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Bioingegneria

광학 핀셋을 사용하여 액틴 필라멘트 번들에서 미오신 앙상블 역학 조사

Published: May 04, 2022
doi:
10.3791/63672
, , , ,
1Department of Chemical Engineering,University of Mississippi, 2Department of Biomedical Engineering,University of Mississippi

Summary

시험관 내에서 액토미오신 다발의 형성 및 광학 핀셋을 사용한 미오신 앙상블 힘 생성 측정이 제시되고 논의됩니다.

Abstract

미오신은 ATP를 가수분해하여 액틴 필라멘트(AF) 트랙을 따라 이동하는 운동 단백질이며 운동성 및 근육 수축과 같은 세포 과정에 필수적입니다. 힘 생성 메커니즘을 이해하기 위해 미오신 II는 단일 분자 (SM) 수준과 광학 트래핑과 같은 생물 물리학 적 방법을 사용하는 시험관 내 모터 팀으로 조사되었습니다.

이 연구는 미오신 힘 생성 거동이 3 비드 배열의 단일 분자 수준에서 글라이딩 배열의 단단한 비드 또는 커버 슬립 표면에서 함께 작동하는 모터 그룹으로 이동할 때 크게 다를 수 있음을 보여주었습니다. 그러나 이러한 분석 구조는 세포 내에서와 같이 점탄성 구조 계층 내에서 미오신의 그룹 역학을 평가하는 것을 허용하지 않습니다. 우리는 여러 액틴 필라멘트와 상호 작용하는 미오신 앙상블에 의한 힘 생성 메커니즘을 조사하기 위해 광학 핀셋을 사용하는 방법을 개발했습니다.

이러한 액토미오신 번들은 모터 통신 및 앙상블 힘 출력을 캡처하는 계층적이고 규정을 준수하는 환경에서 조사를 용이하게 합니다. 분석의 사용자 정의 가능한 특성을 통해 실험 조건을 변경하여 미오신 앙상블, 액틴 필라멘트 번들 또는 주변 환경에 대한 수정이 어떻게 다른 힘 출력을 초래하는지 이해할 수 있습니다.

Introduction

운동 단백질은 생명에 필수적이며 화학 에너지를 기계적 작업으로 변환합니다 1,2,3. 미오신 모터는 트랙과 유사한 필라멘트를 따라 단계를 밟아 액틴 필라멘트와 상호 작용하며, 액틴-미오신 네트워크의 역학은 근육 수축, 세포 운동성, 세포질 분열 중 수축 고리 및 세포 내부의화물 이동을 수행합니다. 3,4,5,6,7,8 . 미오신은 많은 필수 역할을 하기 때문에 미오신 액틴 네트워크의 기능 장애는 비대성 심근병증(HCM)에서 심장 과수축을 유발하는 미오신 중쇄의 돌연변이와 같은 질병 발병으로 이어질 수 있습니다.9,10,11,12,13,14 . 근육 수축에서 개별 미오신 모터는 AF 4,15,16,17,18의 상대 슬라이딩을 수행하는 데 필요한 기계적 에너지를 제공하기 위해 앙상블로 작동하여 서로 협력합니다. 미오신 모터는 AF 사이에 교차 다리를 형성하고 기계 화학적 주기로 인한 구조적 변화를 사용하여 정렬된 필라멘트17,18,19,20,21의 가시 끝을 향해 집합적으로 이동합니다.

광학 트래핑과 같은 기술을 사용하여 SM 수준에서 정량적 체외 운동성 분석을 개발함으로써 SM 힘 생성 및 스텝 크기 측정을 포함하여 개별 미오신 모터가 어떻게 작동하는지에 대한 전례 없는 세부 정보를 쉽게 수집할 수 있었습니다. 22,23,24,25,26,27,28,29,30 . Finer et al.은 단일 미오신 II 모터23,31의 힘 발생 역학을 조사하기 위해 “3-비드” 또는 “덤벨” 광학 트래핑 분석을 개발했습니다. 근육 미오신 II는 AF를 수축시키기 위해 팀으로 작동하지만 SM 수준에서는 비과정적이기 때문에 광학 트래핑 분석 방향은 고전적인 모터 결합 비드 접근법(32)으로부터 재배열되어야 했습니다. 덤벨 분석을 형성하기 위해, 커버슬립-부착된 비드에 결합된 미오신 모터 위에 AF를 유지하기 위해 2개의 광학 트랩을 사용하였고, 단일 모터에 의해 출력된 힘은 트랩(23) 내의 AF의 이동을 통해 측정되었다.

