בדיקה ממוטבת של משיכה במולקולה בודדת לכימות של זרחון חלבונים
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר הכנת דגימה וניתוח נתונים לכימות זרחון חלבונים באמצעות מבחן משיכה משופר של מולקולה בודדת כלפי מטה (SiMPull).
Abstract
פוספורילציה היא שינוי פוסט-טרנסלציוני הכרחי המווסת את תפקוד החלבון ומכוון את תוצאות האיתות של התאים. השיטות הנוכחיות למדידת פוספורילציה של חלבונים אינן יכולות לשמר את ההטרוגניות בזרחון על פני חלבונים בודדים. הבדיקה של משיכה חד-מולקולה (SiMPull) פותחה כדי לחקור את ההרכב של קומפלקסים מקרומולקולריים באמצעות מיצוי חיסוני של חלבונים על מכסה זכוכית ולאחר מכן הדמיה של מולקולה אחת. הטכניקה הנוכחית היא התאמה של SiMPull המספקת כימות חזק של מצב הזרחון של קולטני ממברנה באורך מלא ברמת המולקולה הבודדת. הדמיה של אלפי קולטנים בודדים בדרך זו מאפשרת לכמת את דפוסי הזרחון של חלבונים. הפרוטוקול הנוכחי מפרט את הליך SiMPull הממוטב, מהכנת דגימה ועד הדמיה. אופטימיזציה של הכנת זכוכית ופרוטוקולי קיבוע נוגדנים משפרת עוד יותר את איכות הנתונים. הפרוטוקול הנוכחי מספק קוד לניתוח נתונים של מולקולה בודדת המחשב את חלקם של הקולטנים הזרחניים בתוך דגימה. בעוד שעבודה זו מתמקדת בזרחון של קולטן גורם הגדילה האפידרמלי (EGFR), ניתן להכליל את הפרוטוקול לקולטני ממברנה אחרים ולמולקולות איתות ציטוזוליות.
Introduction
איתות הקשור לממברנה מכוון על ידי שילוב של הפעלת קולטן ממברנה המושרה על ידי ליגנד וגיוס של חלבוני אביזר במורד הזרם המפיצים את האות. זרחון של טירוזינים מרכזיים בזנבות ציטופלסמיים של קולטנים הוא קריטי לייזום היווצרותם של קומפלקסי איתות, או איתותים 1,2. לכן, שאלה חשובה בביולוגיה היא כיצד דפוסי זרחון נוצרים ומתוחזקים כדי לגייס שותפים לאיתות ולהכתיב את התוצאות התאית. זה כולל את הבנת ההטרוגניות של זרחון הקולטן, הן בשפע והן בדפוסי הפוספוטירוזין הספציפיים שיכולים לספק אמצעי למניפולציה של יציאות איתות על ידי הכתבת הרכב האיתות 3,4,5,6,7. עם זאת, ישנן מגבלות בשיטות הנוכחיות לחקור זרחון חלבונים. ניתוח כתמים מערביים מצוין לתיאור מגמות של זרחון חלבונים, אך הוא כמותי למחצה8 ואינו מספק מידע על ההטרוגניות של המערכת מכיוון שאלפי עד מיליוני קולטנים ממוצעים יחד. בעוד שהכתמים המערביים מאפשרים לחקור דגימה באמצעות נוגדנים ספציפיים לפוספו לטירוזינים ספציפיים, הם אינם יכולים לספק מידע על דפוסי זרחון מרובי אתרים בתוך אותו חלבון. פוספופרוטומיקה כמותית מדווחת על שפע פוספוטירוזין, אך ישנן מגבלות לאיתור זרחון מרובה אתרים, שכן שאריות העניין צריכות להיות ממוקמות בתוך אותו פפטיד (בדרך כלל 7-35 חומצות אמינו) שנוצר על ידי עיכול אנזימטי 9,10,11.
