Isolement de l’artère intrapulmonaire et des cellules musculaires lisses pour étudier les réponses vasculaires
Summary
Les réponses vasculaires de la circulation pulmonaire artérielle peuvent être explorées à l’aide de l’artère intrapulmonaire (API) et des cellules musculaires lisses vasculaires (VSMC). La présente étude décrit en détail l’isolement de l’IPA et les protocoles utilisés pour étudier la vasorelaxation en réponse à des stimuli physiologiques.
Abstract
L’artère intrapulmonaire (API) et les cellules musculaires lisses vasculaires (VSMC) isolées des poumons de rat peuvent être utilisées pour étudier les mécanismes sous-jacents de la vasoconstriction et de la vasorelaxation. Après avoir isolé l’IPA et les VSMC, les caractéristiques des réponses vasculaires dans des conditions physiologiques et pathologiques peuvent être évaluées en l’absence de facteurs extrinsèques tels que les signaux nerveux, les hormones, les cytokines, etc. Ainsi, l’IPA et les VSMC sont d’excellents modèles pour l’étude de la physiologie/physiopathologie vasculaire, ainsi que diverses investigations expérimentales, telles que la modulation par des agents pharmacologiques, l’analyse électrophysiologique patch-clamp, l’imagerie calcique, etc. Ici, nous avons utilisé une technique pour isoler l’API afin d’étudier les réponses vasculaires dans une configuration de bain d’organes. Des segments d’IPA ont été montés sur la chambre du bain d’organes via des fils intraluminaux et stimulés par divers agents pharmacologiques. Les changements dans le tonus vasculaire de l’API (c.-à-d. vasoconstriction et vasorelaxation) ont été enregistrés à l’aide d’un transducteur de force isométrique et d’un logiciel d’analyse de données physiologiques. Nous avons mis en place plusieurs protocoles expérimentaux, qui peuvent être adaptés pour étudier les mécanismes de vasorelaxation/vasoconstriction pour étudier les activités pharmacologiques des médicaments phytochimiques ou synthétiques. Les protocoles peuvent également être utilisés pour évaluer le rôle des médicaments dans la modulation de diverses maladies, y compris l’hypertension artérielle pulmonaire. Le modèle IPA nous permet d’étudier la courbe concentration-réponse, ce qui est crucial pour évaluer les paramètres pharmacodynamiques des médicaments.
Introduction
Le système vasculaire pulmonaire est un système vasculaire à basse pression dont la fonction principale est de fournir du sang désoxygéné à la zone d’échange de gaz des poumons. Les artères pulmonaires dans les poumons sont disposées en branches parallèles à l’arbre bronchique, formant finalement un vaste réseau de capillaires qui est continu sur plusieurs alvéoles et, enfin, se rejoignant en veinules et veines. Le tonus vasculaire de l’artère pulmonaire est contrôlé par plusieurs facteurs, impliquant l’interaction entre l’endothélium et les cellules musculaires lisses vasculaires (VSMC)1.
Dans cette étude, nous nous concentrons sur la vasorelaxation dépendante et indépendante de l’endothélium de l’artère intrapulmonaire (API). En ce qui concerne la vasorelaxation dépendante de l’endothélium, divers mécanismes se produisant à la surface des cellules endothéliales pourraient augmenter la concentration intracellulaire de Ca2+ (p. ex., l’acétylcholine [ACh] se lie au récepteur muscarinique [M3]), conduisant à la formation d’oxyde nitrique (NO), de prostacycline (PGl2) et de facteur hyperpolarisant dérivé de l’endothélium (EDHF) (Figure 1 ). Le NO est le principal facteur de relaxation dérivé de l’endothélium synthétisé à partir de la L-arginine par l’oxyde nitrique synthase endothéliale (eNOS)2, qui se dissocie ensuite des cellules endothéliales en VSMC (Figure 1) et stimule l’enzyme soluble guanylyl cyclase (sGC) ; cette enzyme transforme la guanosine triphosphate (GTP) en guanosine monophosphate cyclique (GMPc), qui active la protéine kinase G (PKG) et réduit les niveaux cytosoliques de Ca2+, provoquant ainsi une vasorelaxation (Figure 1). PGl2 est synthétisé par les cellules endothéliales via la voie cyclo-oxygénase (COX) 3,4. Il se lie au récepteur de la prostacycline (IP) sur les VSMC et stimule l’enzyme adénylyl cyclase (AC), qui convertit ensuite l’adénosine triphosphate (ATP) en adénosine monophosphate cyclique (AMPc) (Figure 1)3,4. L’AMPc active la protéine kinase A (PKA), réduisant les taux cytosoliques de Ca2+ et provoquant une vasorelaxation5 (Figure 1). La voie EDHF participe également à la vasorelaxation dépendante de l’endothélium via divers médiateurs endothéliaux et événements électriques. L’activation de la voie EDHF conduit à l’hyperpolarisation des VSMC, fermant ainsi les canaux Ca 2+ (VOCC) actionnés par tension, réduisant les niveaux intracellulaires de Ca 2+ et induisant une vasorelaxation 6. La vasorelaxation indépendante de l’endothélium se produit directement sur les VSMC via plusieurs mécanismes, tels que la réduction du niveau intracellulaire de Ca 2+, l’inhibition de la myosine light chain kinase (MLCK), l’activation de la myosine phosphatase à chaîne légère (MLCP) et la réduction de la sensibilité Ca2+ à la machinerie contractile des VSMC. Dans cette étude, nous nous concentrons sur la vasorelaxation causée par l’ouverture de divers canaux K+, le blocage des VOCC et l’inhibition de la libération de Ca 2+ par le réticulum sarcoplasmique7, ce qui conduit à la réduction des niveaux intracellulaires de Ca 2+, diminuant ainsi la phosphorylation de la chaîne légère de la myosine VSMC et la liaison myosine-actine ou la formation de ponts croisés, respectivement, aboutissant finalement à une vasorelaxation.
