Summary
We beschrijven een protocol voor de isolatie van mesenchymale stamcellen uit menselijk navelstrengweefsel en hun differentiatie in de skeletspierlijn.
Abstract
Het verkennen van het therapeutisch potentieel van mesenchymale stamcellen is afhankelijk van het gemak van isolatie, de potentie voor differentiatie en de betrouwbaarheid en robuustheid van de bron. We beschrijven hier een stapsgewijs protocol voor de isolatie van mesenchymale stamcellen uit menselijk navelstrengweefsel (uMSCs), hun immunofenotypering en de voortplanting van dergelijke culturen over verschillende passages. In deze procedure is de levensvatbaarheid van de uMSCs hoog omdat er geen enzymatische spijsvertering is. Verder zorgt het verwijderen van bloedvaten, inclusief de navelstrengslagaders en de ader, ervoor dat er geen besmetting is van cellen van endotheeloorsprong. Met behulp van flowcytometrie zijn uMSCs bij isolatie CD45−CD34−, wat wijst op een afwezigheid van cellen uit de hematopoietische afstamming. Belangrijk is dat ze belangrijke oppervlaktemarkeringen uitdrukken, CD105, CD90 en CD73. Bij het vaststellen van culturen beschrijft dit artikel een efficiënte methode om differentiatie in deze uMSCs in de skeletspierlijn te induceren. Een gedetailleerde analyse van myogene progressie in gedifferentieerde uMSCs onthult dat uMSCs Pax7 uitdrukken, een marker voor myogene voorlopers in de beginfase van differentiatie, gevolgd door de expressie van MyoD en Myf5, en ten slotte een terminale differentiatiemarker, myosine heavy chain (MyHC).
Introduction
De menselijke navelstreng is gecrediteerd om een robuust reservoir van mesenchymale stamcellen te bezitten, die momenteel worden onderzocht voor regeneratieve therapieën vanwege hun robuuste proliferatie- en differentiatiesnelheden, immunomodulerende eigenschappen en het vermogen om cellen te genereren uit alle drie de kiemlagen1. Het navelstrengweefsel bestaat uit meerdere compartimenten zoals het navelstrengbloed, het navelstrengsubendotheel en de Wharton's jelly (WJ), die op zichzelf drie onduidelijke regio's omvat- de perivasculaire zone, de intervasculaire zone en de subamnion of de koordvoering (CL)2. Hoewel uMSC's kunnen worden geïsoleerd van al deze verschillende regio's en in grote lijnen belangrijke MSC-markers kunnen uitdrukken, is er geen duidelijkheid over de vraag of deze compartimenten dezelfde populatie uMSC's bevatten of verschillen vertonen in hun differentiatiepotenties3. Daarom vereisen protocollen voor de isolatie van uMSCs een grotere precisie in hun modus en regio van isolatie, de robuuste karakterisering van differentiatiepotentialen en ten slotte een vergelijkende analyse van verschillende compartimenten van het snoer.
In deze context hebben weinig studies verschillen aangetoond in uMSC proliferatieve en differentiatieve potentialen tussen verschillende delen van het koord. Hiervan onthulden vergelijkende analyses tussen uMSCs geïsoleerd van de CL- en WJ-regio's een groter proliferatief potentieel in CL-afgeleide uMSCs 3,4. In een afzonderlijke studie presteerden WJ-afgeleide uMSCs beter in proliferatietests in vergelijking met perivasculaire cellen (HUCPV)5. Bij het onderzoeken van verschillen tussen van navelstrengbloed afgeleide uMSCs en van navelstrengweefsel afgeleide uMSCs zonder vasculaire besmetting, werd differentiële expressie van belangrijke MSC-markers gemeld tussen de twee compartimenten, evenals verhoogde proliferatiesnelheden in van navelstrengweefsel afgeleide uMSCs6.