כדי להתגבר על המגבלות שהוזכרו לעיל, בדיקת המשיכה של מולקולה אחת כלפי מטה (SiMPull) הותאמה לכימות מצבי הזרחון של קולטנים שלמים ברמת המולקולה הבודדת. SiMPull הוכח לראשונה ככלי רב עוצמה לחקירת קומפלקסים מקרומולקולריים על ידי Jain et al.12,13. ב-SiMPull, קומפלקסים מקרומולקולריים עברו מיצוי חיסוני (IP) על כיסויי זכוכית פונקציונליים של נוגדנים ולאחר מכן נותחו באמצעות מיקרוסקופיה של מולקולה בודדת עבור מספר תת-יחידה של חלבונים ו-CO-IP עם רכיבים מורכבים12. שינוי של Kim et al.14, המכונה SiMBlot, היה הראשון שהשתמש בווריאציה של SiMPull כדי לנתח פוספורילציה של חלבונים שעברו דנטורציה. פרוטוקול SiMBlot מסתמך על לכידת חלבוני פני השטח של התאים שעברו ביוטינילציה באמצעות כיסויים מצופים NeutrAvidin, אשר נבדקים לאחר מכן לזרחון עם תוויות נוגדנים ספציפיות לפוספו14. למרות ההתקדמות הזו, היה צורך בשיפורים כדי להפוך את הכימות של שינויים פוסט-טרנסלציוניים לחזק יותר וישים יותר למגוון רחב יותר של חלבונים.
הפרוטוקול הנוכחי מתאר גישת SiMPull אופטימלית ששימשה לכימות דפוסי זרחון של קולטן גורם גדילה אפידרמלי שלם (EGFR) בתגובה למגוון מצבי ליגנד ומוטציות אונקוגניות15. בעוד שעבודה זו מתמקדת ב- EGFR, ניתן ליישם גישה זו על כל קולטן ממברנה וחלבונים ציטוזוליים בעלי עניין (POI), שעבורם קיימים נוגדנים איכותיים. הפרוטוקול כולל שלבים להפחתת הפלואורסצנציה אוטומטית של דגימה, תכנון מערך דגימות הדורש נפח דגימה מינימלי עם הכנה סימולטנית של עד 20 דגימות, ואופטימיזציה של תווי תיוג נוגדנים ותנאי קיבוע. אלגוריתמים לניתוח נתונים פותחו לזיהוי וכימות של מולקולות בודדות של חלבונים זרחניים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול שתואר כאן הותאם כדי לאפשר מדידות כמותיות של זרחון הקולטן ברמת החלבון הבודד. פותחו מספר שינויים פשוטים אך חשובים בפרוטוקול SiMPull ששיפרו את אמינות המדידה לזיהוי פוספו-טירוזין, כולל הפחתת האוטו-פלואורסצנציה באמצעות טיפול ב-NaBH4 ופרסום הדגימה כדי למנוע דיסוציאציה של נוגדנים. שי…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות R35GM126934, R01AI153617, ו- R01CA248166 ל- DSL. EMB נתמך באמצעות תוכנית ASERT-IRACDA (NIH K12GM088021) ו- JAR על ידי תוכנית UNM MARC (NIH 2T34GM008751-20). אנו מודים על השימוש במשאב המשותף של מרכז הסרטן המקיף של אוניברסיטת ניו מקסיקו, הנתמך על ידי NIH P30CA118100. אנו רוצים להודות לד”ר אנקור ג’יין ולטאקיג’יפ הא, שהפיתוח המקורי שלהם של SiMPull היווה השראה לעבודה זו.
כתובת נוכחית של ES-C: קבוצת אימונודינמיקה, המעבדה לאימונולוגיה אינטגרטיבית של סרטן, המרכז לחקר הסרטן, המכון הלאומי לסרטן, בת’סדה
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | MTC Bio | C2000 | |
| 10 mM Tris-HCl pH 7.4 | |||
| 10 mM Tris-HCl pH 8.0/ 50 mM NaCl | T50 Buffer | ||
| 100 mm Tissue Culture dish | CELLTREAT | 229620 | Storage of piranha etched glass/arrays |
| 15 mL conical tube | |||
| 16% Paraformaldehyde Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Hazardous |
| 50 mL conical tube | Functionalized Glass storage/ KOH reuse | ||
| 50 mM Tris-HCl pH 7.2/150 mM NaCl | Lysis Buffer Component | ||
| 60 mm Tissue Culture dish | Corning | 430166 | |
| 8% Glutaraldehyde Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 16020 | Hazardous |
| Acetone (C3H6O) | Millipore Sigma | 270725 | Hazardous |
| Alexa Fluor 647 NHS Ester | Thermo Fisher Scientific | A-20006 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Anti-Human EGFR (External Domain) – Biotin | Leinco Technologies, Inc | E101 | |
| Anti-p-Tyr Antibody (PY99) Alexa Fluor 647 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7020 AF647 | |
| Bath-sonicator | Branson | 1200 | |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23227 | |
| Biotin-PEG | Laysan Bio | Biotin-PEG-SVA, MW 5,000 | |
| Bovine serum albumin | Gold Biotechnology | A-420-1 | Tyrode's Buffer Component |
| Buchner funnel | |||
| Bunsen burner | |||
| Calcium Chloride (CaCl2) | Millipore Sigma | C4901 | Tyrode's Buffer Component |
| Cell Scraper | Bioworld | 30900017-1 | |
| Conical Filtering Flask | Fisher Scientific | S15464 | |
| Coplin Jar | WHEATON | 900470 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Coverslips 24 x 60 #1.5 | Electron Microscopy Sciences | 63793 | |
| DipImage | https://diplib.org/ | ||
| DMEM | Caisson Labs | DML19-500 | |
| emCCD camera | Andor iXon | ||
| Fetal Bovine Serum, Optima | Bio-Techne | S12450H | Heat Inactivated |