그러나 SM 힘과 단일 모터 / 단일 필라멘트 분석 방향을 사용하면 myosin II를 포함한 많은 모터 단백질이 단독으로 작동하지 않고 종종 부분의 합으로 기능하지 않기 때문에 시스템 수준 힘 생성에 대한 전체 이미지를 제공하지 않습니다 15,16,17,32,33,34,35,36 . 하나 이상의 필라멘트와 상호 작용하는 하나 이상의 모터를 포함하는 더 복잡한 구조는 미오신 및 액틴 필라멘트의 네트워크(15,32)의 시너지 효과를 더 잘 이해하는 데 필요합니다. 덤벨 분석 방향은 비드에 여러 개의 미오신을 부착하거나 표면에 부착된 미오신 두꺼운 필라멘트를 사용하여 모터가 매달린 AF 4,23,34,37,38,39,40과 상호 작용할 수 있도록 함으로써 작은 앙상블 힘 생성을 조사하는 데 활용되었습니다.

다른 작은 앙상블 분석에는 미오신 모터가 커버슬립 표면에 코팅되고 AF에 결합된 비드가 모터 4,35,36,38,39,40,41,42,43 팀에 의해 생성된 힘을 프로브하는 시험관 내 필라멘트 글라이딩 분석이 포함됩니다. . 이 두 경우 모두 미오신은 단단한 표면(비드 또는 커버슬립)에 결합되어 하나의 AF를 사용합니다. 이러한 경우들에서, 모터들은 자유롭게 움직일 수 없거나 서로 통신할 수 없으며, 근육신이 단단히 결합된 것은 모터들이 sarcomere32에서 함께 동작할 수 있는 순응적이고 계층적인 환경을 반영하지 않는다. 이전 연구에서는 미오신 II가 환경을 감지하고 힘 생성 및 듀티 비율41,44,45와 같은 특성을 변경하여 변화하는 점탄성 또는 모터 집중 조건에 따라 적응할 수 있다고 제안했습니다. 따라서 미오신 II 앙상블 힘 생성의 기계론적 토대에 대한 보다 현실적인 그림을 그리기 위해 모터 통신 및 시스템 준수를 촉진하고 캡처하는 광학 트래핑 분석을 개발할 필요가 있습니다.

여기에서는 두 액틴 필라멘트 사이에 상호 작용하는 여러 개의 미오신 모터로 구성된 액토미오신 다발 또는 샌드위치를 형성하여 시험관 내 계층 구조와 광학 트래핑을 결합하는 방법을 개발했습니다. 이 모듈식 분석 기하학은 분자 및 환경 요인이 앙상블 미오신 힘 생성에 어떻게 영향을 미치는지 직접 조사할 수 있습니다. 또한 이러한 액틴-미오신 앙상블을 통한 힘 생성 메커니즘을 조사하면 근육 수축과 같은 대규모 세포 작업이 분자 수준 9,10,13에서 어떻게 전파되는지 모델링하고 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다.

Protocol

1. 에칭 커버슬립 1,000mL 비커에 100% 에탄올 300mL에 KOH 100g을 녹입니다. 대부분의 KOH가 녹을 때까지 교반 막대로 저어줍니다.주의 : 농축 KOH 용액은 화상을 입거나 의복을 손상시킬 수 있습니다. 장갑, 보안경 및 실험실 코트를 착용하십시오. 커버슬립을 커버슬립 청소용 랙에 개별적으로 놓습니다.알림: 랙은 커버슬립의 각 면, 바닥의 배수구에서 에칭 및 헹굼이 가?…

Representative Results

액토미오신 번들 시스템을 포함하는 플로우 셀은 현미경 슬라이드와 양면 접착 테이프로 만든 채널로 분리된 에칭된 커버슬립으로 구성된 표준 설계입니다(그림 1). 그런 다음 분석은 프로토콜에 설명된 대로 단계적 소개를 사용하여 커버슬립에서 구축됩니다. 최종 분석은 주형 로다민 표지 액틴 필라멘트로 구성됩니다. 원하는 미오신 농도 (1 μM이 도 2</stron…