Van de verschillende studies die de differentiatiemogelijkheden van uMSCs onderzoeken, voornamelijk in weefsels van de mesoderm-afstamming, zoals osteogene, adipogene en chondrogene afstammingslijnen, hebben er maar heel weinig gedetailleerde protocollen opgeleverd voor myogene differentiatie en daaropvolgende karakterisering, evenals vergelijkende analyses tussen verschillende koordcompartimenten. In deze context hebben we een robuust spierdifferentiatieprotocol ontwikkeld en waargenomen dat van navelstrengweefsel afgeleide uMSCs superieure myogene differentiatiemogelijkheden vertonen in vergelijking met navelstrengbloed6. Hier wordt een stapsgewijs protocol beschreven voor de isolatie van uMSCs van het hele navelstrengweefsel zonder cellen geassocieerd met de vasculatuur, hun karakterisering en hun differentiatie in de myogene afstamming.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het gebruik van navelstrengweefsel in deze studie werd goedgekeurd door de Institutional Committee for Stem Cell Research (IC-SCR), de Institutional Ethics Committee, Translational Health Science and Technology Institute (IEC-THSTI), de Institutional Ethics Committee of Civil Hospital, Gurugram, Haryana en de Institutional Biosafety Committee, THSTI. Menselijke navelstrengweefselmonsters werden geoogst van termijnbevallingen op het moment van geboorte. Geïnformeerde schriftelijke toestemming werd verkregen van proefpersonen. Alle methoden werden uitgevoerd in overeenstemming met de relevante richtlijnen en voorschriften.
1. Isolatie van MSC's uit navelstrengweefsel
- Snijd op het moment van levering ten minste 5 cm koord door, bij voorkeur dichter bij de placenta, en steriliseer het koord door het buitenoppervlak af te vegen met 70% ethanol. Breng het stuk navelstrengweefsel sequentieel over van de ene verzamelbuis van 50 ml met fosfaatbuffered zoutoplossing (PBS) naar een andere buis met dezelfde. Transporteer de verzamelbuis met de naam van de proefpersoon op ijs binnen 1 uur naar het laboratorium.
OPMERKING: Voor een groter onderzoek kan het nuttig zijn om de monsters van een streepjescode te voorzien om hun tracking gedurende het hele onderzoek mogelijk te maken. Belangrijk is dat al het personeel dat menselijke weefsels behandelt, het volledige regime van het hepatitis B-vaccin moet krijgen. - Schakel in het laboratorium de UV gedurende 25 minuten in de BSL-2-kap in om geautoclaveerde instrumenten en pipetten vóór gebruik te steriliseren.
- Breng het navelstrengweefselstuk over van de verzamelbuis naar een metweefselkweek behandelde schaal van 10 cm 2 met PBS verrijkt met 5 g/L glucose, 50 μg/ml gentamicine, 2,5 μg/ml amfotericine B, 100 U/ml penicilline en 100 μg/ml streptomycine (schematisch in figuur 1).
- Snijd met behulp van een scalpel het koordweefsel verticaal langs de lengteas om twee halve cilindrische stukken te verkrijgen. Vanwege koordtorsie en het slijmvliesoppervlak, pint u het weefsel vast met een tang in de andere hand.
- Observeer op dit punt de navelstrengslagaders en ader en verwijder de bloedvaten door een scalpel te gebruiken om ze in één richting van het oppervlak af te schrapen. Spoel het navelstrengweefsel nogmaals in PBS om al het resterende bloed dat geassocieerd is met het weefsel te verwijderen. Zorg ervoor dat het schrapen zacht is om de integriteit van cellen in de WJ rond de vaten te behouden.
- Gehakt elke helft van het koordweefsel in fragmenten van 0,5 cm3 formaat en plaats de fragmenten met het luminale oppervlak naar beneden gericht op de schaal. Incubeer het gerecht kort gedurende 10 minuten in een bevochtigde kamer van 37 °C met 5% CO2.
- Na incubatie overspoelt u de schaal met de stukjes na het navelstrengweefsel met 20 ml medium dat MEM Alpha Modification bevat zonder L-glutamine, ribo- en deoxyribonucleosiden, 15% foetaal runderserum (niet warmte-geïnactiveerd) en 50 μg / ml gentamycine. Voeg het groeimedium voorzichtig langs de zijkanten toe om te voorkomen dat de weefselexplantaten uit hun oriëntatie worden losgemaakt. Voeg overtollig medium toe om rekening te houden met een fractie die tijdens de incubatie door de weefselexplantaten zal worden opgezogen.