La technique d’évaluation des mesures de vasoconstriction et de vasorelaxation dans l’IPA isolé est bien établie pour les rongeurs, mais les données variaient selon les protocoles expérimentaux. La présente étude décrit la méthode utilisée pour évaluer les réactivités vasculaires de préparations IPA in vitro de rat, qui ont été réalisées en l’absence de facteurs externes modulant la réponse vasculaire in vivo, tels que les signaux nerveux, les hormones, les cytokines, la pression artérielle, etc.
Nous avons utilisé plusieurs protocoles expérimentaux utilisant l’extrait de plante comme exemple pour étudier les réactivités vasculaires de l’API. Différents bloqueurs (Figure 1) ont été utilisés pour identifier les mécanismes de vasorelaxation dépendante et indépendante de l’endothélium induite par l’extrait de plante. Néanmoins, les mêmes protocoles peuvent être adaptés pour évaluer les réponses vasculaires de l’IPA à tout médicament, extrait ou phytochimique utilisé pour le traitement de diverses pathologies pulmonaires.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce manuscrit, nous décrivons la technique d’isolement des rats IPA et des VSMC. Plusieurs protocoles expérimentaux ont été utilisés pour étudier la réponse vasculaire de l’IPA in vitro, qui peut être utilisée pour caractériser l’effet pharmacologique et la base mécaniste de la vasorelaxation IPA induite par l’extrait de plante.
En ce qui concerne l’action vasodilatatrice dépendante de l’endothélium de l’extrait de plante, divers bloqueurs tels que L-NAM…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier le Conseil national de recherches de Thaïlande, le Centre d’excellence pour l’innovation en chimie (PERCH-CIC) et le Réseau international de recherche (IRN61W0005) pour leur soutien financier, ainsi que le Département de physiologie de la Faculté des sciences médicales de l’Université de Naresuan pour le soutien aux installations de recherche.
Materials
| 1,4-dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D0632 CAS NO. 348-12-3 |
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| 4-aminopyridine (4-AP) | Aldrich Chemical | A78403 CAS NO. 504-24-5 |
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| Acetylcholine | Sigma-Aldrich | A6625 CAS NO. 60-31-1 |
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| Apamin | Sigma-Aldrich | A9459 CAS NO. 24345-16-2 |
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| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 CAS NO. 9048-46-8 |
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| Calcium choride | Ajax Finechem | AJA960 CAS NO. 1707055184 |
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| Charybdotoxin | Sigma-Aldrich | C7802 CAS NO. 95751-30-7 |
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| Collagenase type 1A | Sigma-Aldrich | C9891 CAS NO. 9001-12-1 |
From Clostridium histolyticum |
| D(+)-Glucose monohydrate | Millipore Corporation | K50876942 924 CAS NO. 14431-43-7 |
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| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D4540 CAS NO. 67-68-5 |
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| Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 CAS NO. 67-42-5 |
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| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 CAS NO. 60-00-4 |
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| Forceps 11 cm. | Rustless Dumoxel | – | |
| Forceps 14 cm. | Rustless Dumoxel | – | |
| Glibenclamide | Sigma-Aldrich | G6039 CAS NO. 16673-34-0 |
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| GraphPad Prism program | Software version 5.0 (San Diego, CA, USA) | ||
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 CAS NO. 7365-45-9 |
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| Iberiotoxin | Sigma-Aldrich | I5904 CAS NO. 1002546960 |
recombinant from Mesobuthus tamulus |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 CAS NO. 53-86-1 |
|
| Labchart Program | Software version 7.0 (A.D. Instrument, Castle Hill, Australia). | ||
| Magnesium chloride | Ajax Finechem | 296 CAS NO. 1506254995 |
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| Male Wistar rats | Nomura Siam International Co. Ltd., Bangkok, Thailand | ||
| NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) | Sigma-Aldrich | N5751 CAS NO. 51298-62-5 |
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| Nicardipine | Sigma-Aldrich | N7510 CAS NO. 54527-84-3 |
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| Organ bath 15 mL. | – | – | Specific order by the researchers |
| Papain | Sigma-Aldrich | P4762 CAS NO. 9001-73-4 |
FromPapaya Latex |
| Phenal red | Sigma-Aldrich | P5530 CAS NO. 34487-61-1 |
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| Phenylephrine | Sigma-Aldrich | P6126 CAS NO. 61-76-7 |
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| Potassium chloride | Kemaus | KA383 CAS NO. 7447-40-7 |
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| Potassium dihydrogenphosphate | Aldrich Chemical | EC231-913-4 CAS NO. 7778-77-0 |
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| S+A2:E36odium chloride | Kemaus | KA465 CAS NO. 7647-14-5 |
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| Scissors 11 cm. | Spall Stainless | – | |
| Scissors 14 cm. | Spall Stainless | – | |
| Sodium bicarbonate | Ajax Finechem | 475 CAS NO. 912466 |
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| Sodium dihydrogenphosphate | Aldrich Chemical | 33,198-8 CAS NO. 7558-80-7 |
|
| Sodium hydroxide | Ajax Finechem | 482 CAS NO. 1506196602 |
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| Sodium thiopental | Anesthal | JPN3010002 CAS NO. 1C 314/47 |
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| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 CAS NO. 107-35-7 |
|
| Waterbath WBU 45 | Memmert | 2766 CAS NO. – |
Riferimenti
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