Discussion

액틴 필라멘트와 상호 작용하는 미오신 앙상블의 역학을 조사하기 위해 형광 이미징과 결합된 광학 핀셋을 사용한 시험관 내 연구가 수행되었습니다. 악틴-미오신 – 액틴 다발은 근육 미오신 II, 번들의 하단 및 커버 슬립 표면의 로다민 액틴, 번들 상단의 488 표지 된 비오틴 액틴 필라멘트를 사용하여 조립되었습니다. 토끼 근육으로부터의 액틴 단백질은 일반 액틴 완충액 (GAB) 및 액틴 중합…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작업은 미시시피 대학교 대학원 학생위원회 연구 펠로우십 (OA), 미시시피 대학교 샐리 맥도넬-바크스데일 아너스 칼리지 (JCW, JER), 보조금 번호 NNX15AH78H (JCW, DNR)의 미시시피 우주 보조금 컨소시엄 및 보조금 번호 848586 (DNR)의 미국 심장 협회.

Materials

Actin protein (biotin): skeletal muscle Cytoskeleton AB07-A Biotinylated actin protein
Actin protein, rabbit skeletal muscle Cytoskeleton AKL99-A Actin protein
Alexa Fluor 488 Phalloidin Invitrogen A12379 Actin stabilizer and Alexa Fluor 488 stain
ATP Fisher scientific BP413-25 Required for actin assembly and myosin motility
Beta-D-glucose Fisher scientific MP218069110 Part of oxygen scavenging system used to reduce photobleaching during fluorescence imaging
Blotting Grade Blocker (casein) Biorad 1706404 Used to block surface from non-specific binding
CaCl2 Fisher scientific C79500 Calcium chloride, provides the necessary control over the dynamics of actin myosin network
Catalase Fisher scientific ICN10040280 Part of oxygen scavenging system used to reduce photobleaching during fluorescence imaging
Coverslips Fisher scientific 12544C Used to make flow cells
DTT Fisher scientific AC327190010 Used for buffer preparation
Ethanol Fisher scientific A4094 Regent used for cleaning coverslips
Glucose oxidase Fisher scientific 34-538-610KU Part of oxygen scavenging system used to reduce photobleaching during fluorescence imaging
KCl Fisher scientific P217-500 Used for buffer preparation
KOH Fisher scientific P250-1 Used to etch coverslips and adjust buffer pH
MgCl2 Fisher scientific M33-500 Used for buffer preparation
Microscope slides Fisher scientific 12-544-2 Used to make flow cells
Myosin II protein: rabbit skeletal muscle Cytoskeleton MY02 Full length myosin motor protein isolated from rabbit skeletal muscle
Nanotracker2 Bruker/JPK NT2 Optical trapping instrument
Poly-l-lysine Sigma-Aldrich P8920 Facilities adhesion of actin filaments onto glass surface of the coverslip
Rhodamine Phalloidin Cytoskeleton PHDR1 Actin stabilizer and rhodamine fluorescent stain
Streptavidin beads, 1 μm Spherotech SVP-10-5 Optical trapping handle
Tris-HCl Fisher scientific PR H5121 Used for buffer preparation
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Riferimenti