- Voeg na 3 dagen incubatie vers medium toe aan de culturen. Zorg ervoor dat de culturen worden beschermd tegen schokken en beweging van de explantaten tijdens het hanteren van de gerechten.
- Verwijder na 1 week de weefselfragmenten afzonderlijk met behulp van een steriele tang en gooi ze weg met geschikte biohazard-zakken voor verwijdering. Behoud het bestaande medium en voeg 10 ml vers groeimedium toe. Vervang het groeimedium om de 4 dagen totdat individuele kolonies een samenvloeiing van 70% bereiken.
OPMERKING: Het is waarschijnlijk dat de cellen niet gelijkmatig over het gerecht worden verdeeld, omdat er individuele proliferatieve kolonies zullen zijn die met de tijd moeten worden gecontroleerd op samenvloeiing. Over het algemeen genereert een schaal van 10 cm2 binnen een maand voldoende cellen om in een aparte schaal te worden gesplitst. - Oogst de aanhangende cellen met behulp van trypsine/EDTA-oplossing (1x 0,25% trypsine en 0,02% EDTA in Hanks Balanced Salt Solution [HBSS]). Centrifugeer de celsuspensie bij 470 × g gedurende 5 minuten bij 25 °C en resuspenseer de celpellet in groeimedium.
2. Immunofenotypering en vermeerdering van uMSCS
- Ga verder met immunofenotypering zodra de aanhangende cellen 50% -60% confluence hebben bereikt en goed verspreid zijn. Voer geen MSC-markeranalyse uit op volledig confluente culturen, omdat dit de neiging heeft om downregulatie van belangrijke MSC-markers te veroorzaken.
- Verdeel na trypsinisatie een celsuspensie van 1 × 106 cellen /ml in FACS-buizen (1 × 105 cellen / buis) en kleur met geschikte fluorofoor-gekoppelde antilichamen (alle 1:50 verdunning) in combinatie: niet-gekleurd; CD105 + CD90; CD105 + CD73; cd105; CD90; cd73; CD34 + CD45 (gewone fluorofoor); isotype controles voor elke fluorofoor. Noteer een totaal aantal gebeurtenissen van ten minste 10.000 op de flowcytometer voor verdere analyse.
OPMERKING: Aangezien de cellen voor elke oppervlaktemarker afzonderlijk worden geanalyseerd, is gating op celsubsets niet vereist. - Bevestig naast de bovenstaande markers de aanwezigheid van positieve en negatieve oppervlaktemarkers in uMSC-lijnen die zijn gemaakt van individuele navelstrengweefselmonsters (tabel 1).
- Analyseer de gelabelde cellen door flowcytometrie en bepaal het percentage CD105+CD90+ en CD105+CD73+ cellen. Analyseer CD105+ en CD34−CD45− cellen afzonderlijk.
3. Differentiatie van uMSCs in skeletspieren
- Coat weefselkweekplaten met 0,01% collageen en 20 μg/ml laminine in PBS. Bekleed deze platen minimaal 4 uur bij kamertemperatuur.
- Plaat uMSCs met een dichtheid van 10.000 cellen/cm2 in groeimedium.
- Wanneer de cellen voor 70% samenvloeien, adem dan het groeimedium op en spoel de culturen 2x met PBS. Voeg myogeen differentiatiemedium (M1) bestaande uit DMEM + 5% paardenserum + 0,1 μM dexamethason + 50 μM hydrocortison toe aan de uMSCs. Voor het bepalen van de kinetiek van myogene progressie, voeg M1 medium om de andere dag toe aan de culturen.
