGraph | Synergy Software | https://www.synergy.com/ | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Microscope camera | Hamamatsu | C11440-10C | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Neubauer chamber | Sigma-Aldrich | BR717805-1EA | |
| Objective lens | Nikon | PLAN APO 100X 1.4 NA DIC H; PLAN APO 60x 1.4 NA DIC H and Plan APO 10x XXNA PH2 | |
| Optical table | Thorlabs | T1020CK | |
| OT laser | IPG Photonics | YLR-5-1064-LP | |
| Polystyrene microspheres | Polysciences | 17134-15 | |
| rubber ring | Forever Seals | NBR O-Ring | |
| Silicone grease | Dow Corning | Z273554 | |
| Stage positioning | PI | P-545.3R8S | |
| Pipette | Gilson | P1000 |
Riferimenti
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