  1. Goldstein, L. S. Kinesin molecular motors: transport pathways, receptors, and human disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (13), 6999-7003 (2001).
  2. Lee Sweeney, H., Holzbaur, E. L. F. Motor proteins. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (5), 021931 (2018).
  3. O’Connell, C. B., Tyska, M. J., Mooseker, M. S. Myosin at work: Motor adaptations for a variety of cellular functions. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Cell Research. 1773 (5), 615-630 (2007).
  4. Kaya, M., Tani, Y., Washio, T., Hisada, T., Higuchi, H. Coordinated force generation of skeletal myosins in myofilaments through motor coupling. Nature Communications. 8, 1-13 (2017).
  5. Akhshi, T. K., Wernike, D., Piekny, A. Microtubules and actin crosstalk in cell migration and division. Cytoskeleton. 71 (1), 1-23 (2014).
  6. Brawley, C. M., Rock, R. S. Unconventional myosin traffic in cells reveals a selective actin cytoskeleton. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (24), 9685-9690 (2009).
  7. Hartman, M. A., Spudich, J. A. The myosin superfamily at a glance. Journal of Cell Science. 125 (7), 1627-1632 (2012).
  8. Spudich, J. A., et al. Myosin structure and function. Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology. 60, 783-791 (1995).
  9. Sommese, R. F., et al. Molecular consequences of the R453C hypertrophic cardiomyopathy mutation on human β-cardiac myosin motor function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12607-12612 (2013).
  10. Nag, S., et al. The myosin mesa and the basis of hypercontractility caused by hypertrophic cardiomyopathy mutations. Nature Structural & Molecular Biology. 24 (6), 525-533 (2017).
  11. Kawana, M., Sarkar, S. S., Sutton, S., Ruppel, K. M., Spudich, J. A. Biophysical properties of human b-cardiac myosin with converter mutations that cause hypertrophic cardiomyopathy. Science Advances. 3 (2), 1-11 (2017).
  12. Girolami, F., et al. Novel α-actinin 2 variant associated with familial hypertrophic cardiomyopathy and juvenile atrial arrhythmias: A massively parallel sequencing study. Circulation: Cardiovascular Genetics. 7 (6), 741-750 (2014).
  13. Debold, E. P., et al. Hypertrophic and dilated cardiomyopathy mutations differentially affect the molecular force generation of mouse α-cardiac myosin in the laser trap assay. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 293 (1), 284-291 (2007).
  14. Barron, J. T. Hypertrophic cardiomyopathy. Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 1 (3), 277-282 (1999).
  15. Duke, T. A. J. Molecular model of muscle contraction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (6), 2770-2775 (1999).
  16. Vilfan, A., Duke, T. Instabilities in the transient response of muscle. Biophysical Journal. 85 (2), 818-827 (2003).
  17. Huxley, A. F. Muscle structure and theories of contraction. Progress in Biophysics and Biophysical Chemistry. 7, 255-318 (1957).
  18. Huxley, H. E. Fifty years of muscle and the sliding filament hypothesis. European Journal of Biochemistry. 271 (8), 1403-1415 (2004).
  19. Kad, N. M., Kim, S., Warshaw, D. M., VanBuren, P., Baker, J. E. Single-myosin crossbridge interactions with actin filaments regulated by troponin-tropomyosin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (47), 16990-16995 (2005).
  20. Veigel, C., Molloy, J. E., Schmitz, S., Kendrick-Jones, J. Load-dependent kinetics of force production by smooth muscle myosin measured with optical tweezers. Nature Cell Biology. 5 (11), 980-986 (2003).
  21. Spudich, J. A. The myosin swinging cross-bridge model. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 2, 387-392 (2001).
  22. Simmons, R. M., Finer, J. T., Chu, S., Spudich, J. A. Quantitative measurements of force and displacement using an optical trap. Biophysical Journal. 70 (4), 1813-1822 (1996).
  23. Finer, J. T., Simmons, R. M., Spudich, J. Single myosin molecule mechanics: piconewton forces and nanometre steps. Nature. 368 (6467), 113-119 (1994).
  24. Kron, S. J., Uyeda, T. Q. P., Warrick, H. M., Spudich, J. A. An approach to reconstituting motility of single myosin molecules. Journal of Cell Science. 98, 129-133 (1991).