- Om de kinetiek van myogene progressie te bepalen, analyseert u uMSCs voor Pax7, MyoD, Myogenin en MyHC-expressie na respectievelijk 2 dagen, 4-5 dagen, 6-7 dagen en 10-14 dagen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het succes van isolatie van uMSCs uit navelstrengweefsel is >95%, in tegenstelling tot de slechte succespercentages van vol navelstrengbloed. Na succesvolle isolatie van uMSCs onthult FACS-analyse dat alle cellen CD34−CD45−CD105+CD90+ zijn. In vergelijkende analyse vertonen uMSCs geïsoleerd uit navelstrengbloed echter heterogene populaties, waarbij een deel van de cellen CD34 + CD45 + CD105 + (~ 15%) vertoont. Bovendien zijn dubbel-positieve CD105 + CD90 + minder in aantal (~ 5%) (aanvullende figuur S1). Dit resulteert in verminderde niveaus van myogene differentiatie tussen uMSCs van navelstrengbloed, omdat zowel CD105- als CD90-expressie nodig zijn voor de inductie van myogenese. uMSCs geven ook de expressie van de markeringen in tabel 1 weer. Als er besmetting is van de navelstrengbloed-afgeleide uMSCs, zal er ook een aanwezigheid zijn van CD34 + CD45 + -cellen. Dit resulteert in valse celtellingen voor plating voor myogene differentiatie. Een indicatie dat >90% van de cellen dubbel positief zijn voor CD105- en CD90-expressie is dat de uMSCs zich niet hebben gecommitteerd aan een mesodermale afstamming en multipotent blijven, omdat zowel CD105- als CD90-expressie worden gedownreguleerd bij differentiatie. Het is noodzakelijk om meerdere markers te gebruiken voor de bevestiging van uMSC-fenotypen, omdat er geen enkele definitieve uMSC-marker is. In deze analyse evalueerden we de aanwezigheid van alle markers in tabel 1 voor elk van de uMSC-lijnen die in het laboratorium zijn vastgesteld. Daarnaast hebben we de dubbelpositieve status van CD105 en CD90 (figuur 2A) en van CD105 en CD73 (figuur 2B) bepaald, zodat de uMSCs meerdere sleutelmarkers uitdrukken. Dit is nodig om besmetting van enkel-positieve cellen te voorkomen die aanwezig zijn in aantallen van minder dan 0,05%.
Figuur 1: Schematische weergave van de stapsgewijze isolatie en karakterisering van uMSCs uit navelstrengweefsel. Afkorting: uMSCs = mesenchymale stamcellen uit menselijk navelstrengweefsel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: MSC-markeranalyse in van navelstrengweefsel afgeleide uMSCs. (A) uMSCs tonen de expressie van CD105 en CD90 en drukken geen hematopoëtische markers uit, CD34 en CD45. Representatieve FACS-plots van drie uMSC-lijnen (UCT15, UCT18 en UCT26) worden weergegeven (N = 16). Bovenste rij panelen toont cellen in alle drie de uMSC-lijnen in het Q2-kwadrant positief voor CD105- en CD90-expressie. Onderste rij met panelen toont cellen in het Q1-kwadrant positief voor CD105-expressie en negatief voor CD34- en CD45-expressie. (B) uMSCs geven de expressie van MSC-marker, CD73 (N = 16) weer. Afkorting: uMSCs = mesenchymale stamcellen uit menselijk navelstrengweefsel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| uMSC positieve markers | uMSC negatieve markers |
| cd105 | cd34 |
| cd90 | cd45 |
| cd73 | cd106 |
| cd29 | HLA DR |
| cd44 | cd31 |
| HLA ABC | cd14 |
| CD49e | CD49e |
| cd54 | |
| cd13 |
Tabel 1: Lijst van positieve en negatieve markers voor uMSCs. Afkorting: uMSCs = mesenchymale stamcellen uit menselijk navelstrengweefsel.
Voor de differentiatie van uMSCs in de myogene afstamming brengen uMSCs doorgaans Pax7 tot expressie, een marker voor voorlopercellen binnen de eerste 2 dagen na de toevoeging van M1, gevolgd door MyoD binnen de eerste 4 dagen van M1-toevoeging (figuur 3). Na 6 dagen differentiatie brengen cellen Myogenine-eiwit tot expressie, gevolgd door de expressie van Myosine zware keten (MyHC) tussen 10 dagen en 14 dagen na de inductie van differentiatie. We hebben in meer detail de kinetiek van myogene expressie gekarakteriseerd met behulp van RNA-sequencing, flowcytometrie, immunocytochemie, RT-PCR en western blot-analyse om de fasegewijze expressie van myogene markers te documenteren, wat de robuustheid van dit protocol bevestigt. Transcriptomische sequencing van het hele genoom tussen ongedifferentieerde uMSCs en uMSCs die werden gedifferentieerd in skeletspieren onthulde de upregulatie van 907 genen als reactie op de inductie van myogene differentiatie (figuur 4).