| Fusion 360 software | Autodesk | ||
| Geneticin G418 Disulfate | Caisson Labs | G030-5GM | |
| Glacial Acetic Acid (CH3COOH) | JT Baker | JTB-9526-01 | Hazardous |
| Glass serological pipettes | |||
| Glass Stir Rod | |||
| Glucose (D-(+)-Glucose) | Millipore Sigma | D9434 | Tyrode's Buffer Component |
| Halt Phosphotase and Protease Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Fisher Scientific | 78446 | Lysis Buffer Component |
| HEPES | Millipore Sigma | H3375 | Tyrode's Buffer Component |
| Hydrochloric Acid (HCl) | VWR | BDH7204-1 | Hazardous |
| Hydrogen Peroxide (H2O2) (3%) | HX0645 | ||
| Hydrogen Peroxide (H2O2) (30%) | EMD Millipore | HX0635-2 | |
| Ice | |||
| IGEPAL CA-630 (NP-40) | Sigma Aldrich | I8896 | Lysis Buffer Component |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Immersol 518F immersion oil | Zeiss | 444960-0000-000 | |
| in-house vacuum line | |||
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-164 | |
| Magnessium Chloride Hexahydrate (MgCl2-6H2O) | MPBio | 2191421 | Tyrode's Buffer Component |
| Matlab | Mathworks | Curve Fitting Toolbox, Parallel Computing Toolbox, and Statistics and Machine Learning toolbox | |
| Methanol (CH3OH) | IBIS Scientific | MX0486-1 | Hazardous |
| Milli-Q water | |||
| Mix-n-Stain CF Dye Antibody Labeling Kits | Biotium | 92245 | Suggested conjugation kit |
| mPEG | Laysan Bio | mPEG-succinimidyl valerate, MW 5,000 | |
| N-(2-aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilane | UCT United Chemical | A0700 | Hazardous |
| Nanogrid | Miraloma Tech | ||
| NeutrAvidin Biotin Binding Protein | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
| Nitrogen (compressed gas) | |||
| NVIDIA GPU with CUDA | Look for compatibility at https://www.mathworks.com/help/parallel-computing/gpu-support-by-release.html | ||
| Olympus iX71 Microscope | Olympus | ||
| Parafilm M Sealing Film | The Lab Depot | HS234526C | |
| PBS pH 7.4 | Caisson Labs | PBL06 | |
| PC-200 Analog Hot Plate | Corning | 6795-200 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-163 | |
| Phospho-EGF Receptor (Tyr1068) (1H12) Mouse mAb | Cell Signaling Technology | 2236BF | |
| Potassium Chloride (KCl) | Millipore Sigma | 529552 | Tyrode's Buffer Component |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Millipore Sigma | 1050330500 | Hazardous |
| Premium PLA Filament, 1.75 mm diameter | Raise 3D | PMS:2035U/RAL:3028 | Printing temperature range: 205-235 °C |
| Pro2 3D printer | Raise 3D | ||
| Pyrex 1 L beaker | |||
| PYREX 100 mL storage bottles | Corning | 1395-100 | CH3OH/C3H6O reuse |
| Pyrex 250 mL beakers | |||
| Pyrex 4 L beaker | |||
| Quad-view Image Splitter | Photometrics | Model QV2 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | EP-5415R | |
| RevCount Cell Counters, EVE Cell Counting Slides | VWR | 10027-446 | |
| Semrock emission filters: blue (445/45 nm), green (525/45 nm), red (600/37 nm), far-red (685/40 nm) | Semrock | LF405/488/561/635-4X4M-B-000 | |
| Serological pipette controller | |||
| Serological Pipettes | |||
| smite single molecule analysis package | https://github.com/LidkeLab/smite.git | ||
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma Aldrich | S6014 | Hazardous |
| Sodium Borohydride (NaBH4) | Millipore Sigma | 452874 | Tyrode's Buffer Component |
| Sodium Chloride (NaCl) | Millipore Sigma | S9625 | Activate by successive heat and pH cycling |
| Sodium Hydroxide | VWR | BDH3247-1 | |
| Sodium Orthovanadate (Na3VO4) | Millipore Sigma | S6508 | Hazardous |
| Sulfuric Acid (H2SO4) | Millipore Sigma | 258105 | Hazardous |
| TetraSpeck Microspheres | Thermo Fisher Scientific | T7279 | multi-fluorescent beads |
| Tris (Trizma) base | Millipore Sigma | T1503 | |
| Trypan blue stain, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific | 25300120 |
Riferimenti
- Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell Signaling by Receptor Tyrosine Kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
- Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. Reading protein modifications with interaction domains. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (7), 473-483 (2006).