  25. Molloy, J. E., Burns, J. E., Kendrick-Jones, B., Tregear, R. T., White, D. C. S. Movement and force produced by a single myosin head. Nature. 378 (6553), 209-212 (1995).
  26. Ruegg, C., et al. Molecular motors: Force and movement generated by single Myosin II molecules. Physiology. 17 (5), 213-218 (2002).
  27. Nayak, A., et al. Single-molecule analysis reveals that regulatory light chains fine-tune skeletal myosin II function. Journal of Biological Chemistry. 295 (20), 7046-7059 (2020).
  28. Dupuis, D. E., Guilford, W. H., Wu, J., Warshaw, D. M. Actin filament mechanics in the laser trap. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 18 (1), 17-30 (1997).
  29. Tyska, M. J., et al. Two heads of myosin are better than one for generating force and motion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (8), 4402-4407 (1999).
  30. Tyska, M. J., Warshaw, D. M. The myosin power stroke. Cell Motility and the Cytoskeleton. 51 (1), 1-15 (2002).
  31. Finer, J. T., et al. Characterization of single actin-myosin interactions. Biophysical Journal. 68, 291-296 (1995).
  32. Al Azzam, O., Trussell, C. L., Reinemann, D. N. Measuring force generation within reconstituted microtubule bundle assemblies using optical tweezers. Cytoskeleton. 78 (3), 111-125 (2021).
  33. Wagoner, J. A., Dill, K. A. Evolution of mechanical cooperativity among myosin II motors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (20), 2101871118 (2021).
  34. Walcott, S., Warshaw, D. M., Debold, E. P. Mechanical coupling between myosin molecules causes differences between ensemble and single-molecule measurements. Biophysical Journal. 103 (3), 501-510 (2012).
  35. Stewart, T. J., Murthy, V., Dugan, S. P., Baker, J. E. Velocity of myosin-based actin sliding depends on attachment and detachment kinetics and reaches a maximum when myosin-binding sites on actin saturate. Journal of Biological Chemistry. 297 (5), 101178 (2021).
  36. Hilbert, L., Cumarasamy, S., Zitouni, N. B., Mackey, M. C., Lauzon, A. M. The kinetics of mechanically coupled myosins exhibit group size-dependent regimes. Biophysical Journal. 105 (6), 1466-1474 (2013).
  37. Debold, E. P., Walcott, S., Woodward, M., Turner, M. A. Direct observation of phosphate inhibiting the Force-generating capacity of a miniensemble of myosin molecules. Biophysical Journal. 105 (10), 2374-2384 (2013).
  38. Kaya, M., Higuchi, H. Nonlinear elasticity and an 8-nm working stroke of single myosin molecules in myofilaments. Science. 329 (5992), 686-689 (2010).
  39. Pertici, I., et al. A myosin II nanomachine mimicking the striated muscle. Nature Communications. 9 (1), 1-10 (2018).
  40. Cheng, Y. S., De Souza Leite, F., Rassier, D. E. The load dependence and the force-velocity relation in intact myosin filaments from skeletal and smooth muscles. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 318 (1), 103-110 (2020).
  41. Stam, S., Alberts, J., Gardel, M. L., Munro, E. Isoforms confer characteristic force generation and mechanosensation by myosin II filaments. Biophysical Journal. 108 (8), 1997-2006 (2015).
  42. Rastogi, K., Puliyakodan, M. S., Pandey, V., Nath, S., Elangovan, R. Maximum limit to the number of myosin II motors participating in processive sliding of actin. Scientific Reports. 6, 1-11 (2016).
  43. Debold, E. P., Patlak, J. B., Warshaw, D. M. Slip sliding away: Load-dependence of velocity generated by skeletal muscle myosin molecules in the laser trap. Biophysical Journal. 89 (5), 34-36 (2005).
  44. Albert, P. J., Erdmann, T., Schwarz, U. S. Stochastic dynamics and mechanosensitivity of myosin II minifilaments. New Journal of Physics. 16, (2014).
  45. Erdmann, T., Schwarz, U. S. Stochastic force generation by small ensembles of myosin II motors. Physical Review Letters. 108 (18), 1-5 (2012).
  46. Guo, B., Guilford, W. H. The tail of myosin reduces actin filament velocity in the in vitro motility assay. Cell Motility and the Cytoskeleton. 59 (4), 264-272 (2004).
  47. Miller-Jaster, K. N., Petrie Aronin, C. E., Guilford, W. H. A quantitative comparison of blocking agents in the in vitro motility assay. Cellular and Molecular Bioengineering. 5 (1), 44-51 (2012).