Figuur 3: Differentiatie van uMSCs in skeletspieren. uMSCs werden gekweekt in M1 medium gedurende 2 dagen, 4 dagen, 7 dagen en 10 dagen en beoordeeld op (A) Pax7 na 2 dagen, (B) MyoD na 4 dagen, (C) Myogenine expressie van verschillende uMSC lijnen, aangeduid met T8, T12, T14 en T25 na 7 dagen, en (D) MyHC na 10 dagen. Schaalstaven = (B, D) 50 μm. Afkortingen: uMSCs = mesenchymale stamcellen uit menselijk navelstrengweefsel; GAPDH = glyceraldehyde 3-fosfaatdehydrogenase; MyoD = myoblastbepalingseiwit 1; MyHC = myosine zware keten; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindool; Mb = myoblast; MT = myotube. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Vergelijkende transcriptomische profilering van uMSCs afgeleid van navelstrengbloed en navelstrengweefsel gedifferentieerd in skeletspieren. Heatmap van genormaliseerde tellingen van 907 genen tussen controle uMSCs en uMSCs gedifferentieerd in skeletspieren gedurende 7 dagen uit navelstrengbloed en navelstrengweefsel. Venn-diagram (links) toont een groter aantal myogene genen die zijn geupreguleerd in van navelstrengweefsel afgeleide uMSCs in vergelijking met van navelstrengbloed afgeleide uMSCs. Onderstaande tabel toont de gemeenschappelijke myogene genen die upreguleren in zowel navelstrengweefsel als navelstrengbloed. Dit cijfer is van Mishra et al.6. Afkortingen: 1, 2 = biologische replicaties; CB1,2 = myogene cellen afgeleid van uMSCs van navelstrengbloed; CT1, 2 = myogene cellen afgeleid van uMSCs van navelstrengweefsel; coB1,2 = controle van ongedifferentieerde uMSCs uit navelstrengbloed; coT1, 2 = controle van ongedifferentieerde uMSCs uit navelstrengweefsel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Voor het uitvoeren van een vergelijkende analyse vergeleken we uMSCs geïsoleerd uit navelstrengbloed en navelstrengweefsel. RNA-sequencinggegevens onthulden dat er meer myogene genen waren die werden geupreguleerd in uMSC's van van navelstrengweefsel afgeleide myogene cellen dan van die afgeleid van navelstrengbloed (figuur 4). De RNA-sequencinggegevens die ter ondersteuning van deze studie worden gebruikt, worden geüpload naar NCBI (SRA-toetreding is GSE147114). In het kort identificeerde weefselspecifieke transcriptomische analyse met behulp van de PANTHER GO-slim-database cytoskeletale eiwitten geassocieerd met actinebinding en sarcomeerassemblage (TPM2, LDB3, PDLIM3, FHL1, NEXN, MYOM1) transporters geassocieerd met contractiele functie (RTN2, SLC19A2, ACHE, SCN1B, SLC19A2, JPH2, KCNJ12, ANKRD1), onderhoud van spiermassa ( FBXO32, TRIM16L, GHR), calciumsignalering (FKBP5) en enzymatische functie (COX7A1, PDK4) (figuur 4). Al met al tonen deze gegevens aan dat van navelstrengweefsel afgeleide uMSCs een compartiment vertegenwoordigen dat een robuust myogeen potentieel vertoont.