- Coba, M. P., et al. Neurotransmitters drive combinatorial multistate postsynaptic density networks. Science Signaling. 2 (68), (2009).
- Gibson, S. K., Parkes, J. H., Liebman, P. A. Phosphorylation modulates the affinity of light-activated rhodopsin for g protein and arrestin. Biochimica. 39 (19), 5738-5749 (2000).
- Stites, E. C., et al. Use of mechanistic models to integrate and analyze multiple proteomic datasets. Biophysical Journal. 108 (7), 1819-1829 (2015).
- Hause, R. J., et al. Comprehensive binary interaction mapping of SH2 domains via fluorescence polarization reveals novel functional diversification of ErbB receptors. PLOS ONE. 7 (9), 44471 (2012).
- Lau, E. K., et al. Quantitative encoding of the effect of a partial agonist on individual opioid receptors by multisite phosphorylation and threshold detection. Science Signaling. 4 (185), (2011).
- Mishra, M., Tiwari, S., Gomes, A. V. Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques. Expert Review of Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).
- Brunner, A. M., et al. Benchmarking multiple fragmentation methods on an orbitrap fusion for top-down phospho-proteoform characterization. Analytical Chemistry. 87 (8), 4152-4158 (2015).
- Swaney, D. L., Wenger, C. D., Coon, J. J. Value of using multiple proteases for large-scale mass spectrometry-based proteomics. Journal of Proteome Research. 9 (3), 1323-1329 (2010).
- Curran, T. G., Zhang, Y., Ma, D. J., Sarkaria, J. N., White, F. M. MARQUIS: A multiplex method for absolute quantification of peptides and posttranslational modifications. Nature Communications. 6 (1), 1-11 (2015).
- Jain, A., et al. Probing cellular protein complexes using single-molecule pull-down. Nature. 473 (7348), 484-488 (2011).
- Jain, A., Liu, R., Xiang, Y. K., Ha, T. Single-molecule pull-down for studying protein interactions. Nature Protocols. 7 (3), 445-452 (2012).
- Kim, K. L., et al. Pairwise detection of site-specific receptor phosphorylations using single-molecule blotting. Nature Communications. 7 (1), 1-10 (2016).
- Salazar-Cavazos, E., et al. Multisite EGFR phosphorylation is regulated by adaptor protein abundances and dimer lifetimes. Molecular Biology of the Cell. 31 (7), 695 (2020).
- Huyer, G., et al. Mechanism of inhibition of protein-tyrosine phosphatases by vanadate and pervanadate. Journal of Biological Chemistry. 272 (2), 843-851 (1997).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
- Keller, H. E. Objective lenses for confocal microscopy. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 145-161 (2006).
- Hendriks, C. L. L., van Vliet, L. J., Rieger, B., van Kempen, G. M. P., van Ginkel, M. . Dipimage: a scientific image processing toolbox for MATLAB. , (1999).
- fitgeotrans: Fit geometric transformation to control point pairs. The MathWorks Inc Available from: https://www.mathworks.com/images/ref/fitgeotrans.html (2013)
- Raghavachari, N., Bao, Y. P., Li, G., Xie, X., Müller, U. R. Reduction of autofluorescence on DNA microarrays and slide surfaces by treatment with sodium borohydride. Analytical Biochemistry. 312 (2), 101-105 (2003).
- Wang, X., Park, S., Zeng, L., Jain, A., Ha, T. Toward single-cell single-molecule pull-down. Biophysical Journal. 115 (2), 283-288 (2018).
- Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549 (2014).