  48. Mansoon, A., Balaz, M., Albet-Torres, N., Rosengren, K. J. In vitro assays of molecular motors — impact of motor-surface interactions. Frontiers in Bioscience. 13, 5732-5754 (2008).
  49. Persson, M., et al. Heavy meromyosin molecules extending more than 50 nm above adsorbing electronegative surfaces. Langmuir. 26 (12), 9927-9936 (2010).
  50. Kron, S. J., Spudich, J. A. Fluorescent actin filaments move on myosin fixed to a glass surface. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (17), 6272-6276 (1986).
  51. Yanagida, T., Nakase, M., Nishiyama, K., Oosawa, F. Direct observation of motion of single F-actin filaments in the presence of myosin. Nature. 307 (5946), 58-60 (1984).
  52. Tsuda, Y., Yasutake, H., Ishijima, A., Yanagida, T. Torsional rigidity of single actin filaments and actin-actin bond breaking force under torsion measured directly by in vitro micromanipulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (23), 12937-12942 (1996).
  53. Stewart, T. J., et al. Actin sliding velocities are influenced by the driving forces of actin-myosin binding. Cellular and Molecular Bioengineering. 6 (1), 26-37 (2013).
  54. Harada, Y., Sakurada, K., Aoki, T., Thomas, D. D., Yanagida, T. Mechanochemical coupling in actomyosin energy transduction by in vitro movement assay. Journal of Molecular Biology. 216 (1), 49-68 (1990).
  55. Fordyce, P. M., Valentine, M. T., Block, S. M. Advances in surface-based assays for single molecules. Single-Molecule Techniques: A Laboratory Manual. , 431-460 (2008).
  56. Ozeki, T., et al. Surface-bound casein modulates the adsorption and activity of kinesin on SiO2 surfaces. Biophysical Journal. 96 (8), 3305-3318 (2009).
  57. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: Optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
  58. Neuman, K. C., Block, S. M. Optical trapping. Review of Scientific Instruments. 75 (9), 2787-2809 (2004).
  59. Thoresen, T., Lenz, M., Gardel, M. L. Thick filament length and isoform composition determine self-organized contractile units in actomyosin bundles. Biophysical Journal. 104 (3), 655-665 (2013).
  60. Matusovsky, O. S., et al. Millisecond conformational dynamics of skeletal Myosin II power stroke studied by high-speed atomic force microscopy. ACS Nano. 15 (2), 2229-2239 (2021).
  61. Reinemann, D. N., et al. Collective force regulation in anti-parallel microtubule gliding by dimeric Kif15 kinesin motors. Current Biology. 27 (18), 2810-2820 (2017).
  62. Cordova, J. C., et al. Bioconjugated core-shell microparticles for high-force optical trapping. Particle and Particle Systems Characterization. 35 (3), 1-8 (2018).
  63. Reinemann, D. N., Norris, S. R., Ohi, R., Lang, M. J. Processive Kinesin-14 HSET exhibits directional flexibility depending on motor traffic. Current Biology. 28 (14), 2356-2362 (2018).
  64. Forth, S., Hsia, K. C., Shimamoto, Y., Kapoor, T. M. Asymmetric friction of nonmotor MAPs can lead to their directional motion in active microtubule networks. Cell. 157 (2), 420-432 (2014).
  65. Shimamoto, Y., Kapoor, T. M. Analyzing the micromechanics of the cell division apparatus. Methods in Cell Biology. 145, 173-190 (2018).
  66. Shimamoto, Y., Forth, S., Kapoor, T. M. Measuring pushing and braking forces generated by ensembles of Kinesin-5 crosslinking two microtubules. Developmental Cell. 34 (6), 669-681 (2015).
  67. Thoresen, T., Lenz, M., Gardel, M. L. Reconstitution of contractile actomyosin bundles. Biophysical Journal. 100 (11), 2698-2705 (2011).
  68. Murrell, M., Thoresen, T., Gardel, M. Reconstitution of contractile actomyosin arrays. Methods in Enzymology. 540 (11), 265-282 (2014).
  69. Weirich, K. L., Stam, S., Munro, E., Gardel, M. L. Actin bundle architecture and mechanics regulate myosin II force generation. Biophysical Journal. 120 (10), 1957-1970 (2021).

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Al Azzam, O., Watts, J. C., Reynolds, J. E., Davis, J. E., Reinemann, D. N. Probing Myosin Ensemble Mechanics in Actin Filament Bundles Using Optical Tweezers. J. Vis. Exp. (183), e63672, doi:10.3791/63672 (2022).
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