Vanwege individuele variatie tussen uMSC-lijnen die kunnen voortvloeien uit efficiëntie in isolatie, heterogeniteit binnen het uMSC-compartiment, de leeftijd van de moeder en de gezondheidsstatus van de moeder, inclusief haar nutriëntenniveaus, kunnen er verschillen zijn in proliferatiesnelheden en myogene potentialen tussen gevestigde uMSC-lijnen. Ondanks verschillen in de kinetiek van expressie, wordt de algemene trend van toenemende myogeniteit met de fasegewijze expressie van myogene markers echter gehandhaafd.
Aanvullende figuur S1: MSC-markeranalyse in van navelstrengbloed afgeleide uMSCs. uMSCs tonen de expressie van CD105 en hematopoietische markers, CD34 en CD45. Analyse van de CD105+ populatie laat zien dat slechts een klein deel van deze cellen CO-express CD90 (N = 5). Afkorting: uMSCs = mesenchymale stamcellen uit menselijk navelstrengweefsel. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritieke stappen
Een cruciale stap in dit protocol is het verzamelen van weefsel onder aseptische omstandigheden, vanaf het moment van levering tot het onderhoud van steriele culturen, voor de gehele duur van de vermeerdering. Tijdens het verzamelen van het snoer is het essentieel dat het snoer geen niet-gesteriliseerd oppervlak raakt en extern wordt afgeveegd met 70% ethanol voordat het wordt verzameld in buizen met PBS aangevuld met antibiotica. Het is belangrijk om de tijd tussen het verzamelen van de navelstreng en de verwerking van het weefsel voor uMSC-isolatie te beperken. In het geval dat het nodig is om weefsel van de plaats van verzameling naar het laboratorium te transporteren, moet ervoor worden gezorgd dat het weefsel in antibioticabevattende buffers wordt gehouden en op ijs wordt opgeslagen.
Wijzigingen en probleemoplossing van de methode
De belangrijkste wijziging in dit protocol om myogene differentiatie van uMSCs te induceren, is de coating van gerechten met 0,01% type 1 collageen en 20 μg / ml laminine. We zagen dat myogene progressie in uMSCs in aanwezigheid van M1-medium wordt versterkt wanneer de adhesieomstandigheden ook worden gemoduleerd. Of het gebruik van andere superieure, zij het dure, matrices zoals Matrigel dit protocol verder kan verbeteren, moet worden getest. Variaties in opbrengst tussen individuele monsters kunnen ertoe leiden dat sommige weefsels een lager aantal cellen genereren. In dergelijke gevallen kan het de voorkeur hebben om een grotere lengte van het navelstrengweefsel te verzamelen dat >5 cm is. In deze context hebben weinig rapporten 10 cm navelstrengweefsel gebruikt om de opbrengst van uMSCs te verhogen. De meerderheid van de rapporten die de isolatie van uMSCs uit navelstrengweefsel beschrijven, hebben gebruik gemaakt van extracellulaire matrix-afbrekende enzymen voor de verhoogde afgifte van cellen uit het koordstroma 3,5,7,8. Het gebruik van explantculturen door een paar studies, waaronder dit rapport, heeft voortdurend een verhoogde cellulaire levensvatbaarheid aangetoond en levert 6,9,10 op. Bovendien verhoogt de afwezigheid van de noodzaak om celsortering uit te voeren om celpopulaties te zuiveren, wat vaak wordt opgenomen in het zuiveren van uMSCs uit navelstrengbloed, het cellulaire aantal en de integriteit.
Beperkingen van de methode
Een belangrijke beperking van de methode is de tijd die nodig is voor het volledig opzetten van uMSC-lijnen uit individuele navelstrengweefselmonsters. Doorgaans zijn 3 weken nodig om elke uMSC-lijn te genereren met behulp van dit protocol. Hierna zijn 2 weken nodig voor volledige myogene differentiatie. Deze verlengde duur van het onderzoek kan omslachtig zijn in grote cohorten die de differentiatiepotentialen van uMSCs van verschillende deelnemers onderzoeken, met de bedoeling informatie te verkrijgen over het intra-uteriene milieu of om metabole parameters van nakomelingenorganen zoals lichaamssamenstelling te voorspellen. Een tweede beperking is de heterogeniteit binnen de navelstrengweefselmatrix, die intrinsieke fenotypische verschillen tussen de verschillende uMSC-compartimenten zou kunnen hebben en die verantwoordelijk zou kunnen zijn voor differentiatiepotentialen tussen de verschillende bronnen. UMSC's van de WJ vertonen bijvoorbeeld een lager osteogeen potentieel in vergelijking met CL-afgeleide uMSCs11. Daarom beschrijft deze methode niet de verschillen die inherent zijn aan verschillende compartimenten in het navelstrengweefsel zelf.
Betekenis van de methode ten opzichte van bestaande methoden
Met behulp van dit protocol zijn we in staat om een celgetal van 1 × 104 tot 1 × 106 uMSCs te verkrijgen uit individuele navelstrengweefselmonsters. Deze uMSC-lijnen kunnen betrouwbaar worden gebruikt voor assays voor ten minste 6-8 passages. Ondanks de mate van variatie in cellulaire fenotypen die typerend zijn voor menselijke populaties, was de gemiddelde verdubbelingstijd van uMSCs waargenomen in ons cohort van 15 vrouwen uit Noord-India minder dan 2 dagen6. Een analyse van hun proliferatieve snelheden met behulp van de opname van 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) toonde aan dat ten minste 80% van de cellen de S-fase had doorlopen in een periode van 6 h6. Bovendien vertonen uMSCs uit navelstrengweefsel ook lage senescentiesnelheden, wat wijst op de robuustheid van deze isolatiemethode6. We vergeleken eerder de mate van myogene inductie in uMSCs met behulp van dit protocol met degene die wordt gebruikt om myogenese te induceren in menselijke en muriene pluripotentiële stamcellen 6,12. We ontdekten dat dit protocol een krachtigere inductor van myogene differentiatie is dan bestaande protocollen.
Belang van de methode en toepassingen
Succesvolle cellulaire en regeneratieve therapieën zijn afhankelijk van cellulaire levensvatbaarheid en opbrengst, waarvoor grote aantallen cellen uit vroege passages nodig zijn. Deze methode biedt dus een handig alternatief voor klinische toepassingen. Het robuuste myogene differentiatieprotocol in dit rapport en de diepgaande moleculaire karakterisering van myogene progressie met behulp van dit protocol in ons werk vormen een aanvulling op de inspanningen om foetale myogenese te recapituleren en kunnen worden gebruikt als een model om de intra-uteriene omgeving na te bootsen en het postnatale metabolisme te weerspiegelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.
Acknowledgments
We bedanken de heer Ojas Tikoo voor hun hulp bij het filmen en videoproductie. We erkennen ook de hulp die is ontvangen van het GARBH-Ini (Interdisciplinary Group on Advanced Research and Birth Outcome-DBT India) personeel, verpleegkundigen en senior onderzoeksfunctionarissen in het Gurugram Civil Hospital en Dr. Pallavi Kshetrapal voor hulp bij logistiek. Dit werk werd ondersteund door subsidies toegekend aan Suchitra Gopinath van het Department of Biotechnology, India (BT/09/IYBA/2015; BT/PR29599/PFN/20/1393/2018).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2411 | |
| Antibiotic solution 100x Liquid, endotoxin tested (10,000 U Penicillin and 10 mg Streptomycin/mL in 0.9% normal saline) | HiMedia | A001A-50mL | |
| Anti-GAPDH antibody | Sigma Aldrich | G8795 | |
| Anti-MyHC antibody (My32) | Novus Biologicals | NBP2-50401AF647 | |
| Anti-MyoD antibody (5.8A) | Novus Biologicals | NB100-56511 | |
| Anti-Myogenin antibody (Clone F5D) | Novus Biologicals | NBP2-34616AF594 | |
| Anti-Pax7 antibody | DSHB | DSHB-C1-576 | |
| APC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 | BD Biosciences | 559869 | |
| Collagen Type 1 | Merck | C8919 | |
| D (+) Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Dexamethasone | SIGMA | D4902 | |
| FACSCanto II or FACSAria III | BD Biosciences | ||
| Fetal Bovine Serum, qualified Brazil | GIBCO | 10270106 | not to be heat-inactivated |
| FITC Mouse anti-human CD106 clone 51-10C9 | BD Biosciences | 551146 | |
| FITC Mouse anti-human CD14 clone M5E2 | BD Biosciences | 557153 | |
| FITC Mouse anti-human CD31 clone WM59 | BD Biosciences | 557508 | |
| FITC Mouse anti-human CD34 clone 581 | BD Biosciences | 555821 | |
| FITC Mouse anti-human CD45 clone HI30 | BD Biosciences | 555482 | |
| FITC Mouse anti-human CD49D clone 9F10 | BD Biosciences | 560840 | |
| FITC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 | BD Biosciences | 555595 | |
| FITC Mouse anti-human HLA-A,B,C clone G46-2.6 | BD Biosciences | 557348 | |
| FITC Mouse anti-human IgG clone G18-145 | BD Biosciences | 555786 | |
| FlowJo software | BD Biosciences | ||
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1264 | |
| Horse serum | HiMedia | RM1239 | |
| Hydrocortisone | Merck | H4001 | |
| Laminin | Merck | L2020 | |
| MEM Alpha Modification without L-glutamine, ribo- and deoxyribonucleosides | Hyclone | SH30568.FS | Basal medium for uMSCs |
| PE Mouse anti-human CD105 clone 266 | BD Biosciences | 560839 | |
| PE Mouse anti-human CD44 clone 515 | BD Biosciences | 550989 | |
| PE Mouse anti-human CD49E clone llA1 | BD Biosciences | 555617 | |
| PE Mouse anti-human IgG clone G18-145 | BD Biosciences | 555787 | |
| PE-Cy7 Mouse anti-human CD73 CLONE AD2 | BD Biosciences | 561258 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH=7.4 | HiMedia | M1866 | |
| Trypsin/EDTA solution (1x 0.25% Trypsin and 0.02% EDTA in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | HiMedia | TCL049-100mL |
References
- Kuroda, Y., et al. Unique multipotent cells in adult human mesenchymal cell populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (19), 8639-8643 (2010).
- Troyer, D. L., Weiss, M. L. Wharton's jelly-derived cells are a primitive stromal cell population. Stem Cells. 26 (3), 591-599 (2008).
- Karahuseyinoglu, S., et al. Biology of stem cells in human umbilical cord stroma: In situ and in vitro surveys. Stem Cells. 25 (2), 319-331 (2007).
- Kita, K., Gauglitz, G. G., Phan, T. T., Herndon, D. N., Jeschke, M. G. Isolation and characterization of mesenchymal stem cells from the sub-amniotic human umbilical cord lining membrane. Stem Cells and Development. 19 (4), 491-502 (2010).
- Sarugaser, R., Lickorish, D., Baksh, D., Hosseini, M. M., Davies, J. E. Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: A source of mesenchymal progenitors. Stem Cells. 23 (2), 220-229 (2005).
- Mishra, S., et al. Umbilical cord tissue is a robust source for mesenchymal stem cells with enhanced myogenic differentiation potential compared to cord blood. Scientific Reports. 10 (1), 18978 (2020).
- Lu, L. L., et al. Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials. Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).
- Seshareddy, K., Troyer, D., Weiss, M. L. Method to isolate mesenchymal-like cells from Wharton's Jelly of umbilical cord. Methods in Cell Biology. 86, 101-119 (2008).
- Sotiropoulou, P. A., Perez, S. A., Salagianni, M., Baxevanis, C. N., Papamichail, M. Characterization of the optimal culture conditions for clinical scale production of human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 24 (2), 462-471 (2006).
- Yoon, J. H., et al. Comparison of explant-derived and enzymatic digestion-derived MSCs and the growth factors from Wharton's jelly. BioMed Research International. 2013, 428726 (2013).
- Ishige, I., et al. Comparison of mesenchymal stem cells derived from arterial, venous, and Wharton's jelly explants of human umbilical cord. International Journal of Hematology. 90 (2), 261-269 (2009).
- Chal, J., et al. Differentiation of pluripotent stem cells to muscle fiber to model Duchenne muscular dystrophy. Nature Biotechnology. 33 (9), 962-969 (2015).
